柔嫩艾美耳球虫毒害艾美耳球虫变位艾美耳球虫交叉免疫试验

柔嫩艾美耳球虫毒害艾美耳球虫变位艾美耳球虫交叉免疫试验黄兵，赵其平，何林华，吴薛忠，陈兆国，史天卫（中国农科院上海家畜寄生虫病研究所，２００２３２）鸡感染球虫后会产生一种抵抗再次感染的免疫反应，这种免疫反应具有种的特异性，即感染某种球虫不能保护抵抗另...     

柔嫩艾美耳球虫泛素蛋白功能初步研究

泛素是真核生物中普遍存在的一种小分子蛋白,广泛参与细胞内蛋白质的平衡代谢过程,对维持细胞内环境的稳态具有重要作用.为研究泛素在柔嫩艾美耳球虫中的功能,本研究利用PCR方法克隆了柔嫩艾美耳球虫泛素(EtUb)基因,将其亚克隆至原核表达载体pET28a(+),转入大肠杆菌BL21,诱导表达制备rEtUb蛋白,用纯化的重组蛋...     

柔嫩艾美耳球虫研究概况

本文简要介绍柔嫩艾美耳球虫生活史、生物学特性、卵囊形状、以及卵囊产量的影响因素，对柔嫩艾美耳球虫日龄与粪便卵囊产量进行科学的分析，旨在为疾病的治疗和预防提供依据。     

柔嫩艾美耳球虫含HD结构域蛋白特性和功能初步研究

鸡球虫病是由艾美耳球虫引起的一种危害严重的肠道寄生虫病,每年都会给世界各地的养禽业带来巨大的经济损失。目前,该病主要依靠抗球虫药物进行防治,但由于药物的长期及不合理使用导致鸡球虫几乎对所有使用过的抗球虫药均产生耐药性。为研究球虫耐药性产生的分子机制,本实验室前期对柔嫩艾美耳球虫地克珠利耐药株、马杜拉霉素耐药株以及敏感株进行了转录组测序并获得了敏感株与耐药株的差异表达基因,发现柔嫩艾美耳球虫含HD域蛋白（EtHDCP）在耐药株中上调表达。本研究以柔嫩艾美耳球虫敏感株孢子化卵囊cDNA第一链为模板,成功克隆出EtHDCP基因,构建了原核表达重组质粒pGEX-4T-EtHDCP,并成功诱导表达了重组蛋白rEtHDCP。利用qRT-PCR和Western blot对柔嫩艾美耳球虫敏感株不同发育阶段的转录和翻译水平进行分析,结果显示,EtHDCP在第二代裂殖子的转录和翻译水平高于其他三个阶段（未孢子化卵囊、孢子化卵囊和子孢子）。同时利用Western blot分析了EtHDCP在柔嫩艾美耳球虫敏感株、地克珠利耐药株、马杜拉霉素耐药株中的翻译水平,结果显示,EtHDCP在耐药株中的蛋白翻译水平显著高于敏感株。间接免疫荧光定位结果显示,该蛋白主要定位在子孢子和裂殖子的表面以及裂殖子的胞质内。入侵抑制试验表明,抗rEtHDCP多克隆抗体可有效抑制子孢子对宿主细胞的入侵。这些结果说明该蛋白可能参与了虫体在宿主细胞内的生长发育、耐药性的产生以及子孢子入侵宿主细胞的过程。     

柔嫩艾美耳球虫YL株的生物学特性

用1×103个柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)杨凌株(YL)孢子化卵囊感染7日龄雏鸡,对其潜隐期、最早孢子化时间、卵囊形态及大小、孢子囊大小等生物学特性进行测定。另外,对9、11及13日龄的鸡分别经口感染1×103个E.tenella YL株孢子化卵囊,对肠道病变记分、平均增重、死亡率、血便排放情况等几项指标进行测定,研究同一剂量E.tenellaYL株孢子化卵囊对不同日龄鸡的致病性。结果表明,11日龄的鸡感染后相对增重减少17.7%,病变记分平均达3.0分,9日龄组和13日龄组相对增重分别降低12.0%和17.3%,病变记分分别为2.5分和2.6分。同时测得E.tenella YL株的潜隐期为110h,最短孢子化时间为17h,卵囊大小为22.3~27.7μm×17.1~23.0μm,孢子囊大小为9.9~13.6μm×6.2~7.4μm。     

鸡柔嫩艾美耳球虫和巨型艾美耳球虫双重PCR检测方法的建立

为了建立一种能够快速实现对鸡柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)和巨型艾美耳球虫(E.maxima)同时进行检测的双重PCR方法,基于2种艾美耳球虫各自的ITS-1基因筛选2对特异性引物,对制备的阳性DNA样品进行PCR扩增,凝胶电泳检测结果显示,分别在约450bp和150bp处出现目的条带。对PCR反应中的退火温度、MgCl2浓度、DNA模板量等进行优化。结果表明,当退火温度为59℃、MgCl2浓度为2.5mmol/L、DNA模板量为2μL时,双重PCR扩增结果最佳。特异性检测结果显示,所建立的双重PCR对环形泰勒虫、羊巴贝斯虫、隐孢子虫和蓝氏贾第虫的扩增结果均呈阴性,表明建立的方法具有较高的特异性。成功建立了柔嫩艾美耳球虫和巨型艾美耳球虫双重PCR检测方法,为临床中鸡球虫病的快速诊断提供了一种可靠的检测方法。     

柔嫩艾美耳球虫病毒的鉴定

鸡球虫病是由艾美耳属（Eimeria）的一种单细胞寄生性原虫引起的严重危害养禽业发展的重要疾病之一,遍及世界各地。感染鸡的艾美耳属球虫中,国外已报道在巨型艾美耳球虫（E.maxima）,堆型艾美耳球虫（E.acervu-lina）,毒害艾美耳球虫（E.necatrix）和布氏艾美耳球虫（E.brunetti）中发现了病毒粒子或病毒RNA。但是作为危害最严重的柔嫩艾美耳球虫是否有病毒感染,国内外迄今尚无报道。本研究首次在柔嫩艾美耳球虫中发现病毒并对其进行了鉴定。通过核酸分析、RNA依赖的RNA聚合酶（RDRP）活性和电镜形态观察对病毒进行鉴定。核酸酶的敏感性试验结果表明在柔嫩艾美耳球虫总核酸电泳图谱上观察到的大小分别为1.4、2.4和3.6kb的3条病毒带均不能被DNA酶（100mg/L）降解,但可被RNA酶（1.0mg/L）降解,表明这些核酸为RNA。另外,这些核酸不能被高盐浓度（0.3mol/L NaCl）RNase A（10mg/L）降解,但可被低盐浓度（0.015mol/L NaCl）RNase A（10mg/L）降解,并且采用α-32P标记的UTP掺入法测得该病毒样核酸具有RNA依赖RNA聚合酶（RDRP）活性,表明这些核酸为双链RNA（dsRNA）。利用蔗糖梯度离心和透射电镜技术对柔嫩艾美耳球虫病毒进行了分离和鉴定。电镜负染观察到柔嫩艾美耳球虫病毒粒子外观呈球形,二十面体,无囊膜,直径38nm。     

鸡柔嫩艾美耳球虫西宁株生物学特性研究

为了解柔嫩艾美耳球虫西宁株的生物学特性,采用费勒鹏氏法收集西宁某鸡场鸡粪中的球虫卵囊,经单卵囊收集和繁殖法扩繁柔嫩艾美耳球虫西宁株,并进行了该虫株卵囊形态、卵囊形状指数、孢子化时间、潜隐期和繁殖指数的观察和测定.结果表明,虫株卵囊为长卵圆形,平均大小为20.08 μm×16.55 μm,卵形状指数为1.21,最短孢子化时间为18 h,潜伏期为114 h,每个卵囊的繁殖指数为6.34.以平均增重、病变记分和死亡率为指标进行了该虫株的致病性研究,显示该虫株有致病性,感染组与不感染对照组的体重相比有显著差异(P<0.05),各感染组平均病变记分与不感染对照组的相比,差异极显著(P<0.01).     

1株柔嫩艾美耳球虫ITS-1部分序列测定与分析

根据已发表的柔嫩(Eimeria tenella)、堆型(E.acervulina)、布氏(E.brunetti)、巨型(E.maxima)、和缓(E.mitis)、毒害(E.necatrix)、早熟(E.praecox)艾美耳球虫的ITS-1序列引物,对江苏泰州地区某养鸡场发病鸡粪便中分离的球虫卵囊进行PCR扩增、测...     

柔嫩艾美耳球虫MIF基因克隆及生物信息学分析

【目的】克隆柔嫩艾美耳球虫巨噬细胞迁移抑制因子(macrophage migration inhibitory factor, MIF)基因CDS区,探究其生物信息学特征,为后续抗原表位筛选提供理论依据。【方法】采集晋中地区疑似柔嫩艾美耳球虫感染的阳性样本进行PCR鉴定,根据GenBank中公布的柔嫩艾美耳球虫MIF基因序列,利用RT-PCR技术扩增MIF基因CDS区,构建pET28a-EtMIF重组质粒,经PCR和双酶切鉴定后测序并进行序列分析;利用生物信息学软件对其编码蛋白的理化性质、结构和功能等进行预测。【结果】成功克隆了柔嫩艾美耳球虫MIF基因CDS区序列,全长348 bp,共编码115个氨基酸,相对分子质量为1.203×10⁴。系统进化树结果表明,柔嫩艾美耳球虫MIF基因氨基酸序列与毒害艾美耳球虫的亲缘关系最近,相似性为98.3%。MIF蛋白为非跨膜、可溶性、非分泌型蛋白,亚细胞定位主要在细胞质中,共有10个磷酸化位点;含有1个保守结构域,二级结构由无规则卷曲(35.65%)、延伸链(30.43%)、α-螺旋(27.83%)和β-转角(6.09%)组成,...     

表达M2e-EYFP融合蛋白的转基因柔嫩艾美耳球虫生物学特性分析

本文从卵囊形态大小、潜在期、最短孢子化时间、致病性与免疫原性等生物学特性方面对表达M2e-EYFP融合蛋白的转基因柔嫩艾美耳球虫及其受体野生型柔嫩艾美耳球虫进行了比较分析.结果显示,转基因球虫的上述生物学特性与柔嫩艾美耳球虫种相符,且与其受体野生型球虫具有较高相似性,但也存在部分差异,主要表现在卵囊大小、最小潜在期、繁殖力、致死率和免疫后抑制卵囊产量上.分析原因,作者认为是单孢子囊筛选所致.     

柔嫩艾美耳球虫cDNA文库的构建

用异硫氰酸胍法从孢子化7h的卵囊中提取总RNA，链合成引物用置换合成法合成总cDNA，cDNA与E再用oligo(dT)n-纤维素从总RNA中分离mRNA。mRNA以Not Iolig(dT)15作第一链合成引物用置换合成法合成总cDNA，cDNA用Ecor I Aaptors的连接后，经Not I酶切，再与EcoR I和Not I预切好的λ载体连拉，构建成鸡球虫cDNA文库。     

柔嫩艾美耳球虫石家庄株的生物学特性与抗药性研究

用5×104个柔嫩艾美耳球虫石家庄株孢子化卵囊感染14日龄雏鸡,对卵囊潜隐期、最早孢子化时间、形态及大小等生物学特性进行了测定。并以最适抗球虫活性百分率（POAA）、病变记分减少率（RLS）、相对卵囊产量（ROP）和抗球虫指数（ACI）为指标,检测了常用抗球虫药对其敏感性。结果表明：（1）该虫株寄生于盲肠,呈宽卵圆形,壁光滑,分2层,多数可见极粒。卵囊大小范围为（19.68～27.76）μm×（15.21～23.99）μm,平均大小为（23.41±2.22）μm×（19.34±2.27）μm,卵囊指数1.21。孢子囊大小范围为（8.30～14.28）μm×（4.05～9.15）μm,平均大小为（11.69±1.53）μm×（6.74±1.26）μm,孢子囊指数1.73。潜隐期和最短孢子化时间分别为133h和20h。（2）该虫株对马杜霉素、克球粉与球敌呈完全抗药性;对瑞冠球呈轻度抗药性;而对氨丙啉和金三特无抗药性。     

2株柔嫩艾美耳球虫对5种抗球虫药的抗药性

选择130只21日龄雏鸡，研究了柔嫩艾美耳球虫（E.tenella)南京株和凤阳株对地克珠利（Diclazuril)、马杜霉毒（Maduramicin)、氯羟吡啶（Clopidol)、氯苯胍（Robenidine)和氨丙啉（Amprolium)的抗药性。试验鸡随机分成13组，其中每株球虫均设5个感染用药组，1个感染不用药组，另设1个不感染不用药组，每组10只鸡。以POAA，RLS，ROP，ACI作为指标。结果表明，2株柔嫩艾美耳球虫均对氨丙啉轻度抗药，对地克珠利敏感或轻度抗药，对氯羟吡啶中度抗药。对马杜霉和氯苯胍中度抗药或安全抗药。提示：目前在凤阳地区可合理地使用地克珠利和氨丙啉，对氯羟哟啶应慎用，对马杜霉素和氯苯胍须减少或暂停使用。     

柔嫩艾美耳球虫的抗原分析

本文采用十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳，免疫印渍技术，用抗柔嫩艾美耳球虫抗体分析了第二代型殖子、子孢子和未孢子化卵囊的蛋白质。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳银染表明第二代裂殖子主要蛋白质为：１７．６ＫＤ，２９．９ＫＤ，３８．９ＫＤ和５３．７ＫＤ，但用抗Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ抗体免疫印渍法检测出的主要抗原为：７８．０ＫＤ，８３．２ＫＤ和９５．５ＫＤ，这说明并不是含量高的蛋白质就是产生抗体的抗原；子孢子蛋白质含     

柔嫩艾美耳球虫野外抗药性虫株的RAPD分析

用RAPD方法对柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）的8个分别来源于黑龙江、北京、四川、甘肃和广东的中山、新会、东莞以及广州近郊的江村镇的野外分离虫株和2个药物敏感性虫株进行了遗传多态性分析。同时用9种抗球虫药物即马杜霉素（5mg/kg）、盐霉素（60mg/kg）、莫能霉素（120mg/kg）、拉沙菌素（90mg/kg）、克球多（150mg/kg）、常山酮（3mg/kg）、氯氢苯乙氰（1mg/kg）、尼卡巴嗪（125mg/kg）和球痢灵（125mg/kg）分别对8个野不进行抗药性试验，8个虫株对上述药物均有不同程度的抗药性。RAPD分析表明：10个样品都有相似而清晰的主带，每个泳道有5－13条带不等，大小为0.18-2.10kb。它们之间的相似率（SI）大于40.58%，最大的为90.72%，这种相似率属种内变异水平。根据SI值可把10个样品划分为3个类群：广东虫株类群，群内比较，平均SI值为76.60%；广东省外虫株类群，群内比较的平均SI值72.14%；敏感株类群，其间的SI值为89.27%。在另一方面，广东株与广东省外株、敏感株之间比较，其SI的平均值分别仅为63.03%和47.25%，说明柔嫩艾美耳球虫抗药性虫株之间有遗传差异法。     

鸡球虫病四价活疫苗对毒害艾美耳球虫和柔嫩艾美耳球虫的免疫效果观察

为评价一种商品化鸡球虫病四价活疫苗[柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)、毒害艾美耳球虫(E.necatrix)、巨型艾美耳球虫和堆型艾美耳球虫]对E.necatrix和E.tenella的免疫保护效果,本研究基于试验鸡血便记分、存活率、相对增重率、病变值、卵囊值及抗球虫指数(ACI)等指标对其免疫效果进行检测.结果表明,免疫攻虫组抗E.necatrix和E.tenella的ACI分别为157.3和135.6,均低于160,表明该球虫疫苗抗两种球虫的效果均为低效.然而,免疫攻虫组鸡血便数量、血便记分、增重、卵囊产量和病变记分等指标均优于阳性对照组.综合指标显示,该疫苗对E.necatrix和E.tenella具有一定的免疫保护力,但单纯采用疫苗并不能够达到防控鸡球虫病的目的.     

柔嫩艾美耳球虫YL株抗药性研究

用柔嫩艾美耳球虫杨凌株 ( YL t)对 1 4日龄雏鸡进行感染 ,检测了该虫株对 4种常用抗球虫药 (马杜拉霉素、地克珠利、克球粉和氯苯胍 )的敏感性。以最适抗球虫活性百分率、抗球虫指数、相对卵囊产量和病变记分减少率为指标 ,进行综合评定 ,其抗药程度分为无抗药性、轻度抗药性、中度抗药性和完全抗药性 4个等级。结果表明 ,该虫株对马杜拉霉素有轻度抗药性 ,对地克株利有完全抗药性 ,对克球粉和氯苯胍无抗药性。     

巨型艾美耳球虫和柔嫩艾美耳球虫早熟株对8种抗球虫药的敏感试验

为检测巨型艾美耳球虫和柔嫩艾美耳球虫早熟株对常用抗球虫药的敏感性,选用地克珠利、氯苯胍、二硝托胺、癸氧喹酯、尼卡巴嗪、马杜米星、盐霉素和拉沙洛西等8种抗球虫药进行鸡体试验,通过抗球虫活性百分比（percent of optimum anticoccidial aetivity,POAA）、病变记分减少率（reduction of lesion scores,RLS）、相对卵囊产量（relative oocyst production,ROP）和抗球虫指数（anticoccidial index,ACI）4项指标进行综合评价。结果表明,巨型艾美耳球虫早熟株对8种药物敏感;柔嫩艾美耳球虫早熟株对盐霉素轻度敏感,对地克珠利、氯苯胍、二硝托胺、癸氧喹酯、尼卡巴嗪、马杜米星和拉沙洛西敏感。本研究结果可为对球虫早熟株疫苗的开发与应用提供实验依据。     

柔嫩艾美耳球虫BJ株Et1A基因的克隆及序列分析

本文参照已发表的柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)折光体蛋白基因序列,根据其阅读框及载体序列特点,两端分别加上EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点设计引物,以E.tenellaBJ株的总RNA为模板,进行RT-PCR扩增,成功扩增出Et1A基因。将PCR产物与pGEM-T载体连接后,转化JM109感受态细胞,蓝白斑法筛选阳性克隆并测序。测序表明,该基因全长1978bp,其阅读框大小为1944bp;与GenBank登记的Et1A基因相比较,有6个部位、共7个碱基发生了突变,其中5个有意义突变,2个无意义突变,同源性达99 5%。与堆型艾美耳球虫(E.acervulina)的Ea1A基因的同源性为79 3%,而与牛艾美耳球虫(E.bovis)的同源性只有19 5%。表达产物具有核苷酸转氢酶的功能,推测可为子孢子侵入宿主细胞提供能量。