从江香猪SIM1基因SNPs筛查及生物信息学分析

本研究以从江香猪为研究对象,二元杂交猪(从江香猪×野猪)、外三元杂交猪(杜×长×大)为对照,采用DNA池和直接测序技术对3个群体的SIM1基因7个外显子、部分内含子以及3'非翻译区序列进行多态性检测;利用生物信息学软件预测多态位点对SIM1基因mRNA二级结构和蛋白质一级、二级结构的影响。结果表明,在3个群体的SIM1基因中筛查到12个SNPs,C77T位于第5外显子,T29186C、A29195C位于第9内含子,C63T、C225T位于第10外显子,C107T、A426G、T583C、A586C、A605C、A615C位于第11外显子,G267T位于3'非翻译区。其中C77T、T29186C、A29195C、C63T、C225T、C107T、G267T为同义突变,A426G、T583C、A586C、A605C、A615C为错义突变;5个错义突变分别导致异亮氨酸(Ile)变为缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)变为脯氨酸(Pro)、谷氨酸(Glu)变为丙氨酸(Ala)、谷氨酸(Glu)变为天冬氨酸(Asp)、天冬酰胺(Asn)变为组氨酸(His);根据在线软件预测,突变前后的SIM1基因mRNA二级结构和蛋白质一级、二级结构均会发生改变。     

皱皮香猪3个基因组拷贝数变异的多态性分布

为探究皱皮香猪个体产生皮肤变异的根本原因,本文基于重测序数据,采用生物信息学分析皱皮香猪基因组中的拷贝数变异(CNV),通过荧光定量 PCR 方法检测皱皮香猪中 3 个 CNVs 的拷贝数变异规律,并与香猪和大白猪进行比较。结果表明:3 个 CNVs 在猪群中的拷贝数变异呈现出多态性变化,皱皮香猪中CNV1以拷贝数缺失型为主,其中的 MPC1和 RSK3基因可能与脂肪沉积有关;皱皮香猪 CNV2和 CNV3以拷贝数增加型占优势,其中的 CCL17和 CX3CL1基因参与皮肤等组织的炎症反应,可能通过剂量效应引起香猪皮肤产生褶皱。     

香猪基因组外显子SNPs检测及繁殖和体型性状候选基因分析

为从基因组水平上探究香猪性成熟早、产仔数少、体型小的分子机理,本研究下载与香猪在繁殖和体型性状方面有明显差异的梅山猪、杜洛克猪的重测序数据作为参照,对26头香猪、24头梅山猪和24头杜洛克猪的重测序数据进行SNPs检测和等位基因频率差值分析,筛选香猪基因组外显子上与梅山猪、杜洛克猪高度分化的SNPs位点,并使用AS-PCR方法和Sanger测序方法统计其中8个SNPs位点的群体等位基因频率。最后,对含有高度分化SNPs位点的基因进行GO功能富集和KEGG通路分析。结果显示,SNPs检测获得香猪基因组外显子上SNPs共236 710个,包括193个终止密码子丢失、1 238个终止密码子获得、90 945个错义SNPs和144 334个同义SNPs。得到1 046个香猪高度分化SNPs,包括429个错义SNPs、2个终止子丢失、6个终止子获得和609个同义SNPs,影响524个蛋白质编码基因;并发现X染色体上44-58 Mb的一段富含高度分化SNPs的热点区域。群体等位基因频率验证结果与重测序结果一致,鉴定了8个位点均为香猪与梅山猪、杜洛克猪高度分化的SNPs。对524个含有高度分化SNPs的基因进行GO和KEGG分析,富集到卵母细胞减数分裂、雌激素信号途径等繁殖相关通路;GO功能注释到细胞内雌激素受体信号、纤毛运动等繁殖相关条目,骨骼系统形态发生、骨骼发育、成骨细胞分化等体型相关条目。得到含有香猪高度分化SNPs的18个繁殖性状候选基因PTGFR、TRO、DNAH17、PKDREJ、KAT8、DNAI2、VDR、TEX14、QSOX1、AR、WNK3、ADCY3、SPEF1、MIGA2、SLC2A8、PSMF1、TBC1D20、IFT172和7个体型相关基因IBSP、NR6A1、HSPG2、TARS、PDZD2、FGF4、AMER1,可能是决定香猪性成熟早、产仔数少、体型小的关键基因。     

皱皮香猪WIF1基因结构变异WIF1-I8-sv889的研究

为探究WIF1（Wnt inhibitory factor 1）基因中WIF1-I8-sv889结构变异位点变异与皱皮香猪躯干被毛形成的关系,本试验采用冰冻组织切片观察皱皮香猪皮肤毛囊的组织学形态,采用PCR方法分析WIF1-I8-sv889位点在猪群中的分布频率,并通过在线软件UCSC、RegRNA 2.0对结构变异序列所含的功能元件进行分析。组织学研究显示,与正常香猪和大白猪皮肤相比,皱皮香猪毛囊毛根鞘伸入真皮层,形成棘突,且皱褶凹陷处毛囊聚集,相反皱褶凸起处毛囊较少;皱皮香猪皮肤毛囊中的毛球宽度显著增大（P<0.05）,单个毛囊中的毛干数极显著增多（P<0.01）。在WIF1-I8-sv889结构变异断点两端设计特异性引物,扩增片段长1383 bp,与参考基因组比,1383 bp中889 bp为结构变异区间,缺失581 bp,倒置308 bp。群体分布结果显示,猪群中WIF1-I8-sv889位点呈现出丰富的多态性,检测到3种基因型：正常的Ⅱ型、杂合的DI型和缺失的DD型,皱皮香猪中未检测到Ⅱ型;与正常香猪和大白猪相比,皱皮香猪中D等位基因占优势（94.44%）;经卡方检验,皱皮香猪D等位基因显著或极显著高于正常香猪和大白猪（P<0.05;P<0.01）。结果提示,WIF1基因中的WIF1-I8-sv889结构变异可能与皱皮香猪毛囊的形态发生有关。     

狮头鹅ASTN2基因SNPs位点筛选及生物信息学分析

为探究狮头鹅的星形肌动蛋白2(ASTN2)基因单核苷酸多态性(SNPs)位点的蛋白和mRNA二级结构及生物学特性,以在同一环境下饲养的200只500日龄正处于繁殖期的健康狮头鹅为试验对象,构建DNA混合池,采用PCR扩增和直接测序技术对该基因进行单核苷酸多态性(SNPs)筛查,利用生物信息学方法从分子水平对狮头鹅ASTN2蛋白和ASTN2基因的mRNA结构进行功能预测。结果显示,在狮头鹅群体中共筛选出3个SNPs位点,分别位于外显子Exon2的71、104和146处,其中g.3682861 G>A偏离哈代-温伯格平衡(P<0.05)。狮头鹅ASTN2基因编码区序列全长3 939 bp,编码1 312个氨基酸,突变位点均未改变编码区氨基酸的编码,理论等电点为5.58,是一种酸性不稳定亲水性跨膜分泌蛋白,有信号肽存在。亚细胞定位结果显示,其分布概率为质膜(39.1%)、内质网(26.1%)、细胞核(13%)、细胞质(8.7%)、细胞壁(4.3%)和细胞架(4.3%),主要在质膜发挥生物学作用;3种特殊结构(EGF＿like、MACPF、FN3),蛋白二级结构主要由α-螺旋和无规...     

香猪皮肤转录组衰老相关病毒源基因的筛选和鉴定

皮肤是哺乳动物抵御致病因素的第1道防线,在皮肤衰老的过程中,整合到哺乳动物基因组中的病毒源基因序列会被重新激活,影响宿主基因的表达,激起细胞对病毒的反应,引起慢性炎症、促进细胞衰老。本研究旨在探究病毒源基因表达与皱皮香猪皮肤皱纹形成的关系,选取12～18月龄皱皮香猪和普通香猪各5头进行转录组测序和生物信息学分析,采用RT-qPCR方法对皱皮香猪中差异表达的病毒源基因进行验证。2组中皮肤组织差异表达基因与病毒整合位点数据库进行比对分析,筛选出612个差异表达的病毒源基因。以普通香猪为对照,得到上调基因182个,下调基因430个,这些差异表达的病毒源基因主要富集在皮肤发育、炎症反应等GO条目,以及长寿调控途径、FoxO信号通路、细胞衰老等KEGG通路。经猪-人同源基因转换,与免疫、衰老、人类皮肤相关的基因取交集,筛选出高表达的候选基因6个：AGT、CAT、CTNNB1、JUP、KRT75和LIPE,采用RT-qPCR验证了皮肤中这6个基因的差异表达,与转录组测序结果趋势一致。研究结果表明,皱皮香猪皮肤皱纹的形成与病毒源基因的异常表达有紧密联系,本研究可为后期皱皮香猪皮肤褶皱形成的分子机制及...     

香猪后备猪体内酶水平和无机盐含量的测定与分析

对８头公头猪和５头母猪分别进行血清ＧＯＴ、ＧＰＴ、ＡＬＰ、Ｃｈｅ，ｒ－ＧＴ及血清Ｃａ，Ｐ，Ｎａ，Ｋ和Ｃｌ含量的测定与分析，结果表明公猪和母猪除胆碱酯酶外，其他指标在性别上无明显差别。     

香猪SRY基因的克隆及序列分析

试验参照猪SRY基因保守序列设计了1对引物,对香猪基因组DNA进行PCR扩增。将扩增产物通过T—A互补法克隆到质粒pGEM—T载体中,筛选阳性克隆进行DNA测序。测序结果显示,香猪SRY基因开放阅读框全长627bp,编码227个氨基酸。其中核心区域HMG—box长237bp,并且编码79个氨基酸。与白鲸、人、牛、绵羊4种哺乳动物的SRY基因序列相比较,香猪和白鲸的SRY序列具有较高的相似性,相似度达82．1％。序列相似性和邻接法聚类树的结果均显示,在SRY基因中香猪和白鲸有着较近的亲缘关系,表明以白鲸为代表的鲸目和以香猪为代表的偶蹄目有较近的亲缘关系。     

7个猪种MyoD基因家族中3个基因外显子的SNPs检测分析

本研究利用PCR SSCP技术,以7个猪种为研究对象,根据GenBank上猪的MyoG、MyoD和Myf5基因序列设计了17对引物,对此三基因的外显子进行了SNPs检测。检测结果:MyoG和MyoD两个基因均未检测到多态;在Myf5基因的3个外显子上都检测到了多态:第1外显子上有1个点突变G→C;第2外显子上有3个点突变C→A、A→G、G→A;第3外显子上,3387bp处有1个碱基A缺失,3417bp处有3个碱基T缺失,3443bp处有1个点突变T→C。Myf5基因的高度多态性,说明7个猪种含有丰富的遗传变异信息,具有很高的选择潜力。     

香猪ADCY2基因结构变异鉴定及其与生长性状的关联分析

为了探究香猪腺苷酸环化酶2(Adenylate Cyclase,ADCY2)基因结构变异与香猪生长性状的关系,本研究以233头断奶香猪为实验动物,定期测量体尺指标,采集耳组织提取基因组DNA,利用PCR技术分析香猪ADCY2基因结构变异的遗传多样性,并与香猪体尺指标进行相关性分析。结果显示,香猪ADCY2基因中存在1个长度为305 bp的结构变异位点(ADCY2-I2-SV305),该位点检出3种基因型：纯合缺失DD型、正常的II型和杂合的ID型,其中II基因型频率(67.09%)显著高于ID和DD基因型;I等位基因为优势等位基因。ADCY2-I2-SV305位点与香猪多个日龄的体宽、胸围和腹围显著相关,且II基因型的香猪个体各项体尺指标均显著高于ID和DD型个体,提示该结构变异的缺失型不利于香猪生长发育。对ADCY2-I2-SV305变异位点的功能元件分析发现,该位点中含有1个简单重复元件和1个SINE元件,以及5个miRNA结合位点,推测该位点的缺失突变将导致这些重复元件的丢失,不利于ADCY2基因的表达,进而影响香猪生长发育。综上,ADCY2基因的ADCY2-I2-SV305结构...     

香猪对氧磷酯酶基因家族的克隆及序列分析

采用RT-PCR技术,从香猪的肝脏总RNA中克隆了3个对氧磷酯酶(paraoxonase,PON)基因:PON1、PON2、PON3,其cDNA分别长1164、1212和1080 bp,各包含1个完整的开放阅读框,分别编码355、354、354个氨基酸组成的前体,其N-端的15、23、23个氨基酸为信号肽。香猪PON1基因中有1个碱基变异,不改变编码的氨基酸,为无义突变;香猪PON2基因中有2个碱基改变,导致成熟肽发生Q234R、V269I替换;香猪PON3基因中有1个碱基变化,使成熟肽出现R127H替换。经三维结构预测分析,这3个氨基酸位点的变化将影响蛋白质内部区域的微环境,影响对氧磷酯酶的功能,可能与香猪的抗逆性有一定的联系。     

从江香猪γ干扰素基因克隆与序列分析

试验旨在研究从江香猪γ干扰素（interferon gamma,IFN-γ）基因克隆与序列分析。试验提取贵州从江香猪肝脏组织总RNA,反转录生成cDNA,采用2对特异性引物进行巢式PCR扩增从江香猪IFN-γ（CJ-poIFN-γ）基因编码区,将其克隆至pUCm-T载体上,获得重组质粒pUCm-CJpoIFN-γ,并测序鉴定;利用NCBI、SOPMA、SignalP-4.1等在线服务器软件、DNAStar软件对CJ-poIFN-γ进行序列分析。结果表明,CJ-poIFN-γ基因编码区长501 bp,编码166个氨基酸;核苷酸序列比对结果显示,CJ-poIFN-γ与梅山猪、剑白猪、藏猪、成华猪、荣昌猪、印度猪、长白猪、内江猪同源性为99.4%~100.0%;进化树分析结果显示,CJ-poIFN-γ与梅山猪、剑白猪、藏猪、成华猪亲缘关系较近;CJ-poIFN-γ基因编码蛋白不存在跨膜结构,为分泌蛋白,前23个氨基酸为信号肽序列;CJ-poIFN-γ基因编码蛋白二级结构主要以α-螺旋（50.60%）和无规则卷曲（33.14%）为主,B细胞表位主要位于62-65、84-87、113-115、144-156和162-166位氨基酸。试验结果为进一步研究IFN-γ的生物活性、加快从江香猪品种资源的有效利用奠定基础。     

巴马香猪CIDEa基因克隆及组织表达分析

本试验旨在对巴马香猪CIDEa基因序列进行克隆,预测其蛋白结构和功能,并进行组织表达分析。根据NCBI已经公布猪的CIDEa基因序列(登录号:NM_001112696.2),利用Oligo 7.0软件设计引物,采用RT-PCR法扩增并克隆巴马香猪CIDEa基因序列,利用生物信息学软件分析其核苷酸序列及编码蛋白的疏水性、理化性质、跨膜结构域、二级结构、三级结构及互作蛋白,并采用实时荧光定量PCR方法检测CIDEa基因在巴马香猪皮下脂肪、肝脏、肾脏、肺脏、脾脏、背最长肌及心脏的表达规律。结果显示,试验成功获得巴马香猪CIDEa基因CDS区序列,全长660 bp,编码219个氨基酸,与GenBank中猪、牛、马、犬、人、猕猴和家鼠的核苷酸相似性分别为99.4%、84.7%、81.5%、80.9%、79.7%、78.9%和76.1%。与GenBank中野猪CIDEa基因核苷酸序列比对发现,发生4处碱基突变,其中A609G和T627C位点为同义突变,C173T(Pro→Leu)和C631T(Arg→Cys)位点为错义突变。巴马香猪CIDEa蛋白分子质量为24 483.57 u,等电点为9.48,不稳定指数为52.86,属于不稳定蛋白;该蛋白中亮氨酸(Leu)含量最高(13.2%),色氨酸(Trp)含量最低(0.5%)。巴马香猪CIDEa蛋白为膜外亲水性蛋白,包含1个超家族结构域(CIDE-N)。二级结构预测发现,巴马香猪CIDEa蛋白包含α-螺旋(45.66%)、β-转角(5.94%)、延伸链(14.61%)和无规则卷曲(33.79%),三级结构预测结果与二级结构一致。蛋白互作分析结果表明,巴马香猪CIDEa蛋白与PPARG、PPARGC-1、COX8H、PRDM16、DIO2、TMEM26、ELOVL3、COX7A1、CIDEC、DFFB蛋白存在相互作用。实时荧光定量PCR结果显示,CIDEa基因在巴马香猪皮下脂肪中表达量最高,且显著高于其他组织(P<0.05),心脏中表达量最低。研究结果为进一步探讨CIDEa基因对巴马香猪脂肪沉积的调控机制提供理论依据。     

梅山猪和香猪Prop-1基因的初步比较

Prop-1基因编码一种影响垂体前叶发生的转录因子,在人和动物均已发现由于该基因突变而引起的综合性垂体功能障碍,进而影响生长和繁殖。梅山猪和香猪的繁殖力和生长性能差异非常显著,为了了解这些差异的遗传基础,对两种猪的Prop-1基因进行了测序和比较。梅山猪Prop-1基因第198密码子为TTG,编码亮氨酸,而香猪为GTG,编码缬氨酸,即两种猪的Prop-1基因产物不同;在Prop-1基因终止密码下游250bp左右有一个腺苷酸丰富区,梅山猪有14个腺苷酸串联,香猪有11个腺苷酸串联。上述结果为进一步研究梅山猪和香猪之间生产性能差异的遗传基础提供了新线索。     

从江香猪IFN-β基因的序列分析及原核表达

试验旨在探明从江香猪β-干扰素（interferon-beta,IFN-β）基因编码区分子序列及原核表达产物特征。以从江香猪为研究对象,提取肝脏总RNA并反转录为cDNA,设计特异性引物扩增IFN-β基因编码区,将目的基因片段克隆至原核表达质粒pET-28a上,获得重组质粒pET28a-CJpoIFN-β,并利用生物学软件对江香猪IFN-β基因编码区进行序列分析;将鉴定正确的重组质粒pET28a-CJpoIFN-β转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导表达、SDS-PAGE与Western blotting分析原核表达蛋白。结果表明,从江香猪IFN-β基因编码区长为561 bp,编码186个氨基酸;该蛋白为分泌性蛋白,前21个氨基酸为信号肽序列;二级结构主要以α-螺旋（77.42%）和无规则卷曲（17.74%）为主。从江香猪与其他猪源IFN-β基因核苷酸序列同源性为99.5%~100.0%,与禽的同源性最低（35.2%）;从江香猪与巴马猪、梅山猪IFN-β氨基酸同源性均为100.0%,但与贵州白香猪IFN-β同源性为99.5%,存在E43Q、K73R和C161R 3处氨基酸的差异。Western blotting结果显示,带His标签的重组表达蛋白能被His单抗识别,条带大小约为24 ku。本试验结果为进一步研究IFN-β基因生物学活性及加快从江香猪这一品种资源的有效利用提供参考依据。     

香猪3种组织环状RNA的表达及其功能分析

本研究旨在探索环状RNA（circular RNA,circRNA）在香猪皮肤、皮下脂肪及背最长肌的表达及其潜在功能。本研究采用RNA-Seq技术和生物信息学方法,分析香猪皮肤、皮下脂肪及背最长肌circRNA的表达,对3种组织特有circRNA亲本基因进行GO和KEGG富集分析,对样品组织结构功能相关亲本基因中circRNA结合的靶miRNA进行预测。从香猪3种组织表达谱中共鉴定出6 483个circRNAs,皮肤、皮下脂肪及背最长肌分别鉴定出4 575、5 180、5 219个circRNAs,其中特异性表达的分别有83、234、586个;circRNAs在染色体上分布广泛,主要来源于外显子,少数来源于内含子和基因间隔区;多数circRNAs表达量较低;皮肤特有circRNAs的亲本基因主要参与蛋白水解、RNA转运、缝隙连接等过程,其中NF1、MAPK1等亲本基因与皮肤性疾病相关,可能以circRNAs的形式发挥作用,其中亲本基因MAPK1中的circRNA（circ-MAPK1）可结合miR-18a、miR-132、miR-411等,可能参与调控胶原蛋白的形成;皮下脂肪特有circRNAs的亲本基因富集于脂肪细胞生长、发育及癌症等信号通路,ABHD5、PTPN11等亲本基因与脂肪代谢有关,circ-PTPN11结合的miR-103、miR-107、miR-199a-5p等参与调控脂肪细胞增殖、分化及脂质沉积;背最长肌特有的circRNAs亲本基因富集于癌症、感染、肌肉发育等过程,ROCK2、PPP1CC等基因与肌细胞分化及肌肉收缩相关,circ-PPP1CC结合的miR-339、miR-181a、miR-181b等参与调控肌细胞分化、增殖及生长。综上,本研究筛选出的circRNAs及其结合的miRNAs可能参与皮肤胶原蛋白形成、脂肪沉积、肌细胞分化成熟等生物学过程。     

Expression and Function Analysis of Circular RNA in Three Tissues of Xiang Pig

The purpose of this study was to explore the expression and potential functions of circular RNA (circRNA) in the skin,subcutaneous fat,and longissimus dorsi muscle of Xiang pig.In this study,RNA-Seq technology and bioinformatics methods were used to analyze the expression of circRNAs in skin,subcutaneous fat,and longissimus dorsi muscle of Xiang pig,GO and KEGG enrichment analysis were performed for the host genes of three tissue-specific circRNAs,then target miRNA prediction was performed for the circRNAs that host genes associated with tissue structure and function.A total of 6 483 circRNAs were identified from the three tissues of Xiang pig,4 575,5 180 and 5 219 circRNAs were identified respectively from skin,subcutaneous fat and longissimus dorsi muscle respectively,among which 83,234 and 586 circRNAs expressed specifically.circRNAs distributed on chromosomes widely and mainly from exons,a few from introns and intergenic regions.The expression levels of most circRNAs were low.The host genes of skin-specific circRNAs were mainly involved inproteolysis,RNA transport,and gap junctions.Among them,host genes such as NF1 and MAPK1 were related to cutaneous diseases and might play a role in the form of circRNAs.The circRNA (circ-MAPK1) that the host gene MAPK1 could bind to miR-18a,miR-132,miR-411,and which might be involved in regulating the formation of collagen.The host genes of circRNAs expressed specifically in subcutaneous fat were enriched in adipocyte growth,development and cancer signaling pathways.ABHD5 and PTPN11 genes were related to fat metabolism,miR-103,miR-107 and miR-199a-5p bound by circ-PTPN11 could be involved in regulating adipocyte proliferation,differentiation and lipidosis.The host genes of circRNAs only expressed in longissimus dorsi muscle associated with cancer,infection,and muscle development.ROCK2 and PPP1CC were involved in myocyte differentiation and muscle contraction,while miR-339,miR-181a and miR-181b bound by circ-PPP1CC were involved in the regulation of myocyte differentiation,proliferation and growth.In conclusion,the circRNAs selected in this study and their combined miRNAs might be involved in skin collagen formation,fat deposition,and muscle cell differentiation and maturation.