鸡Rab7b在细胞晚期内吞体定位和结合恒定链的分子特征

Rab蛋白是介导胞内活性蛋白转运的分子家族。恒定链（invariant chain,Ii）具有协助抗原肽转运、B细胞成熟和作为细胞因子的受体等免疫学功能。前期研究发现,鸡（Gallus gallus）Rab5a在细胞早期内吞体中与Ii结合,但不清楚是否还有其他转运蛋白有该特性。基于Rab7b分子定位于晚期内吞体,并与胞内分子转运相关,本研究探索了鸡Rab7b与Ii结合的分子结构特征。首先,用自行设计的引物扩增了鸡和小鼠（Mus musculus）Rab7b基因,并进行了氨基酸同源性比对分析;构建了含鸡Rab7b及其67位氨基酸突变体Rab7bQ67L的原核和真核重组质粒。其次,将含红色荧光蛋白和目的基因的重组质粒转染鼠巨噬细胞系Raw264.7,培养后用绿色荧光素（FITC）标记的鼠抗晚期内吞体蛋白1（LAMP1）抗体染色,观察目的蛋白在内吞体的定位。进一步将鸡Rab7b和Rab7bQ67L分别与Ii共转染293T细胞,观察它们与Ii的共定位。最后用拉下法和免疫印迹检测鸡Rab7b及Rab7bQ67L与Ii的结合。结果表明,所克隆获得的鸡Rab7b基因与预期大小一致,其开放阅读框为624 bp,编码208个氨基酸。鸡和鼠的Rab7b蛋白质结构相似性为74%。尽管鸡Rab7b和突变体Rab7bQ67L均能结合Ii,但只有Rab7b可以定位于晚期内吞体,而突变体却改变了该定位特性。综上所述,鸡Rab7b与Ii不仅在晚期内吞体共定位,而且还能互相结合;鸡Rab7b的第67位氨基酸影响其在细胞内定位而不影响与Ii结合。综上表明,Rab分子参与了Ii在细胞内细胞器的转运,为进一步研究Ii在细胞内的转运机制提供了新的途径。     

Rab5与Rab7调控N2a细胞内狂犬病病毒的早期感染

狂犬病病毒(rabies virus,RABV)作为一种高度嗜神经性的病毒,通过网格蛋白介导和pH依赖的内吞途径侵入神经细胞,然后经胞内体途径进行传输。已有研究表明,Rab5和Rab7是介导胞内体分选、成熟及定向运输的关键蛋白,而RABV胞内运输是否也受到这两者的调控尚不清楚。本试验通过免疫荧光、Western blot及TCID50等技术,检测了N2a中RABV核蛋白(N)和Rab5与Rab7的胞内共定位及RNAi下调Rab5与Rab7表达时,N蛋白表达水平、病毒滴度等的变化。结果发现,Rab5和Rab7与RABV N蛋白存在共定位;当Rab5和Rab7表达下调,RABV感染初期N蛋白表达显著下降,且病毒TCID50也随之降低。结果表明,RABV感染受Rab5和Rab7调节。为进一步解析狂犬病病毒逆轴浆传输机制提供了新的数据。     

鸡传染性支气管炎病毒HN株5a5b及N基因的遗传变异分析

从河南省某鸡场中疑似鸡传染性支气管炎(IB)的雏鸡病料中分离到1株鸡传染性支气管炎病毒(IBV)，暂命名为HN，鉴定为IBV。从接种HN毒株的鸡胚尿囊液中提取单股RNA后应用反转录-聚合酶链反应(RT—PCR)技术扩增得到包含IBV HN株5a、5b蛋白及N蛋白基因的约1600bp片段；将克隆测序的5a、5b及N基因分别与GenBank中11株国内外参考毒株相应基因进行序列比较与遗传变异分析，发现IBV HN株变异独特，明显不同于国内外参考毒株。     

鸡恒定链分子跨膜区2个氨基酸残基在形成MHCⅡ-Ii复合物中的作用

本研究旨在探明鸡恒定链跨膜区特定氨基酸在形成MHCⅡ-Ii复合物聚合中的作用特征.用大引物PCR定点突变法将鸡Ii链跨膜区2个氨基酸Gln47和Thr50分别突变为丙氨酸(Ala),再连接到pEGFP-C1载体中,构建含Ii-GFP融合基因的真核表达载体.同时还分别构建了含pDsRed2-N1-MHCⅡα、pDsRed2-N1-MHCⅡβ、pEG-FP-N1-MHCⅡa和pEGFP-N1-MHCⅡβ真核表达载体.用脂质体介导法将这些重组质粒单独或共转染至COS-7细胞,培养48 h后经荧光显微镜检测野生型Ii和突变型Ii与MHCⅡ类分子的细胞定位,并通过免疫共沉淀研究它们之间的相互关系.结果显示,野生型Ii链与MHCⅡα或MHCⅡβ之间存在细胞内的共定位,而突变型Ii与MHCⅡα或MHCⅡβ在细胞中共表达后未出现共定位现象.免疫共沉淀结果显示,在野生型Ii链与MHCⅡa或(和)MHCⅡβ单转染或三者共转染COS-7细胞后,均能检测到MHCⅡa-li、MHCⅡβ-Ii和MHCⅡ-Ii复合物,而突变型Ii链与MHCⅡα或(和)MHCⅡβ单转染或三者共转染COS-7细胞后,均检测不到MHCⅡα-Ii、MHCⅡβ-Ii和MHCⅡ-Ii复合物.因此Ii链跨膜区Gln47和Thr50 2个氨基酸对于MHCⅡ-Ii复合体的形成是至关重要的.     

STAT5b基因的遗传多态性及其与京海黄鸡体重和繁殖性状的关联分析

以京海黄鸡、AA鸡、尤溪麻鸡、边鸡等4个鸡品种为研究对象,采用PCR-SSCP方法检测信号转导和转录激活子5b(STAT5b)第7外显子和部分内含子7的多态性,并分析其对京海黄鸡体重和繁殖性状的遗传效应。结果显示,在STAT5b第7内含子区域检测到1处突变(8 066bp C→T)。在4个鸡品种中均检测到AA、AB、BB 3种基因型,χ2检验结果表明,除京海黄鸡外其余3个品种群体在该座位均达到Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。最小二乘分析表明,京海黄鸡3种基因型个体的出生重和开产日龄存在显著差异(P<0.05)。     

传染性支气管炎病毒青岛腺胃分离株(SD/97/02)基质蛋白、5a、5b 蛋白基因的克隆和序列分析

参考 Gen Bank上的传染性支气管炎病毒 (IBV)序列 ,自行设计合成了 3条引物 ,对 IBV青岛腺胃分离株 (SD/97/ 0 2 ) RNA进行 RT- PCR扩增 ,扩增含基质蛋白 (M)及 5 a、5 b蛋白基因的约 1.6 5 kb的片段 ,对 PCR产物进行克隆后测序。序列分析显示 ,M蛋白基因与其他 IBV相应的基因同源性在 90 .33%～ 92 .75 %之间 ,氨基酸序列比较 ,同源性在 89.82 %～ 94.2 5 %之间 ;5 a基因与其他 IBV的基因同源性在 84.34 %～ 87.37%之间 ,氨基酸同源性在 81%～82 %;5 b基因与其他 IBV的基因同源性在 91%～ 92 %之间 ,氨基酸同源性在 93%左右。     

油梨果肉捕光叶绿素a/b结合蛋白基因PaCAB1的克隆、序列分析及表达

以油梨品系 “RN-5”为实验材料,克隆出叶绿素a/b结合蛋白同源基因,命名为PaCAB1,其开放阅读框为777 bp,编码259个氨基酸。氨基酸序列比较分析表明,PaCAB1独自聚类成为一组,与其它21种物种CAB同源性相对较低。实时荧光定量PCR检测表明,在油梨果肉发育过程中,PaCAB1的表达量逐渐地缓慢降低,到S-III时期降到最低点,其变化趋势与叶绿素a、叶绿素b和叶绿素a+b的含量变化趋势一致。     

bta-miR-34b/c和bta-miR-449a/b/c靶基因预测及生物信息学分析

【目的】试验旨在对bta-miR-34b/c和bta-miR-449a/b/c的序列保守性、转录因子和靶基因进行生物信息学预测和分析,探究其影响精子发生的作用机制,为研究其生物学功能及作用机制提供指导和思路。【方法】利用miRBase数据库获取不同物种的bta-miR-34b/c和bta-miR-449a/b/c序列并进行相似性分析;通过TargetScan、miRWalk、miRDB等方法预测bta-miR-34b/c和bta-miR-449a/b/c的靶基因,对获得的靶基因集合分别进行GO功能和KEGG通路富集分析;通过AnimalTFDB获取共同调控bta-miR-34b/c和bta-miR-449a/b/c的转录因子,并构建TF-miRNA-mRNA作用网络。【结果】bta-miR-34b/c和bta-miR-449a/b/c在不同物种间高度保守。预测得到2个转录因子和49个候选靶基因,这些靶基因主要富集在精子发生、钙离子依赖性胞吐的调节、胰岛素分泌的调节等GO条目,以及HIF-1信号通路、甲状腺激素信号通路、Wnt信号通路等KEGG通路。bta-miR-34b/c、bta-m...     

过敏毒素C5a和C3a在微小隐孢子虫感染中的表达分析

为明确过敏毒素C5a和C3a在小鼠感染和清除隐孢子虫(Cryptosporidium)感染过程中的作用,本研究以微小隐孢子虫(C.parvum)为研究对象,以BALB/c小鼠为感染模型,采用实时荧光定量PCR分析了C.parvum感染小鼠的小肠相关淋巴组织和脾脏中过敏毒素C3a、C5a及其相应受体(C3aR和C5aR)的mRNA水平。结果显示,在脾脏和小肠中,不仅过敏毒素C5a和C3a在感染后出现了显著上调表达,其受体C5aR和C3aR的表达水平在感染后亦显著上调表达(P<0.05),并呈现动态变化。这些研究结果提示C5a/C5aR和C3a/C3aR信号参与了宿主抗微小隐孢子虫感染的过程。     

Molecular Characteristics of Chicken Rab7b in Localization and Binding Invariant Chain in Late Cell Endocytosis

Rab is a family of molecules that mediate the transport of active proteins in cells. The invariant chain (Ii) has the immunological functions of assisting antigen peptide transport, B cell maturation, and acting as the receptor of cytokines. Previous studies showed that Rab5a of chicken (Gallus gallus) is bound to Ii in the early endocytosis, but it is not clear whether there are other Rab molecules with this property. Based on the localization of Rab7b in late endocytosis and its relationship with intracellular molecular transport, this study explored the molecular structure of Rab7b binding to Ii. First, Rab7b genes of chicken and mouse (Mus musculus) were amplified with self-designed primers, and the amino acid homology was analyzed; the prokaryotic and eukaryotic recombinant plasmids containing Rab7b and its 67 amino acid mutant Rab7bQ67L were constructed. Secondly, the recombinant plasmid containing red fluorescent protein and target gene was transfected into mouse macrophage line Raw264.7. After culture, the recombinant plasmid was stained with FITC labeled mouse anti late endosomal protein 1 (LAMP1) antibody to observe the localization of the target protein. Furthermore, chicken Rab7b and Rab7bQ67L were co-transfected with Ii to observe their co-localization with Ii. Finally, the binding of Rab7b and its mutants to Ii were detected by pull-down technique and Western blotting. The results showed that the Rab7b gene was the same size as expected, and its open reading frame was 624 bp, encoding 208 amino acids. The homology of Rab7b protein structure between chicken and mouse was 74%. Although both Rab7b and Rab7bQ67L could bind to Ii, it was Rab7b rather than Rab7bQ67L could locate in the late endocytosis. In conclusion, Rab7b and Ii were not only co-located in the late endocytosis, but also combined with each other; the 67th amino acid of Rab7b affected its location in cells but not with Ii. These results suggest that Rab molecules are involved in the transport of Ii in intracellular organelles, which provides a new way to further study the mechanism of Ii transport in cells.     

猪恒定链的原核表达及其分子结构与功能分析

为研究猪恒定链(Ii)分子结构与功能,通过PCR扩增编码完整Ii及其异构体的基因片段,克隆至T pMD18-T载体,在对目的基因进行测序及分析其基因与编码蛋白分子结构,确定功能域及其分子遗传变异的基础上,构建pET-32a-Ii重组载体,转化BL21进行诱导表达,并分析表达产物的免疫活性。结果显示,PCR扩增了645bp和837bp的Ii及其异构体编码基因,DNA序列分析其编码氨基酸分别为215个和279个,异构体Ii多出了64个氨基酸构成的Tg区;分子结构分析显示,猪Ii分子由胞内区、跨膜区和胞外区3部分组成,包含有内体定位基元、Ii-key、CLIP、TRIM等功能域,其中内体定位基元含有特征性L7I和PML17双亮氨酸基序,Ii-key、CLIP、TRIM氨基酸序列与人和小鼠Ii具有高度一致性。遗传变异分析表明,猪Ii分子与人、小鼠等哺乳动物的Ii同源性为62.7%~95.6%,与鸡、鸭、鸽、鹅等禽类Ii的同源性为48.7%~49.5%;空间结构分析显示,猪Ii有3个相似的α-helix构成,其间间隔由相似氨基酸构成的2个转角,转角关键位点氨基酸具有高度一致性;Ii编码基因在BL21细胞获得了有效表达,目的蛋白大小约41ku,Western blot和免疫荧光检测显示,表达产物具有良好的反应原性。试验成功获得了猪Ii及其异构体编码基因,明确了其功能区、分子遗传变异等特征,诱导表达获得了具有良好免疫活性的Ii重组蛋白,为进一步研究猪Ii分子结构与功能奠定了基础。     

PRRSV云南A06株ORF5和ORF7基因的克隆与序列分析

设计2对引物分别扩增PRRSV的ORF5和ORF7基因,对从云南某猪场分离到的毒株A06进行RT-PCR检测,得到2条特异性扩增带,克隆至pMD18-T载体并测序。将A06株的ORF5和ORF7基因及其推断氨基酸序列分别与PRRSV欧洲型代表株LV、美洲型代表株VR2332和7株中国分离的美洲型毒株相应基因进行核苷酸和氨基酸序列比对分析。结果显示,A06株属于美洲型,其ORF5和ORF7基因及推断氨基酸与我国2006年分离的4株HP-PRRSV代表株的相似性高达98%～99%,与欧洲型代表株LV的相似性只有56%～64%。分别构建了以上毒株ORF5和ORF7基因的亲缘关系图谱,反映了A06株ORF5和ORF7基因的进化位置,完成2个基因的遗传变异分析。     

山东PRRSV流行株ORF5、ORF6、ORF7基因序列的分子特征

采用RT-PCR技术对2001～2007年分离自山东地区10株(ShanDong-3、SD-JN、SD-ZQ、SD1、SD2、SD3、SD4、SD5、SD6和SD7)猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)进行ORF5、ORF6和ORF7基因的扩增、克隆和测序,与已知序列的毒株的相应片段进行同源性分析比较,并对其分子特征进行分析.结果表明:该10株病毒仍属北美洲型,其中2001～2002年分离的SD1株、SD2株和2006年分离的SD6株核苷酸序列之间的ORF5、ORF6、ORF7同源性分别为99.2%,99.8%,100%,均与北美洲原型代表株(VR-2332株)和疫苗毒MLVRespPRRS Repro USA遗传距离较近,同属一大分支;2006～2007年分离的PRRSV ShanDong-3、SD-JN、SD-ZQ 、SD3,SD4,SD5, SD7分离株ORF5、ORF6、ORF7同源性分别为97.8%～100%,99.4%～99.8%,99.2%～99.7%,均与国内96年Ch-1a和2002年HB-1株及2006年分离鉴定的国内高致病性分离株(JXA1、Shanghai、HEB1)同属一个大的分支.首次证实目前山东省同时存在高致病性PRRSV和传统PRRSV,并且有由传统PRRSV向高致病性PRRSV演化的趋势.     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒强弱毒ORF1a、ORF1b、ORF2-ORF7片段互换嵌合病毒的构建及其生物学特性的分析

为研究高致病性猪繁殖和呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)强弱毒之间毒力差异的分子基础,本实验分别以HP-PRRSV强毒HuN-F5株及其传代致弱的疫苗病毒株HuN4-F112为亲本病毒,利用反向遗传操作技术分别将ORF1a、ORF1b或ORF2-7编码序列在强弱毒之间互换。将6种含有不同嵌合基因的全长病毒基因组的重组质粒体外转录后转染BHK-21细胞,然后在Marc-145细胞中传代,拯救的重组病毒经RT-PCR、测序和免疫荧光鉴定,并分别命名为rHuN4-F5-ORF1a、rHuN4-F5-ORF1b、rHuN4-F5-ORF2-7(以强毒为骨架)和rHuN4-F112-ORF1a、rHuN4-F112-ORF1b、rHuN4-F112-ORF2-7(以弱毒为骨架)。进一步测定这些病毒在Marc-145上的生长曲线,结果显示:以强毒为骨架的嵌合病毒rHuN4-F5-ORF1a生长滴度显著高于亲本强毒rHuN4-F5,而以弱毒为骨架的嵌合病毒rHuN4-F112-ORF1a在细胞上的生长滴度低于其亲本弱毒rHuN4-F112,其他片段替换对病毒在细胞上的生长没有明显影响。本实验结果提示ORF1a对于PRRSV在体外细胞培养上的生长调节起重要作用。     

C5a受体颉颃剂及其在动物疾病模型治疗中的研究进展

C5a受体是人和动物体内补体系统的重要组成部分,与C5a结合后介导了众多生物学效应,参与了许多疾病的发生、发展,并在多种病变中起重要作用,如器官缺血再灌注损伤、急性肺损伤、脓毒血症、类风湿性关节炎、肾小球肾炎等疾病。如何抑制C5a受体的生物活性,从而减轻炎症反应一直是免疫学研究的热点问题。文章着重介绍了C5a受体颉颃剂及其在动物疾病模型治疗中的研究进展。