SMAD1基因对黔北麻羊卵巢颗粒细胞的影响及组织表达分析

旨在验证SMAD1基因在转录组测序中单羔组对多羔组上调的结果,并探究SMAD1基因对黔北麻羊产羔性状的影响。本试验选取健康、体重45 kg、4岁左右的单、多羔黔北麻羊母羊为研究对象,采用qRT-PCR法检测SMAD1基因在单、多羔组黔北麻羊母羊子宫、输卵管、垂体、下丘脑及卵巢组织的表达水平,PCR扩增黔北麻羊SMAD1基因CDS区,构建pEGFP-N3-SAMD1重组质粒,利用脂质体转染法转染pEGFP-N3-SAMD1重组质粒进入卵巢颗粒细胞,分为超表达SMAD1试验组和pEGFP-N3空载体对照组,通过检测培养基中雌二醇和孕酮的浓度,利用CCK-8法和Annexin V-FITC法检测超表达SMAD1基因对卵巢颗粒细胞增殖、凋亡的影响,qRT-PCR检测超表达SMAD1基因对SAMD1、GnRHR、FSHR、BMP4、TIMP3基因mRNA表达的影响,来探究SMAD1基因对卵巢颗粒细胞的影响。结果表明,SMAD1基因在黔北麻羊各组织中均有表达。组间比较可知,卵巢和下丘脑组织单羔组极显著高表达于多羔组（P<0.01）,输卵管组织中单羔组显著高表达于多羔组（P<0.05）,其他组织未达到差异显著性（P>0.05）。本研究成功克隆了SMAD1基因CDS序列,未发现突变位点,并将pEGFP-N3-SAMD1重组质粒转染进入卵巢颗粒细胞,转染试验组培养基中E2含量在12、48 h显著高于对照组（P<0.05）,P4含量在12 h显著高于对照组（P<0.05）;超表达SMAD1基因对细胞增殖在24 h达到显著促进作用（P<0.05）,48、72 h达到极显著促进作用（P<0.01）,并且发现超表达SMAD1基因对卵巢颗粒细胞的凋亡具有抑制作用,与SMAD1基因对卵巢颗粒细胞增殖具有促进的结果是相符的。SMAD1基因超表达后繁殖相关基因GnRHR、FSHR、BMP4、TIMP3 mRNA的表达极显著降低（P<0.01）。综上表明,SMAD1基因超表达可提高E2、P4的生成,有助于黔北麻羊发情及妊娠的维持,促进细胞增殖,抑制细胞凋亡,也极显著抑制繁殖相关基因mRNA的表达,而这些繁殖相关基因都能够调控卵泡数、卵泡的发育与形成以及排卵。因此,SMAD1基因能够抑制这些基因的表达,致使黔北麻羊单羔组受胎率低,进而降低产羔数,这为产羔性状相关基因的研究提供了理论基础,初步认为SMAD1基因可作为探究影响山羊产羔性状的候选基因。     

黔北麻羊SRD5A2基因干扰载体构建及其对产羔相关基因表达的影响

旨在探究SRD5A2基因对山羊产羔性状相关基因表达的影响。本研究选择健康的（2~3岁）黔北麻羊经产母羊3只,体重约32 kg,采集卵巢组织并成功培养卵巢颗粒细胞。通过在线软件设计SRD5A2基因的4对siRNA干扰序列和1对阴性对照序列,连接pGPH1/GFP/Neo载体后,将构建成功的干扰载体转染至黔北麻羊卵巢颗粒细胞。利用qRT-PCR方法筛选出干扰效率最佳的载体,检测其对SRD5A2基因表达的影响。运用qRT-PCR检测沉默SRD5A2基因对山羊产羔性状相关基因骨形态发生蛋白15（BMP15）、生长分化因子9（GDF9）、骨形态发生蛋白1B（BMPR-1B）和卵泡刺激素β亚基（FSHβ）表达的影响。结果表明,本试验在培养黔北麻羊卵巢颗粒细胞的基础上,成功构建了黔北麻羊SRD5A2基因的干扰载体,并筛选出shRNA-SRD5A2-1干扰效果最佳（P<0.01）;抑制SRD5A2基因表达后,qRT-PCR检测产羔性状相关基因BMP15、BMPR-1B、GDF9和FSHβ的表达量均显著降低,BMP15的表达量极显著低于shRNA-NC对照组（P<0.01）,BMPR-1B、GDF9和FSHβ的表达量显著低于shRNA-NC对照组（P<0.05）。本研究成功构建了SRD5A2基因干扰载体并转染至卵巢颗粒细胞,发现体外沉默SRD5A2基因可抑制产羔性状相关基因的表达,提示SRD5A2基因与黔北麻羊产羔性状密切相关,本试验结果为进一步研究SRD5A2基因对黔北麻羊产羔性状的调控机制提供了基础。     

黔北麻羊RARRES1基因的克隆表达及功能初步研究

旨在对黔北麻羊视黄酸受体应答蛋白1（retinoic acid receptor responder 1,RARRES1）基因的功能进行初步探究。本研究首先利用PCR扩增克隆得到黔北麻羊RARRES1基因编码的完整序列,应用生物信息学方法分析黔北麻羊RARRES1蛋白理化性质、高级结构、疏水性、氨基酸同源性及亚细胞定位,并构建系统进化树,同时应用qRT-PCR法检测RARRES1基因在单、多羔黔北麻羊不同组织中的表达水平,随后构建目的基因pEGFP-N3-RARRES1真核表达载体与pGPH1/GFP/Neo-RARRES1 RNA干扰载体,并转染至黔北麻羊卵泡颗粒细胞,利用qRT-PCR法从细胞水平检测并分析目的基因真核表达载体与RNA干扰载体对目的基因RARRES1及多胎性状候选基因BMPR-IB mRNA表达的影响。qRT-PCR结果显示,RARRES1 mRNA在卵巢中的表达量最高,单羔组黔北麻羊卵巢组织中的表达量极显著高于多羔组（P<0.01）。生物信息学分析表明,黔北麻羊RARRES1基因共编码289个氨基酸,RARRES1是一种定位在细胞质中的亲水性蛋白,蛋白质二级结构分析显示,其主要是由α-螺旋与无规则卷曲构成,三级结构预测与二级结构分析一致;同源性以及系统进化树结果显示,黔北麻羊RARRES1基因序列与绵羊、牛的同源性高、遗传距离近,与鸡的同源性最低、遗传距离最远。经双酶切、测序验证后,表明目的基因pEGFP-N3-RARRES1真核表达载体与pGPH1/GFP/Neo-RARRES1干扰载体构建成功。将各载体转染至黔北麻羊卵泡颗粒细胞后,与空白对照相比,重组质粒pEGFP-N3-RARRES1能极显著提高RARRES1与BMPR-IB的表达量（P<0.01）。在各干扰载体中,重组质粒pGPH1/GFP/Neo-RARRES1-4的抑制效率最好,能够显著与极显著下调RARRES1与BMPR-IB mRNA在卵泡颗粒细胞中的表达量（P<0.05,P<0.01）。本研究克隆了黔北麻羊RARRES1基因编码的完整序列并进行了生物信息学分析。将重组质粒pEGFP-N3-RARRES1、pGPH1/GFP/Neo-RARRES1成功转染至黔北麻羊卵泡颗粒细胞并验证其表达变化。结果表明,RARRES1可能对山羊多胎性状具有促进作用,为进一步探究RARRES1基因对山羊多胎性状的调控机理提供依据。     

CD81、CCL26基因在黔北麻羊不同性腺组织中的表达研究

CD81和CCL26基因是影响哺乳动物性腺细胞融合的重要因子,但其在黔北麻羊性腺组织中的表达情况尚不清楚。为研究CD81和CCL26基因在黔北麻羊不同组织中的表达量,本实验以单、多羔黔北麻羊为研究对象,提取下丘脑、垂体、子宫、输卵管、卵巢组织的RNA,并将5种性腺组织RNA逆转录合成第一链cDNA,随后采用q-PCR技术检测CD81、CCL26基因的mRNA在单、多羔黔北麻羊不同性腺组织中的表达水平。结果表明:黔北麻羊性腺组织中CD81、CCL26基因的mRNA均有表达,2种基因均在单、多羔卵巢中的表达量最高;CD81基因在单羔组子宫中的表达量最低;CD81基因在多羔组、CCL26基因在单多羔组下丘脑中的表达量均最低;组间差异表达量分析可知,CD81基因在多羔组子宫的表达量显著高于单羔组;CCL26基因在单羔组卵巢和输卵管的表达量显著高于多羔组,在单羔组子宫的表达量极显著高于多羔组。本实验结果提示,CD81和CCL26基因可能与山羊繁殖能力相关,也为初步揭示山羊繁殖的分子调控机制提供了参考依据。     

GDF9、BMP15基因在单、多羔黔北麻羊不同组织中的表达研究

为探讨GDF9基因和BMP15基因在单、多羔黔北麻羊性腺轴组织中的mRNA相对表达规律,本实验选取产单羔和多羔的经产母羊各3只,通过qPCR法对GDF9基因和BMP15基因在单、多羔黔北麻羊性腺组织中的相对表达水平进行检测。结果表明：GDF9、BMP15基因mRNA在单、多羔黔北麻羊5个性腺组织中均有不同程度的表达。由组间比较可知,多羔组的GDF9基因在垂体相对表达量极显著高于单羔组,在输卵管中单羔组的相对表达量显著高于多羔组,其他组织之间差异不显著;BMP15基因在输卵管中的表达量呈现为单羔组极显著高于多羔组,在子宫中呈现为单羔组显著高于多羔组,其余组织之间差异不显著。本实验结果表明GDF9基因和BMP15基因在黔北麻羊的单羔组和多羔组性腺轴组织之间的表达趋势大体一致,在卵巢中最高,在子宫中最低,说明2个基因对黔北麻羊的繁殖性能有重要作用。本研究结果可为今后深入探究GDF9基因和BMP15基因对山羊的繁殖机理提供理论依据。     

SMAD1基因对黔北麻羊卵巢颗粒细胞的影响及组织表达分析

旨在验证SMAD1基因在转录组测序中单羔组对多羔组上调的结果,并探究SMAD1基因对黔北麻羊产羔性状的影响。本试验选取健康、体重45 kg、4岁左右的单、多羔黔北麻羊母羊为研究对象,采用qRT-PCR法检测SMAD1基因在单、多羔组黔北麻羊母羊子宫、输卵管、垂体、下丘脑及卵巢组织的表达水平,PCR扩增黔北麻羊SMAD1基因CDS区,构建pEGFP-N3-SAMD1重组质粒,利用脂质体转染法转染pEGFP-N3-SAMD1重组质粒进入卵巢颗粒细胞,分为超表达SMAD1试验组和pEGFP-N3空载体对照组,通过检测培养基中雌二醇和孕酮的浓度,利用CCK-8法和Annexin V-FITC法检测超表达SMAD1基因对卵巢颗粒细胞增殖、凋亡的影响,qRT-PCR检测超表达SMAD1基因对SAMD1、GnRHR、FSHR、BMP4、TIMP3基因mRNA表达的影响,来探究SMAD1基因对卵巢颗粒细胞的影响。结果表明,SMAD1基因在黔北麻羊各组织中均有表达。组间比较可知,卵巢和下丘脑组织单羔组极显著高表达于多羔组(P0.01),输卵管组织中单羔组显著高表达于多羔组(P0.05),其他组织未达到差异显著性(P0.05)。本研究成功克隆了SMAD1基因CDS序列,未发现突变位点,并将pEGFP-N3-SAMD1重组质粒转染进入卵巢颗粒细胞,转染试验组培养基中E2含量在12、48 h显著高于对照组(P0.05),P4含量在12 h显著高于对照组(P0.05);超表达SMAD1基因对细胞增殖在24 h达到显著促进作用(P0.05),48、72 h达到极显著促进作用(P0.01),并且发现超表达SMAD1基因对卵巢颗粒细胞的凋亡具有抑制作用,与SMAD1基因对卵巢颗粒细胞增殖具有促进的结果是相符的。SMAD1基因超表达后繁殖相关基因GnRHR、FSHR、BMP4、TIMP3 mRNA的表达极显著降低(P0.01)。综上表明,SMAD1基因超表达可提高E2、P4的生成,有助于黔北麻羊发情及妊娠的维持,促进细胞增殖,抑制细胞凋亡,也极显著抑制繁殖相关基因mRNA的表达,而这些繁殖相关基因都能够调控卵泡数、卵泡的发育与形成以及排卵。因此,SMAD1基因能够抑制这些基因的表达,致使黔北麻羊单羔组受胎率低,进而降低产羔数,这为产羔性状相关基因的研究提供了理论基础,初步认为SMAD1基因可作为探究影响山羊产羔性状的候选基因。     

黔北麻羊RARRES1基因的克隆表达及功能初步研究

旨在对黔北麻羊视黄酸受体应答蛋白1(retinoic acid receptor responder 1,RARRES1)基因的功能进行初步探究。本研究首先利用PCR扩增克隆得到黔北麻羊RARRES1基因编码的完整序列,应用生物信息学方法分析黔北麻羊RARRES1蛋白理化性质、高级结构、疏水性、氨基酸同源性及亚细胞定位,并构建系统进化树,同时应用qRT-PCR法检测RARRES1基因在单、多羔黔北麻羊不同组织中的表达水平,随后构建目的基因pEGFP-N3-RARRES1真核表达载体与pGPH1/GFP/Neo-RARRES1 RNA干扰载体,并转染至黔北麻羊卵泡颗粒细胞,利用qRT-PCR法从细胞水平检测并分析目的基因真核表达载体与RNA干扰载体对目的基因RARRES1及多胎性状候选基因BMPR-IB mRNA表达的影响。qRT-PCR结果显示,RARRES1 mRNA在卵巢中的表达量最高,单羔组黔北麻羊卵巢组织中的表达量极显著高于多羔组(P0.01)。生物信息学分析表明,黔北麻羊RARRES1基因共编码289个氨基酸,RARRES1是一种定位在细胞质中的亲水性蛋白,蛋白质二级结构分析显示,其主要是由α-螺旋与无规则卷曲构成,三级结构预测与二级结构分析一致;同源性以及系统进化树结果显示,黔北麻羊RARRES1基因序列与绵羊、牛的同源性高、遗传距离近,与鸡的同源性最低、遗传距离最远。经双酶切、测序验证后,表明目的基因pEGFP-N3-RARRES1真核表达载体与pGPH1/GFP/Neo-RARRES1干扰载体构建成功。将各载体转染至黔北麻羊卵泡颗粒细胞后,与空白对照相比,重组质粒pEGFP-N3-RARRES1能极显著提高RARRES1与BMPR-IB的表达量(P0.01)。在各干扰载体中,重组质粒pGPH1/GFP/Neo-RARRES1-4的抑制效率最好,能够显著与极显著下调RARRES1与BMPR-IB mRNA在卵泡颗粒细胞中的表达量(P0.05,P0.01)。本研究克隆了黔北麻羊RARRES1基因编码的完整序列并进行了生物信息学分析。将重组质粒pEGFP-N3-RARRES1、pGPH1/GFP/Neo-RARRES1成功转染至黔北麻羊卵泡颗粒细胞并验证其表达变化。结果表明,RARRES1可能对山羊多胎性状具有促进作用,为进一步探究RARRES1基因对山羊多胎性状的调控机理提供依据。     

CTSD对黔北麻羊卵泡颗粒细胞的调控机制及功能分析

旨在分析组织蛋白酶D（cathepsin D, CTSD）对黔北麻羊卵泡颗粒细胞的调控机制并初步探究其对产羔性状的影响机理。本研究以36周龄、健康、多胎黔北麻羊母羊（n=5）为研究对象,屠宰后采集卵巢组织分离培养卵泡颗粒细胞,构建真核表达载体pEGFP-N3-CTSD,将其导入细胞后在转录与翻译水平验证真核表达效率;通过CCK-8法检测在不同时间段内重组质粒对颗粒细胞增殖的影响;通过流式细胞仪检测重组质粒对颗粒细胞凋亡及周期的影响;随后使用RT-qPCR法在细胞水平检测重组质粒对细胞凋亡相关基因Bcl-2、Bax、Caspase-3,细胞周期相关因子Cyclin A1、Cyclin D2、Cyclin E mRNA表达水平的影响,最后,以多胎性状候选基因BMPR-IB、FSHR、INHA为功能基因,在转录与翻译水平上验证重组质粒对其mRNA与蛋白表达的影响。双酶切及测序结果证实,黔北麻羊CTSD基因真核表达载体pEGFP-N3-CTSD构建成功,且在转录与翻译水平极显著上调CTSD在颗粒细胞中的表达（P<0.01）;细胞增殖检测结果表明,颗粒细胞中上调CTSD后能够抑制细胞的增殖,其中在12、24、48、72 h对细胞增殖的抑制效率达到极显著（P<0.01）;细胞凋亡检测结果表明,CTSD的过表达能够极显著促进颗粒细胞的凋亡（P<0.01）,且能够显著下调细胞抗凋亡基因Bcl-2的表达（P<0.05）,极显著上调细胞促凋亡相关基因Bax、Caspase-3的表达（P<0.01）;此外,细胞周期检测发现,pEGFP-N3-CTSD在转染后能够极显著上调G0/G1期与G2/M期的细胞数量（P<0.01）,极显著下调S期细胞数量（P<0.01）,同时能够极显著提高细胞周期相关因子Cyclin A1的表达（P<0.01）,极显著降低Cyclin D2的表达（P<0.01）。RT-qPCR及Western blot检测结果表明,在颗粒细胞中上调CTSD后,能够极显著的下调多胎性状候选基因与蛋白BMPR-IB、FSHR、INHA在转录和翻译水平中的表达（P<0.01）。本研究发现,CTSD的高表达能抑制细胞的增殖,促进细胞凋亡,改变颗粒细胞的周期进程;还能改变细胞凋亡相关因子Bcl-2、Bax、Caspase-3与细胞周期相关因子Cyclin A1、Cyclin D2、Cyclin E的表达;同时也能够极显著降低颗粒细胞中多胎性状候选基因与蛋白BMPR-IB、FSHR、INHA的表达量（P<0.01）。这提示,CTSD可能通过改变细胞水平相关因子的表达量来调控颗粒细胞的生物学行为以及影响山羊多胎性状候选基因的表达进而间接的成为影响山羊产羔性状的重要因子,本研究为进一步探明CTSD对山羊产羔性状调控机理及对颗粒细胞的影响机制奠定基础。     

反季节生产技术对鹅FSHβ和FSHR基因表达的影响

为研究反季节生产技术对鹅FSHβ和FSHR基因表达的影响,选取经反季节生产技术控制的处于产蛋期和正常处于休产期扬州鹅,测定血清中FSH含量,并应用实时荧光定量PCR技术研究FSHβ和FSHR基因mRNA在下丘脑-垂体-性腺轴中的表达水平变化。结果表明,试验组(反季节生产技术控制处于产蛋期)鹅的血清中FSH水平极显著高于对照组(未调控处于休产期)鹅的血清中FSH水平(P<0.01);FSHβ和FSHR基因在垂体、下丘脑和卵巢组织中均有表达,且FSHβ在垂体中表达最高(P<0.01),FSHR基因在卵巢组织中表达最高(P<0.01);FSHβ基因在试验组鹅垂体中的表达量极显著高于其在对照组鹅垂体中的表达量(P<0.01);FSHR基因在产蛋期鹅卵巢组织中的表达极显著高于休产期鹅卵巢组织中的表达量(P<0.01)。反季节生产技术控制下鹅生殖轴组织中FSHβ和FSHR基因表达显著增加,血清中FSH测定结果与之一致,表明FSH与生殖周期密切相关。     

荣昌猪BMP15基因通过TGF-β RⅡ激活SMAD4信号分子机制研究

本研究旨在阐明荣昌猪BMP15基因在荣昌猪性成熟前不同发育期的表达特性及其与SMADs信号相关基因的表达关系。采集1月龄、3月龄及5月龄荣昌猪卵巢组织,利用qRT-PCR及石蜡切片免疫荧光染色法分析荣昌猪不同月龄卵巢组织内BMP15基因表达及细胞定位特征;利用5月龄卵巢活组织添加重组人BMP15蛋白及TGF-β受体抑制剂（LY215799和LY2109761）,应用qRT-PCR及Western blot方法分析BMP15及SMADs信号通路相关基因SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD7、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β RⅠ和TGF-β RⅡ表达特征及BMP15/SMADs信号通路。结果表明：从1月龄至5月龄,随着荣昌猪生长发育,卵巢组织内BMP15基因mRNA表达量呈上调表达（P<0.05）;石蜡切片免疫荧光试验表明,5月龄卵巢组织卵母细胞周围颗粒细胞内存在BMP15蛋白荧光信号;从3月龄至5月龄的卵巢组织内BMP15、SMAD4、TGF-β1及TGF-β RⅡ基因在mRNA水平呈上调表达（P<0.05）,而SMAD2、TGF-β2及TGF-β RⅠ呈下调表达（P<0.05）;通过5月龄卵巢活组织添加重组人BMP15蛋白、TGF-β RⅠ/Ⅱ及TGF-β RⅠ受体抑制剂培养,发现TGF-β RⅠ/Ⅱ抑制剂（LY2109761）明显抑制TGF-β RⅡ受体蛋白的表达,TGF-β RⅠ抑制剂（LY2157299）不能抑制TGF-β RⅡ受体蛋白的表达。上述结果表明,荣昌猪BMP15基因在荣昌猪性成熟前的卵巢组织内呈上调表达,SMAD4、TGF-β1及TGF-β RⅡ也呈上调表达。本试验研究表明BMP15基因通过TGF-β RⅡ介导SMAD4信号分子调控下游基因的表达,为进一步研究荣昌猪BMP15基因在卵泡发育中发挥的作用提供理论依据。     

黔北麻羊GPx3基因克隆、生物信息学分析及在不同性腺组织中的表达分析

为探究GPx3基因在产单、多羔黔北麻羊不同性腺组织中的表达规律及其蛋白质的结构与功能,本实验以黔北麻羊为研究对象,采集单、多羔黔北麻羊的下丘脑、垂体、子宫、输卵管和卵巢提取总RNA,运用qRT-PCR技术,分析GPx3基因mRNA在单、多羔黔北麻羊5个不同性腺组织中的表达水平;PCR法扩增克隆黔北麻羊GPx3基因的CD...     

新西兰白兔CYP11A1基因的克隆、生物信息学分析及其对繁殖相关基因的影响

【目的】旨在通过分析细胞色素P450家族成员11A1（CYP11A1）的生物信息功能及其在新西兰白兔卵巢颗粒细胞中对繁殖性能相关基因的调控作用，为探究其在卵泡发育过程中调控功能奠定基础。【方法】根据GenBank上兔CYP11A1基因的序列，设计特异性引物，以新西兰白兔卵巢组织cDNA为模板，PCR扩增并克隆CYP11A1基因序列，构建pcDNA3.1-CYP11A1过表达重组载体；用Mega 5.1在线软件构建系统进化树，并通过生物信息学软件对CYP11A1蛋白的氨基酸组成、理化性质、磷酸化位点、保守结构域、二级结构、三级结构、亚细胞定位、蛋白互作进行预测分析。分离新西兰白兔卵巢颗粒细胞，并通过免疫荧光法鉴定颗粒细胞特异性抗体卵泡刺激素受体（FSHR）的表达。设计3条干扰CYP11A1基因表达的引物（siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3），筛选出干扰效率最高的1条，并将其与pcDNA3.1-CYP11A1过表达重组载体转染到卵巢颗粒细胞中，用实时荧光定量PCR检测颗粒细胞中羟基类固醇17-β脱氢酶1（HSD17B1）、骨形态发生蛋白15（BMP15）和促卵泡刺激素受体（FSHR）等繁殖相关基因mRNA表达水平。【结果】成功克隆新西兰白兔CYP11A1基因，其CDS全长序列为1 557 bp，编码518个氨基酸，其中亮氨酸含量（10.6%）最高，精氨酸（7.6%）、缬氨酸（7.4%）和丙氨酸（7.2%）次之。进化树分析显示，CYP11A1蛋白序列与家鼠、人和猩猩的距离最近。生物信息学分析显示，CYP11A1蛋白理论等电点为7.4，正负电荷残基数各占50个，脂肪族氨基酸指数为82.16，不稳定性指数39.54，其中氨基酸序列中亲水性残基数量多于疏水性残基；CYP11A1蛋白具有40个潜在的磷酸化位点，其中以苏氨酸、丝氨酸和酪氨酸最为丰富；CYP11A1蛋白二级结构由α-螺旋（48.31%）、无规则卷曲（40.22%）、延伸链（7.42%）和β-转角（4.04%）组成，三级结构为弯曲螺旋状。亚细胞定位预测结果显示，CYP11A1蛋白主要分布于线粒体（52.2%）、细胞质（17.4%）和细胞核（13.0%）中，还具有1个p450家族的结构域，并与多个繁殖性能相关的蛋白（STAR、CYP21A2、CYP17A1和FDX1）相互作用。分离的兔颗粒细胞表达FSHR，可以用于后续试验；CYP11A1基因在颗粒细胞中过表达后，HSD17B1和FSHR基因表达量极显著上调（P＜0.05），BMP15基因表达量显著上调（P＜0.01）；干扰CYP11A1基因表达后，BMP15和FSHR基因的表达量极显著下调（P＜0.01），HSD17B1基因表达量显著下调（P＜0.05）。【结论】CYP11A1是一个稳定、亲水、相对保守且具有抗氧化和类固醇激素合成功能的蛋白。CYP11A1基因可调控卵巢颗粒细胞中与繁殖性能相关的基因HSD17B1、BMP15、FSHR的表达，说明CYP11A1基因在母兔繁殖过程中发挥一定作用。     

黔北麻羊CTSB、CTSD基因的克隆、生物信息学分析及在不同组织中的表达

以单、多羔黔北麻羊为试验对象,采用PCR法扩增克隆获得黔北麻羊CTSB、CTSD基因CDS区序列,生物信息学方法分析黔北麻羊CTSB、CTSD的理化性质、蛋白质高级结构、亚细胞定位情况和信号肽位点,并进行氨基酸同源性分析构建系统进化树;应用qRT-PCR法对目的基因在单、多羔黔北麻羊下丘脑、垂体、子宫、输卵管和卵巢5个性腺组织中的表达量进行差异分析。结果表明:黔北麻羊CTSB、CTSD基因编码序列全长为1 008和1 239 bp,共编码335和412个氨基酸。其蛋白相对分子质量分别为36 780和44 590,理论等电点为5.65和7.03,不稳定系数为65.16和37.82。CTSB、CTSD蛋白二级结构均主要由无规则卷曲构成;三级结构预测结果与二级结构一致,且CTSB蛋白属于亲水性蛋白,信号肽剪切位点位于第17～18号氨基酸,亚细胞定位发现CTSB蛋白有66.7%的可能定位于细胞外;而CTSD属于疏水性蛋白,信号肽剪切位点位于第22～23号氨基酸,亚细胞定位表明其有44.4%的可能定位于细胞外(包括细胞壁)。与其他动物相比,黔北麻羊CTSB、CTSD编码氨基酸序列与绵羊的亲缘性最近。qRT-PCR结果显示,CTSB、CTSD基因在单、多羔黔北麻羊下丘脑、垂体、子宫、输卵管、卵巢5个性腺组织中均有表达,且在卵巢中的表达量最高,极显著高于其他组织(P0.01),CTSB基因mRNA在多羔黔北麻羊垂体、子宫中的表达量极显著高于单羔黔北麻羊(P0.01),CTSD基因mRNA在多羔黔北麻羊垂体、输卵管、卵巢中的表达量极显著高于单羔黔北麻羊(P0.01)。本试验揭示了CTSB、CTSD基因在单、多羔黔北麻羊的表达差异并初步分析了其生物学功能,为进一步探究CTSB、CTSD基因的功能与调控机理奠定了基础。     

黔北麻羊TIMP1基因编码区的克隆、表达及生物信息学分析

为探究黔北麻羊基质金属蛋白酶抑制剂1(TIMP1)基因的表达水平和蛋白结构功能。本研究选取3岁两胎次的单、多羔健康黔北麻羊母羊各3只,采集子宫、输卵管、垂体、下丘脑、卵巢5个组织并提取组织中的总RNA反转录为第一链cDNA,克隆了黔北麻羊TIMP1基因CDS区全长序列,对TIMP1蛋白的理化性质、蛋白质结构等进行预测分析,并进行同源性分析和系统进化树构建;同时采用qRT-PCR检测TIMP1基因mRNA在不同产羔性状的黔北麻羊性腺轴组织中的表达水平。结果发现:T-克隆的黔北麻羊TIMP1基因CDS区为624 bp,编码207个氨基酸,与NCBI上山羊mRNA序列相同;蛋白预测分析结果显示:黔北麻羊TIMP1蛋白的分子式为C_(1020)H_(1581)N_(283)O_(291)S_(19),相对分子质量为23.073 64 ku,等电点为8.62,不稳定系数为64.5;遗传进化树分析得出,与其他9个物种相比较,黔北麻羊TIMP1基因与绵羊和牛的遗传距离最近;qRT-PCR结果显示,垂体、卵巢和输卵管在多羔组中的表达高于单羔组(P0.01)。本研究揭示了TIMP1基因在单、多羔黔北麻羊5个组织中的表达差异性,对TIMP1基因的T-克隆和蛋白的结构功能预测也丰富了相关研究数据,为进一步探索黔北麻羊产羔性状的分子机制提供参考。     

黔北麻羊TGFβ2基因克隆、表达及生物信息学分析

为探究转化生长因子β2基因(Transforming Growth Factor beta 2,TGFβ2)在黔北麻羊性腺轴组织的表达水平和蛋白结构功能。本研究以健康成年黔北麻羊母羊为对象,采集子宫、输卵管、垂体、下丘脑、卵巢5个组织并提取总RNA,逆转录合成cDNA第一链,使用RT-qPCR技术检测TGFβ2基因在黔北麻羊性腺组织中的差异表达;进一步使用RT-PCR法克隆黔北麻羊TGFβ2基因CDS区,并构建pMD-19T-TGFβ2亚克隆载体。克隆测序结果显示:通过RT-PCR法成功获得的黔北麻羊TGFβ2基因CDS区,包含1 329 bp,与NCBI上山羊TGFβ2基因序列相似度达到99.85%,共编码442个氨基酸;TGFβ2蛋白存在信号肽位点,且主要定位于细胞质的相对不稳定分泌蛋白;分子式为C_(2245)H_(3535)N_(615)O_(662)S_(25);遗传进化树分析得出,与9个物种相比较,黔北麻羊TGFβ2基因与绵羊和牛的遗传距离最近,与马和狗的遗传距离最远。RT-qPCR结果显示,TGFβ2基因在子宫组织中表达最高,极显著高于输卵管和下丘脑组织,显著高于垂体及卵巢组织。本实验完成了黔北麻羊TGFβ2基因T-克隆和蛋白结构的功能预测,揭示了TGFβ2基因在黔北麻羊性腺轴组织中的表达差异性,这为进一步探索TGFβ2基因对黔北麻羊繁殖性能的分子机制提供了基础数据。     

黔北麻羊UCP2基因组织表达及其多态性与生长性状的关联分析

本研究旨在探讨黔北麻羊解耦联蛋白2（uncoupling protein 2,UCP2）基因的遗传多态性及其与生长性状的关联性,以期为黔北麻羊的育种改良提供理论依据。以200头6月龄黔北麻羊为研究对象,采用直接测序法检测黔北麻羊UCP2基因的SNP位点,并将其与黔北麻羊生长性状进行关联分析;实时荧光定量PCR检测UCP2基因在黔北麻羊不同组织中的表达水平。结果显示,UCP2基因存在4个SNPs位点,分别为：g.29614172 A>G、g.29619320 G>T、g.29619721 C>T和g.29620037 A>G,均产生3种基因型,其中g.29619320 G>T和g.29620037 A>G为错义突变,g.29619320 G>T突变导致甘氨酸（Gly）变为半胱氨酸（Cys）,g.29620037 A>G突变导致苏氨酸（Thr）突变为丙氨酸（Ala）。多态信息含量显示,4个SNPs位点均表现为中度多态（0.25 < PIC < 0.5）。χ²检验结果表明,g.29614172 A>G、g.29619721 C>T和g.29620037 A>G突变位点在黔北麻羊群体中均处于Hardy-Weinberg平衡状态（P>0.05）,g.29619320 G>T突变位点极显著偏离了Hardy-Weinberg平衡状态（P<0.01）。连锁不平衡分析显示,g.29619320 G>T和g.29619721 C>T位点具有强连锁效应。实时荧光定量PCR结果表明,UCP2基因在黔北麻羊各组织中均有不同程度的表达,其在肺脏中的表达量最高,其次是脾脏、肝脏和心脏,其余组织表达量较低。关联性分析结果表明,g.29614172 A>G位点AG和GG基因型个体体重、体斜长、胸宽、胸深、胸围及管围均显著高于AA基因型,g.29619320 G>T位点TT基因型个体胸深、胸围及管围均显著高于GT和GG基因型,g.29619721 C>T位点CT基因型个体体高显著高于CC和TT基因型,g.29620037 A>G位点GG基因型个体体重、胸深及管围均显著高于AG和AA基因型个体（P<0.05）。本试验结果初步揭示UCP2基因对黔北麻羊部分生长性状有显著影响,发现的4个SNPs位点可作为黔北麻羊经济性状选择的遗传标记。     

OPN5对鸭颗粒细胞凋亡、增殖及类固醇激素生成的影响

旨在研究视神经蛋白（neuropsin,OPN5）对鸭颗粒细胞凋亡、增殖及类固醇激素生成的影响。本研究分别对鸭颗粒细胞进行OPN5过表达质粒和OPN5 siRNA处理72 h （n=6）,应用EdU细胞增殖检测技术、流式细胞技术、Annexin V-FITC、RT-PCR、Western blot及ELISA技术系统地检测颗粒细胞的增殖、凋亡情况及生殖相关基因的mRNA、蛋白水平及激素水平的变化规律。结果显示,OPN5过表达能促进鸭卵泡颗粒细胞增殖,抑制鸭卵泡颗粒细胞凋亡;能极显著地促进GnRHR、FSHR、LHR的表达 ,并抑制GnIH、GnIHR的表达（P<0.01）;能显著或极显著上调StAR、CYP11A1、3β-HSD、CYP17A1、CYP19A1的mRNA水平（P<0.05或P<0.01）;显著升高OPN5、3β-HSD及CYP19A1的蛋白表达水平（P<0.05）和极显著升高E2、P4分泌水平（P<0.01）,并极显著降低INHβ的水平（P<0.01）。OPN5 siRNA能够显著降低OPN5的表达水平（P<0.01）,抑制卵泡颗粒细胞增殖并促进凋亡,极显著下调GnRH、GnRHR、FSHR、LHR（P<0.01）,促进GnIH、GnIHR的表达（P<0.01）;并极显著抑制StAR、CYP11A1、CYP17A1的表达（P<0.01）;显著降低OPN5、3β-HSD及CYP19A1蛋白表达水平（P<0.05）及极显著降低E2、P4的分泌水平（P<0.01）,并能极显著升高INHβ的水平（P<0.01）。研究表明,OPN5能促进鸭卵泡颗粒细胞的增殖,抑制其凋亡,促进颗粒细胞中类固醇激素的生成和分泌。     

海兰褐蛋鸡ZP3基因结构及其在卵泡中表达规律分析

旨在探讨ZP3基因在海兰褐蛋鸡中的表达特性，为后期研究ZP3基因在蛋鸡卵泡发育中的作用提供理论支撑。本研究以产蛋期50周龄（50 W）海兰褐蛋鸡为试验对象，利用RACE技术克隆ZP3基因全长，并对编码区进行生物信息学分析。选择健康、体重相近的海兰褐蛋鸡6只，分别取心、肝、肺、肾、卵巢、胸肌、腿肌和不同等级卵泡构建表达谱。卵巢颗粒细胞经不同浓度（PBS、5 ng·mL^-1、10 ng·mL^-1、20 ng·mL^-1）促卵泡素（follicle-stimulating hormone，FSH）处理后，提取总RNA，采用实时荧光定量检测ZP3基因在各个样品的表达水平。结果表明，鸡ZP3基因全长1 415 bp，其中编码区1 341 bp，共编码446个氨基酸，位于10号染色体上，包含9个外显子；其亲缘关系与猪最远；跨膜结构预测表示，其含有一个跨膜结构域和一个信号肽区域；对其亲疏水性进行分析，预测该蛋白为弱的疏水性蛋白，蛋白质结构主要由无规则卷曲构成。组织表达谱显示，ZP3基因在鸡的卵巢中相对表达量最高。各等级卵泡ZP3表达分析显示，随着卵泡发育，ZP3基因在成熟卵泡（F1）颗粒细胞层表达量最高；在使用FSH处理等级颗粒细胞后，发现ZP3表达量显著上调（P<0.05），暗示ZP3基因在颗粒细胞中受到FSH激素调节。本试验对ZP3基因的结构进行了分析并预测该基因存在跨膜结构和信号肽区域。基因表达谱分析结果显示，ZP3基因在卵泡发育过程中表达量逐渐升高且主要在颗粒细胞中表达，可能受到FSH的调节作用，因此预测，ZP3基因可能与海兰褐蛋鸡繁殖功能相关。     

促卵泡素对体外培养牛卵泡类固醇合成相关基因表达的影响

本研究旨在探究促卵泡素（follicle stimulating hormone,FSH）处理对体外培养的牛有腔卵泡颗粒细胞和膜细胞类固醇激素合成相关基因表达的影响。采集牛卵巢表面直径9~11 mm的有腔卵泡,用含不同浓度FSH的DMEM/F12体外培养牛有腔卵泡24 h。提取卵泡颗粒细胞、膜细胞RNA并反转录成cDNA,利用实时荧光定量PCR检测卵泡颗粒细胞、膜细胞中类固醇激素合成酶基因（CYP11A1、3β-HSD、CYP17A1、CYP19A1、17β-HSD）和促性腺激素受体基因（FSHR、LHR）的表达水平。结果显示,FSH处理上调了颗粒细胞中CYP11A1、3β-HSD和CYP19A1基因表达,其中,25 ng/mL FSH处理极显著上调了CYP11A1基因表达（P<0.01）,10 ng/mL FSH处理显著上调了3β-HSD基因表达（P<0.05）,50 ng/mL FSH处理显著上调了CYP19A1基因表达（P<0.05）;50 ng/mL FSH处理显著或极显著上调了膜细胞中CYP11A1、3β-HSD和CYP17A1基因表达（P<0.05;P<0.01）,但在10和25 ng/mL FSH处理组中CYP11A1、3β-HSD和CYP17A1基因表达显著或极显著下调（P<0.05;P<0.01）。对FSHR、LHR基因研究结果显示,不同浓度FSH处理对颗粒细胞中FSHR、LHR基因的表达均无显著影响（P>0.05）,只有25和50 ng/mL FSH处理显著或极显著上调了膜细胞中LHR基因表达水平（P<0.05;P<0.01）,且不同处理组之间膜细胞中CYP11A1、3β-HSD和CYP17A1基因的表达变化与LHR基因表达变化趋势较一致。结果表明,FSH处理可提高牛有腔卵泡颗粒细胞中CYP11A1、3β-HSD和CYP17A1基因的表达,膜细胞中CYP11A1、3β-HSD和CYP17A1基因对LH的刺激更敏感,FSH可能通过影响LHR基因的表达来调节膜细胞中类固醇合成酶基因的表达。     

黔北麻羊PPP3CA基因克隆、生物信息学分析及不同组织表达研究

为克隆获得黔北麻羊PPP3CA基因的编码序列进行生物信息学分析并探究PPP3CA基因在黔北麻羊不同组织中的表达情况,本实验应用RT-PCR克隆PPP3CA基因的CDS区序列,构建pMD19-T-PPP3CA亚克隆载体,用实时荧光定量PCR法检测黔北麻羊PPP3CA基因在心、肝、脾、肺、肾、背最长肌6个组织中的表达水平。结果显示:黔北麻羊PPP3CA基因CDS区序列全长为1 566 bp,编码521个氨基酸,理论等电点为5.58;黔北麻羊PPP3CA蛋白属亲水性、非跨膜蛋白,二级结构分析显示其主要由α-螺旋和无规则卷曲构成,三级结构预测与二级结构结果相符。黔北麻羊PPP3CA基因核苷酸序列与绵羊同源性最高;PPP3CA基因在黔北麻羊不同组织中均有表达,在背最长肌组织中表达量极显著高于其他组织,背最长肌组织表达量极显著高于其他组织。本实验揭示了PPP3CA基因在黔北麻羊的表达差异并初步分析了其生物学功能,为进一步探究PPP3CA基因对山羊的生长发育奠定基础。