绵羊miR-127/FOXO4反馈环路及其对卵泡颗粒细胞凋亡相关基因表达的影响

旨在研究oar-miR-127/FOXO4反馈环路及其对绵羊卵泡颗粒细胞的作用。本研究利用Promoter 2.0预测绵羊miR-127启动子,利用JASPAR数据库预测转录因子FOXO4与oar-miR-127启动子区的结合位点,构建包含预测结合位点的pGL3-basic-miR-127荧光素酶报告载体和pcDNA-FOXO4过表达载体;利用TargetScan软件在线预测oar-miR-127与FOXO4基因3'-UTR区结合位点,构建包含预测结合位点的pmir-GLO-FOXO4野生型、突变型和缺失型荧光素酶报告基因重组质粒;将pGL3-basic-miR-127荧光素酶报告载体和pcDNA-FOXO4过表达载体共（或单独）转染体外培养的绵羊卵泡颗粒细胞,FOXO4突变型、野生型和缺失型重组质粒与miR-127 mimic/mimic NC共转染体外培养的293T细胞,48 h后检测荧光素酶活性;pcDNA-FOXO4过表达载体（miR-127 mimic/mimic NC）转染绵羊卵泡颗粒细胞48 h,利用qRT-PCR检测miR-127（FOXO4）及凋亡基因（Casp3、Bax及BCL2）的表达水平。过表达转录因子FOXO4显著降低了oar-miR-127启动子相对荧光素酶活性（P<0.05）和oar-miR-127表达水平（P<0.05）;miR-127 mimic和FOXO4野生型重组质粒共转染的颗粒细胞荧光素酶活性显著低于共转染miR-127 mimic和FOXO4缺失/突变型重组质粒的细胞（P<0.05）。转染miR-127 mimic的颗粒细胞中FOXO4表达量显著降低（P<0.05）,Casp3和Bax基因表达水平极显著升高（P<0.001）;过表达转录因子FOXO4的颗粒细胞中Casp3和Bax的表达水平无显著变化（P>0.05）,但BCL2相对表达量显著降低（P<0.05）。本研究证实了oar-miR-127与靶基因FOXO4间存在反馈环路,并促进绵羊卵泡颗粒细胞的凋亡,为研究其在绵羊卵泡发育中的作用机制奠定了基础。     

CTSD对黔北麻羊卵泡颗粒细胞的调控机制及功能分析

旨在分析组织蛋白酶D（cathepsin D, CTSD）对黔北麻羊卵泡颗粒细胞的调控机制并初步探究其对产羔性状的影响机理。本研究以36周龄、健康、多胎黔北麻羊母羊（n=5）为研究对象,屠宰后采集卵巢组织分离培养卵泡颗粒细胞,构建真核表达载体pEGFP-N3-CTSD,将其导入细胞后在转录与翻译水平验证真核表达效率;通过CCK-8法检测在不同时间段内重组质粒对颗粒细胞增殖的影响;通过流式细胞仪检测重组质粒对颗粒细胞凋亡及周期的影响;随后使用RT-qPCR法在细胞水平检测重组质粒对细胞凋亡相关基因Bcl-2、Bax、Caspase-3,细胞周期相关因子Cyclin A1、Cyclin D2、Cyclin E mRNA表达水平的影响,最后,以多胎性状候选基因BMPR-IB、FSHR、INHA为功能基因,在转录与翻译水平上验证重组质粒对其mRNA与蛋白表达的影响。双酶切及测序结果证实,黔北麻羊CTSD基因真核表达载体pEGFP-N3-CTSD构建成功,且在转录与翻译水平极显著上调CTSD在颗粒细胞中的表达（P<0.01）;细胞增殖检测结果表明,颗粒细胞中上调CTSD后能够抑制细胞的增殖,其中在12、24、48、72 h对细胞增殖的抑制效率达到极显著（P<0.01）;细胞凋亡检测结果表明,CTSD的过表达能够极显著促进颗粒细胞的凋亡（P<0.01）,且能够显著下调细胞抗凋亡基因Bcl-2的表达（P<0.05）,极显著上调细胞促凋亡相关基因Bax、Caspase-3的表达（P<0.01）;此外,细胞周期检测发现,pEGFP-N3-CTSD在转染后能够极显著上调G0/G1期与G2/M期的细胞数量（P<0.01）,极显著下调S期细胞数量（P<0.01）,同时能够极显著提高细胞周期相关因子Cyclin A1的表达（P<0.01）,极显著降低Cyclin D2的表达（P<0.01）。RT-qPCR及Western blot检测结果表明,在颗粒细胞中上调CTSD后,能够极显著的下调多胎性状候选基因与蛋白BMPR-IB、FSHR、INHA在转录和翻译水平中的表达（P<0.01）。本研究发现,CTSD的高表达能抑制细胞的增殖,促进细胞凋亡,改变颗粒细胞的周期进程;还能改变细胞凋亡相关因子Bcl-2、Bax、Caspase-3与细胞周期相关因子Cyclin A1、Cyclin D2、Cyclin E的表达;同时也能够极显著降低颗粒细胞中多胎性状候选基因与蛋白BMPR-IB、FSHR、INHA的表达量（P<0.01）。这提示,CTSD可能通过改变细胞水平相关因子的表达量来调控颗粒细胞的生物学行为以及影响山羊多胎性状候选基因的表达进而间接的成为影响山羊产羔性状的重要因子,本研究为进一步探明CTSD对山羊产羔性状调控机理及对颗粒细胞的影响机制奠定基础。     

miR-145-4调控蛋鸭卵泡发育机制的研究

【目的】 本研究旨在揭示miR-145-4在蛋鸭卵泡发育中的作用及调控机制。【方法】 分离培养蛋鸭卵泡颗粒细胞,转染miR-145-4相似物（mimic）、抑制物（inhibitor）后,利用实时荧光定量PCR法检测细胞增殖凋亡相关基因的表达情况,采用RNAhybrid和Targetscan程序预测miR-145-4的靶基因及其与靶基因磷脂酰肌醇-3-激酶催化亚单位α（phosphatidylinositol-3-kinase catalytic subunit α,PIK3CA）3'-UTR的结合位点,分别构建PIK3CA基因3'-UTR的野生型和突变型双荧光素酶载体,与miR-145-4 mimic和mimic-NC共转染蛋鸭卵泡颗粒细胞后,采用双荧光素酶报告系统验证miR-145-4与靶基因PIK3CA的结合关系,最后采用实时荧光定量PCR法检测miR-145-4对蛋鸭卵泡颗粒细胞中PIK3CA基因表达的影响。【结果】 实时荧光定量PCR结果显示,与对照组相比,过表达miR-145-4后CyclinB2基因的表达量极显著降低（P<0.01）,BCL2基因的表达量极显著增加（P<0.01）;抑制miR-145-4后,CyclinB2基因表达量极显著升高（P<0.01）,BCL2基因表达量极显著降低（P<0.01）。预测结果显示,miR-145-4与PIK3CA基因3'-UTR存在结合位点。PCR扩增和测序结果显示,PIK3CA基因3'-UTR的野生型和突变型载体构建成功。双荧光素酶检测结果显示,与突变型及空载体共转染组相比,野生型组双荧光素酶活性显著降低（P<0.05）,说明miR-145-4能够与PIK3CA基因3'-UTR结合。实时荧光定量PCR结果表明,在蛋鸭卵泡颗粒细胞中过表达miR-145-4后,PIK3CA基因表达量显著降低（P<0.05）,而抑制miR-145-4后,PIK3CA基因表达量极显著升高（P<0.01）。【结论】 miR-145-4通过正向调控靶基因PIK3CA促进蛋鸭卵泡颗粒细胞的凋亡,进而调控蛋鸭的卵泡发育。     

miR-449b对绵羊早期胚胎发育的影响

【目的】研究miR-449b对绵羊早期胚胎发育的影响。【方法】采用Percoll密度梯度离心法获得纯化绵羊精子，将绵羊卵丘-卵母细胞复合体（COCs）在培养箱中培养16~18 h获得成熟卵母细胞，从1月龄纯种萨福克绵羊耳组织分离成纤维细胞，通过实时荧光定量PCR比较绵羊精子、成熟卵母细胞与成纤维细胞中miR-449b的相对表达量；给成熟卵母细胞分别显微注射0.9 %生理盐水（Con组）、miR-449b模拟物对照（NC mimic）与miR-449b模拟物（miR-449b mimic），注射后进行孤雌激活，分别于激活的第2、7天统计胚胎卵裂率与囊胚率；将成熟卵母细胞进行体外受精（IVF），收集IVF、Con、NC mimic与miR-449b mimic组2-细胞胚胎，采用免疫荧光法比较组蛋白H3K9me3的变化。【结果】miR-449b在精子中的表达显著高于成熟卵母细胞和成纤维细胞（P＜0.05）；与Con组相比，miR-449b mimic和NC mimic组胚胎的卵裂率均显著降低（P＜0.05），NC mimic组胚胎卵裂率显著低于miR-449b mimic组（P＜0，05）；miR-449b mimic组胚胎囊胚率提高，但差异不显著（P＞0.05）；IVF、Con、NC mimic与miR-449b mimic组2-细胞胚胎均表达组蛋白H3K9me3，且都在细胞核表达。与Con组相比，NC mimic组2-细胞胚胎组蛋白H3K9me3的表达水平显著增加（P＜0.05），miR-449b mimic组显著降低（P＜0.05）；NC mimic组2-细胞胚胎组蛋白H3K9me3的表达水平显著高于miR-449b mimic组（P<0.05），miR-449b mimic与IVF组无显著差异（P＞0.05）。【结论】miR-449b能显著提高绵羊早期胚胎的发育率，且降低早期胚胎中H3K9me3的表达水平。     

miR-148a-3p靶向PPARγ基因抑制鹅颗粒细胞孕酮的合成

旨在探究miR-148a-3p是否通过靶基因PPARγ调节鹅卵泡颗粒细胞中类固醇激素的合成。本研究选用12只健康的处于产蛋高峰期的天府肉鹅母系母鹅分别用于组织样品采集和颗粒细胞培养。利用qPCR检测miR-148a-3p在鹅不同阶段卵泡颗粒层中的表达;通过MEGA 7软件分析miR-148a-3p在不同物种的保守性,预测miR-148a-3p的靶基因,采用双荧光素酶报告试验验证miR-148a-3p与靶基因的靶标关系;在鹅颗粒细胞中转染miR-148a-3p mimics和inhibitor,qPCR检测miR-148a-3p对靶基因及其下游基因表达水平的影响;同时利用ELISA技术检测激素含量的变化。结果表明,miR-148a-3p在不同物种中高度保守;在鹅卵泡发育过程中,miR-148a-3p的表达量随卵泡直径的增加呈先升高后下降的趋势。在鹅卵泡颗粒细胞体外培养过程中,miR-148a-3p mimics能显著下调3β-HSD的表达（P<0.05）,抑制孕酮的合成（P<0.05）;而miR-148a-3p inhibitor的作用则相反（P<0.05）。生物信息学分析和双荧光素酶报告试验证实,PPARγ为miR-148a-3p的靶基因。在颗粒细胞中,miR-148a-3p mimics能显著降低PPARγ的表达（P<0.05）,而miR-148a-3p inhibitor能显著上调PPARγ的表达（P<0.05）。当干扰PPARγ后,3β-HSD的表达量显著降低（P<0.05）,孕酮的含量也降低。这些结果表明,在鹅等级卵泡颗粒细胞中,miR-148a-3p可靶向结合PPARγ来抑制3β-HSD的表达,从而降低颗粒细胞孕酮的合成。     

WNT2在绵羊卵泡颗粒细胞的表达及功能研究

旨在探究WNT2在绵羊卵泡颗粒细胞（GCs）中的表达及功能。本研究选取4~6月龄健康母羊20只,采集双侧卵巢,免疫组化技术检测WNT2蛋白在卵泡中的表达定位;qRT-PCR及Western blot技术检测其在不同发育阶段卵泡颗粒细胞中的表达差异;siRNA沉默GCs中的 Wnt2基因后,qRT-PCR技术检测Wnt2基因及参与经典WNT信号通路关键基因CTNNB1的相对表达量,并测定GCs凋亡情况。结果表明：1）WNT2蛋白在绵羊卵泡内膜细胞、颗粒细胞以及卵丘细胞内均有表达。2）qRT-PCR及Western blot结果基本一致,均表明Wnt2 mRNA及蛋白在不同发育阶段卵泡颗粒细胞表达差异显著（P<0.05）,且在大卵泡颗粒细胞内表达量显著高于中卵泡颗粒细胞（P<0.05）,中卵泡颗粒细胞内表达量显著高于小卵泡颗粒细胞（P<0.05）。3）基因沉默后,沉默组Wnt2和CTNNB1的表达量均显著低于无义序列siRNA组（NC组）以及空白对照组（P<0.05）,而Wnt2基因沉默组细胞凋亡率显著高于其他两组（P<0.05）。综上表明,WNT2是通过WNT2/CTNNB1信号通路促进绵羊卵泡颗粒细胞生物学功能的。     

利巴韦林对猫细小病毒感染诱导F81猫肾细胞中凋亡相关基因表达的影响

试验将F81猫肾细胞随机分为对照组、药物组(猫细小病毒(FPV)+利巴韦林)、病毒组(FPV感染),采用实时荧光定量PCR的方法,检测Bcl-2、Bcl-xl、Bax和Caspase 3等凋亡相关基因的相对表达量。结果显示,与对照组相比,病毒组细胞凋亡增加,抗凋亡基因Bcl-2 mRNA表达受到抑制,Bax mRNA和 Caspase 3 mRNA的相对表达量均有不同程度的上调。药物组细胞的抗凋亡基因Bcl-2和Bcl-xl的表达水平显著高于病毒组(P<0.05),且总体呈上调状态,但72 h时Bcl-xl表达量减少;而药物组的促凋亡基因Bax和Caspase 3的表达量显著低于病毒组(P<0.05),48 h前,Bax 的表达量呈递减状态,72 h时检测结果显示药物组Bax表达量相比对照组显著上调(P<0.05),但仍显著低于病毒组(P<0.05);与对照组相比,病毒组和药物组Caspase 3的表达量在72 h时显著上调(P<0.05)。综上所述,利巴韦林可在基因水平通过上调抗凋亡基因Bcl-2和Bcl-xl和下调促凋亡基因Bax和Caspase 3的表达来抑制FPV感染诱导的F81猫肾细胞凋亡发生。     

日粮添加不同水平芦丁对热应激小鼠睾丸组织的影响

本试验旨在探讨日粮添加不同水平芦丁对缓解热应激小鼠睾丸组织损伤的影响。将30只5周龄体重相近（20～22 g）的ICR系雄性小鼠随机分为5组,各组小鼠分别饲喂基础日粮添加0（CON组）、0（HS组）、250（HS+R250）、500（HS+R500）和1 000（HS+R1000） mg·kg^-1芦丁的日粮,饲养10 d后,除对照组（CON）外,所有小鼠在每天10：00至14：00之间置于42℃恒温箱中连续处理8 d后屠宰取样分析。结果显示：1）与CON组相比,HS组小鼠睾丸指数无显著变化（P>0.05）,而日粮添加250 mg·kg^-1芦丁显著提高热应激小鼠睾丸指数（P<0.05）;小鼠睾丸组织切片结果显示,与CON组相比,HS组小鼠生精小管直径和横截面积显著降低（P<0.05）,生精细胞脱落比率显著增加（P<0.05）;与HS组相比,HS+R250组小鼠生精小管横截面积显著增加（P<0.05）,生精细胞脱落比率显著降低（P<0.05）,HS+R500组生精细胞脱落比率也显著降低（P<0.05）,HS+R1000组小鼠生精小管直径显著增加（P<0.05）;小鼠睾丸指数、生精小管直径及生精小管脱落比率在芦丁处理组与CON组之间无显著差异（P>0.05）,但HS+R250组小鼠睾丸生精小管横截面积显著高于CON组（P<0.05）。2）与CON组相比,HS组小鼠睾丸组织丙二醛（MDA）含量显著升高（P<0.05）,总抗氧化能力（T-AOC）与还原型谷胱甘肽（GSH）含量以及血红素酶-1（HO-1） mRNA的表达量均显著降低（P<0.05）;日粮添加250 mg·kg^-1芦丁显著降低热应激小鼠睾丸组织中MDA含量（P<0.05）,提高T-AOC与GSH含量（P<0.05）,并增强核因子E2相关因子2（Nrf2）、HO-1和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px） mRNA的表达量（P<0.05）,而添加500和1 000 mg·kg^-1芦丁也显著提高了GSH含量（P<0.05）;与CON组相比,除HS+R250组Nrf2 mRNA表达量显著高于CON组（P<0.05）外,芦丁组热应激小鼠睾丸组织抗氧化相应基因与酶活指标均无显著性变化（P>0.05）。3）热应激小鼠睾丸中核因子-κB （NF-κB）、TOLL样受体4（TLR-4）和Bax的mRNA表达量显著增加（P<0.05）,而Bcl-2表达量显著降低（P<0.05）;日粮添加250 mg·kg^-1芦丁显著降低NF-κB、TLR-4、髓样分化因子88（MyD88）、白细胞介素-Iβ（IL-1β）和Bax mRNA表达量（P<0.05）,增强Bcl-2的表达水平（P<0.05）;添加500 mg·kg^-1芦丁显著降低NF-κB和TLR-4表达量（P<0.05）,而1 000 mg·kg^-1芦丁能够显著增加Bcl-2的表达（P<0.05）;小鼠睾丸组织中免疫和增值凋亡相关基因的表达量在添加芦丁组及CON组之间无显著性差异（P>0.05）。结果提示,日粮添加适宜剂量芦丁具有改善热应激小鼠睾丸组织形态及功能的效果,其机制可能与芦丁通过Nrf2信号通路缓解氧化应激,通过TLR-4/NF-κB信号通路抑制炎症反应及调控Bax/Bcl-2 mRNA的表达密切相关。本试验条件下日粮添加250 mg·kg^-1芦丁的效果较好。     

miR-138靶向PGC-1α调控牦牛肌内前体脂肪细胞增殖及分化

旨在分析miR-138在牦牛前体脂肪细胞分化过程中的调控作用。本研究设计合成miR-138 mimics和inhibitor以对细胞进行miR-138过表达及抑制表达,并通过油红O染色分析miR-138对牦牛肌内前体脂肪细胞脂质沉积的影响;利用CCK-8、划痕和流式细胞技术分析miR-138对细胞增殖的影响;通过对bta-miR-138进行生物信息学分析,筛选其在脂质沉积过程中的相关潜在靶基因;利用RT-qPCR测定miR-138潜在靶基因mRNA表达水平,并通过双荧光素酶报告试验确定靶向关系。结果显示,过表达miR-138后,细胞内脂滴沉积水平显著低于对照（NC）组（P<0.01）,而抑制miR-138表达则显著增强脂肪细胞脂质沉积（P<0.01）;RT-qPCR结果表明,过表达miR-138可显著抑制脂肪分化标志基因PPARγ和c/EBPα的表达（P<0.01）,抑制miR-138则上调PPARγ和c/EBPα表达水平（P<0.05）;此外,过表达miR-138后,潜在靶基因PTPN11、CREB1和ADCYAP1R1表达水平显著下调（P<0.05）,而PGC-1α和SNAP25表达极显著下调（P<0.01）;抑制miR-138后MXLIP和SNAP25表达显著上调（P<0.05）,PGC-1α和PTPN11表达极显著上调（P<0.01）;CCK-8和划痕试验结果表明,过表达miR-138后24~36 h,细胞增殖活性显著低于对照组（P<0.05）,而抑制miR-138则表现为细胞增殖活性增强;流式分析结果显示过表达miR-138后,细胞出现G1-S期阻滞,细胞周期相关基因CCND1、CCNB1和增殖标志基因Ki67的mRNA表达显著降低;生物信息学分析预测获得263个miR-138公共靶基因,KEGG富集结果显示靶基因主要参与“轴突导引”、“胰岛素抵抗”、“胰岛素分泌”及“RNA降解”等通路,GO分析主要富集于“RNA聚合酶Ⅱ启动子对转录的正向调控”、“核染色质”、“染色质DNA结合”和“I型肺细胞分化”等功能;双荧光素酶报告试验结果显示,共转染miR-138 mimics和PGC-1α-Wt-PGL3-basic可显著降低细胞荧光强度（P<0.01）。以上结果表明,miR-138可通过靶向结合PGC-1α 3'UTR序列,降低PGC-1α的mRNA表达水平,抑制牦牛肌内前体脂肪细胞分化和脂质沉积,降低细胞增殖活性。本研究为阐明牦牛肉质性状的潜在分子机制提供参考。     

不同浓度GnIH对鸭颗粒细胞周期和增殖的影响

为了研究不同浓度GnIH对鸭颗粒细胞周期、增殖及相关基因表达的影响.本研究分别用不同浓度GnIH(0、0.1、1、10和100 ng ? mL-1)处理体外培养的鸭颗粒细胞24 h(n=3),观察细胞的生长状态,通过流式细胞术和EdU方法检测细胞周期和细胞增殖,并用qRT-PCR方法检测增殖相关基因CDK6、Cycli...     

可变剪接体WNT4-β对山羊卵泡颗粒细胞增殖和激素分泌的影响

旨在研究WNT4的一个可变剪接体（WNT4-β）对山羊卵泡颗粒细胞增殖的影响。本研究选取4~6月龄健康母羊20只,采集双侧卵巢,体外分离卵泡颗粒细胞进行培养。通过免疫荧光染色技术确定WNT4-β的表达位置;在山羊颗粒细胞中过表达或干扰WNT4-β后,利用RT-qPCR、Western blot检测WNT4-β和WNT信号通路中关键标记因子ROA1、RHOA及颗粒细胞增殖标记基因cyclin-D2、CDK4的表达变化;CCK-8技术检测颗粒细胞增殖情况;并通过ELISA分析颗粒细胞中生殖激素水平的变化。免疫荧光染色结果显示,WNT4-β只在山羊卵泡颗粒细胞中表达,在卵母细胞不表达;过表达WNT4-β后,WNT4-β和颗粒细胞增殖因子cyclin-D2、CDK4的mRNA相对表达量极显著增加（P<0.01）,蛋白表达水平显著增加（P<0.05）;WNT信号通路标记因子ROA1、RHOA mRNA表达水平显著增加（P<0.05）,β-catenin蛋白表达水平显著增加（P<0.05）;干扰WNT4-β后,WNT4-β、cyclin-D2、CDK4、ROA1和RHOA 的mRNA表达显著降低（P<0.05）,WNT4-β、cyclin-D2、CDK4及β-catenin蛋白表达显著降低（P<0.05）。CCK-8结果显示,过表达WNT4-β促进颗粒细胞增殖（P<0.05）;ELISA结果显示,过表达WNT4-β后,颗粒细胞中雌二醇（estradiol,E₂）水平显著增加（P<0.05）,孕酮（progesterone,P₄）水平升高但不显著（P>0.05）;干扰WNT4-β后则结果相反,颗粒细胞增殖受到抑制（P<0.05）,E₂和P₄的水平显著降低（P<0.05）。综上所述,WNT4可变剪接体WNT4-β通过调控WNT信号通路促进山羊卵泡颗粒细胞增殖及类固醇激素分泌,本研究为解析WNT4调控山羊颗粒细胞增殖的潜在分子机制提供理论基础。     

鸡软骨细胞体外分离培养鉴定以及过表达miR-15a对软骨细胞的影响

为分析miR-15a在肉鸡不同组织中的表达情况,并探究过表达miR-15a对体外培养鸡软骨细胞的影响。本研究首先通过倒置显微镜观察、PCR、凝胶电泳和甲苯胺蓝染色对体外分离培养的软骨细胞进行鉴定。通过实时荧光定量PCR检测miR-15a在肢体内外翻畸形(valgus-varus deformity, VVD)组和健康组肉鸡中(各3只)各组织的表达量。之后通过CCK8和EDU方法分析软骨细胞过表达miR-15a后细胞增殖情况。软骨细胞转染miR-15a mimics后,通过qPCR检测软骨细胞的标志基因Collagen-2、Aggrecan、Collagen-10,成熟分化基因Runx2、Sox9、VEGF、MMP9,炎性因子IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α、TGF-β3以及凋亡基因Fas、FasL、Bcl-2的表达量。并构建FKBP5 3'UTR的野生型载体和突变型载体,通过双荧光素酶检测报告检测miR-15a与FKBP5的靶向关系。结果表明,本研究所用的胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶和透明质酸酶联合消化法成功分离得到状态良好的软骨细胞。荧光定量结果显示,miR-15a在各组织中均有表达,与健康组相比,miR-15a在VVD组的肝(P < 0.01)、脾(P < 0.05)、胸腺(P < 0.01)中的表达量显著升高,在心和胸肌组织中的表达量显著降低(P < 0.01)。CCK8与EDU分析结果显示,与NC组相比,过表达miR-15a组软骨细胞增殖速度显著降低(P < 0.01),增殖细胞数量显著减少(P < 0.01)。qPCR结果显示,与mimics NC组相比,miR-15a mimics组的软骨细胞标志基因Aggrecan、成熟分化基因Sox9、Runx2表达量显著降低(P < 0.05),Fas基因表达量极显著上升(P < 0.01),FasL基因和抗凋亡基因Bcl-2极显著下降(P < 0.01)。成功构建了FKBP5 3'UTR野生型和突变型载体,双荧光素酶检测报告结果显示预测的靶基因FKBP5与miR-15a没有靶向关系。本研究成功分离并鉴定了鸡软骨细胞,过表达miR-15a抑制鸡软骨细胞增殖、成熟和分化并促进细胞凋亡。     

高压均质鸡蛋卵黄对猪冷冻精子凋亡的影响

为探究高压均质鸡蛋卵黄对猪冷冻精子凋亡的影响，本试验采集5头健康状态良好的杜洛克公猪精液，以普通鸡蛋卵黄+Tris-柠檬酸-葡萄糖（TCG）冷冻基础稀释液为对照组，以添加高压均质处理的鸡蛋卵黄+Tris-柠檬酸-葡萄糖（TCG）冷冻基础稀释液为试验组；精液冷冻-解冻后观察精子活力、DNA完整性、线粒体膜电位变化、细胞凋亡率、多种Caspase活性；同时利用qRT-PCR检测相关凋亡功能基因的mRNA表达水平，并进行数据统计。结果表明，经高压均质处理后，猪精子冻后活力、活率和顶体完整率显著高于对照组（P<0.05），为87.64%、87.14%和66.61%，较对照组分别提高了12.58%、5.82%和12.48%；线粒体膜电位和DNA完整率显著高于对照组（P<0.05），为0.74和61.76%；精子凋亡水平显著减少（P<0.05），为37.74%；试验组的Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9活性为17.15、11.19和15.18，较对照组分别减少了6.17、2.18和3.51（P<0.05）；对照组的Bax、TNF-α、Caspase-9基因表达均明显高于试验组（P<0.05），Bcl-2基因表达量较试验组降低（P>0.05）。综上，高压均质鸡蛋卵黄能提高猪精子冻后质量，促进线粒体功能完整性、降低精子细胞早期凋亡水平和细胞内Caspase活性，同时降低凋亡相关基因mRNA表达量。