天然植物成分调控gasdermin家族在细胞焦亡中的作用

细胞焦亡是由gasdermin(GSDM)家族介导的细胞程序性死亡方式。细胞焦亡在炎症性肠病(IBD)中发挥着重要作用。GSDM家族成员在肠道炎性疾病中被激活并诱导细胞焦亡,因此GSDM家族可能是调节IBD信号通路的关键蛋白。具有抗炎功能的部分天然植物成分可调控GSDM家族成员的表达,进而调控细胞焦亡,减轻炎性症状。本文综述了天然植物成分调控GSDM家族在细胞焦亡中的作用,旨在为畜禽肠道疾病的防治和畜禽健康养殖提供新思路。     

致病细菌诱发细胞焦亡研究进展

细胞焦亡(pyroptosis)是一种新发现的促炎性细胞程序性死亡方式。炎性小体和半胱天冬酶在细胞焦亡发生的过程中起着重要作用。细胞焦亡主要依赖半胱天冬酶1(caspase-1)、半胱天冬酶4(caspase-4)、半胱天冬酶5(caspase-5)及半胱天冬酶11(caspase-11)也可以介导。致病细菌刺激细胞内模式识别受体激活炎性小体形成,依赖于caspase-1的经典焦亡途径和依赖于caspase-4、caspase-5、caspase-11的非经典焦亡途径启动诱发细胞焦亡。细胞焦亡的形态特征以发生机理与凋亡、坏死存在着差异。论文主要对细胞焦亡的形态学特征、发生机制及致病细菌诱发的焦亡进行综述,以期为进一步研究细胞焦亡提供理论基础。     

细胞焦亡参与肾脏损伤分子机制研究进展

细胞焦亡是受外界环境刺激而诱发细胞程序性炎性死亡的一种方式,此过程依靠Caspase-1/4/5/11的过表达。已有研究表明,细胞焦亡与许多疾病密切相关,如急性肾损伤、糖尿病肾病和肾结石等。从机制上出发,调节细胞焦亡有2种途径,一条由经典通路Caspase-1调控,另一条由非经典通路Caspase-4/5/11调控。大量研究证实细胞焦亡参与肾病的生理过程。该文着重介绍细胞焦亡与肾脏损伤分子机制进行概述,为肾脏疾病的防治和研发特效药提供新的思路。     

细胞焦亡的分子机制及其营养调控

细胞焦亡即炎症坏死,是当前几种常见的细胞死亡方式之一,其与炎症反应密切相关,参与多种疾病的发生,在机体免疫应答过程中发挥重要作用。目前对于细胞焦亡的分子机制研究较为成熟,本篇综述结合近些年国内外在细胞焦亡方面最新的研究进展,阐述了细胞焦亡的经典途径与非经典途径,并介绍了多种营养物质对细胞焦亡途径中关键因子的营养调控作用,以期为细胞焦亡相关病症的防治提供新思路。     

BCG感染巨噬细胞后内质网应激对细胞焦亡的调控作用

旨在探讨牛分枝杆菌疫苗株卡介苗（Bacillus Calmette-Guérin,BCG）感染人单核巨噬细胞THP-1细胞后内质网应激（endoplasmic reticulum stress,ERS）对细胞焦亡的调控作用及分子机制。在BCG单独感染THP-1细胞或与ERS抑制剂TUDCA共处理细胞后,采用qRT-PCR检测ERS标志性分子GRP78,细胞焦亡标志性分子GSDMD、Caspase1、NLRP3、IL-1β和IL-18在mRNA水平的表达,采用Western blot检测GRP78、Caspase12、GSDMD、Caspase1和NLRP3在蛋白水平的表达,采用ELISA检测IL-1β和IL-18的释放量,采用CCK-8检测细胞存活率。结果表明：在BCG单独感染THP-1细胞不同时间后,GRP78在mRNA水平和蛋白水平的表达均随感染时间延长而升高（P<0.01）,GSDMD蛋白表达在24 h达到最高,IL-1β和IL-18在mRNA水平的表达呈时间依赖性（P<0.01）。在BCG单独感染或与TUDCA共同作用细胞24 h后,与未感染对照组相比,BCG感染组GRP78、GSDMD、Caspase1、NLRP3、IL-1β和IL-18 mRNA水平表达上调（P<0.05）,GRP78、Caspase12、GSDMD、Caspase1和NLRP3蛋白水平表达上调（P<0.001）,IL-1β和IL-18的浓度增加（P<0.01）,细胞存活率下降（P<0.001）,而经TUDCA预处理的BCG感染组与BCG单独感染组相比,以上分子的表达下降,细胞存活率上升（P<0.01）。综上表明,在BCG感染THP-1细胞后,引起的ERS对细胞焦亡具有调控作用。     

致病性大肠杆菌HPI对Caspase-1细胞焦亡相关分子表达的影响

为研究云南撒坝猪致病性大肠杆菌高致病性毒力岛（HPI）致猪源巨噬细胞焦亡的分子机制,本试验以云南撒坝猪致病性大肠杆菌HPI阳性株感染猪源巨噬细胞为切入点,从云南楚雄州某规模养殖场采集撒坝猪仔猪黄白痢的粪便,对大肠杆菌进行分离纯化,并通过PCR技术对HPI irp2基因进行检测,分别以HPI阳性株（HPI⁺）和阴性株（HPI^-）感染巨噬细胞,并设立LPS+ATP组和空白对照组,于0.5和6 h收集各组细胞及其上清。应用实时荧光定量PCR法检测不同组Caspase-1、IL-1β和IL-18 mRNA表达水平的变化;应用ELISA检测细胞上清pro-IL-1β、pro-IL-18、IL-1β和IL-18含量的变化。结果显示,试验成功分离得到致病性大肠杆菌,经PCR检测成功获得HPI irp2基因阳性株,经实时荧光定量PCR法检测后发现HPI⁺组、HPI^-组与空白对照组相比,Caspase-1、IL-1β和IL-18 mRNA表达水平均呈上调趋势,且HPI⁺组高于HPI^-组。ELISA检测结果显示,与空白对照组相比,HPI⁺组和HPI^-组pro-IL-1β、pro-IL-18、IL-1β和IL-18的蛋白表达量普遍呈上调趋势,且HPI⁺组均高于HPI^-组。结果表明,云南撒坝猪致病性大肠杆菌HPI可通过上调猪源巨噬细胞中Caspase-1、IL-1β和IL-18 mRNA的表达量促进猪源巨噬细胞炎性因子IL-1β和IL-18的释放,诱发炎症,最终促进猪源巨噬细胞发生细胞焦亡。     

伪狂犬病病毒对小鼠脾脏细胞焦亡相关因子表达的影响

为了研究感染猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus, PRV)对小鼠脾脏细胞焦亡相关因子的影响,试验将40只Balb/c小鼠随机分为对照组和试验组(包括48小时组、72小时组、96小时组),试验组小鼠皮下接种1×10³ TCID₅₀/100μL PRV 200μL,对照组小鼠注射等量生理盐水。采集小鼠脾脏,采用酶联免疫吸附试验检测脾脏组织中白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和白细胞介素-18 (interleukin-18,IL-18)水平;分别采用实时荧光定量PCR和Western-blot方法,检测细胞焦亡相关因子核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)、天冬氨酸蛋白水解酶1(Caspase-1)、Gasdermins家族蛋白D(GSDMD)、IL-1β和IL-18基因和蛋白表达水平;采用免疫组织化学方法检测脾脏组织中Caspase-1和IL-β蛋白表达量。结果表明：与对照组相比,48,72,96小时组脾脏组织中IL-1β极显著升高(P<0.01);48小时组IL-18显著升高(P&l...     

NLRP3炎症复合体的体外构建

为体外构建NLRP3炎症复合体,利用PCR方法扩增目的基因NLRP3、IL-1β、ASC和Pro-Caspase-1,分别连接到相应的载体中,构建重组真核表达质粒p3XFLAG-NLRP3、pEGFP-C1-ASC、pEGFP-C1-IL-1β、PCI-CASP-HA,利用Lipofectamine2000试剂转染到HEK293T细胞后,采用Western blot方法验证各蛋白的表达情况;通过质粒共转染体外构建NLRP3炎症复合体,采用ELISA方法检测IL-1β生成情况。结果显示,3XFLAG-NLRP3、pEGFP-C1-ASC、pEGFP-C1-IL-1β、PCI-CASP-HA重组质粒均被成功构建,各蛋白于HEK293T细胞内均被成功表达;质粒共转染后ELISA检测到高水平的IL-1β生成,表明NLRP3炎症复合体体外构建成功。NLRP3炎症复合体在体外的成功构建,为进一步研究其激活机制奠定了基础。     

镉对鸭破骨细胞焦亡的影响

为探讨镉暴露对鸭破骨细胞焦亡的影响,本试验用不同浓度的镉(0,5和10μmol/L)处理鸭破骨细胞12 h。通过显微镜观察破骨细胞形态变化,ELISA试剂盒检测IL-1β和IL-18的含量,流式细胞术检测破骨细胞焦亡,Hoechst和PI染色观察细胞核数量变化。结果显示,镉暴露后鸭破骨细胞表现出明显的形态改变,主要表现为细胞肿胀,细胞膜可见大量孔洞。与对照组相比,镉暴露明显增加了鸭破骨细胞内LDH的释放,细胞因子IL-1β和IL-18的产生也显著升高(P<0.01)。Caspase-1的活性较对照组显著增加(P<0.01),FITC和PI双染的阳性破骨细胞数也明显升高(P<0.01)。Hoechst和PI染色结果表明,镉暴露明显增加了红色和蓝色荧光强度。上述结果表明,镉暴露可诱导鸭破骨细胞发生焦亡。     

长期高铜暴露通过影响线粒体自噬和细胞焦亡诱导大鼠肝组织损伤

旨在探索高铜对大鼠肝组织损伤的作用机制。试验选取120只SD大鼠随机分为对照组、高铜I组、高铜II组、高铜III组和高铜IV组,分别连续每天按体重灌胃0、20、40、80、160 mg·kg^-1铜63 d,采集肝组织。使用ICP-MS测定肝组织铜含量,病理切片观察肝组织病理变化,透射电镜观察线粒体形态和线粒体自噬小体,RT-qPCR和Western blot检测肝组织NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18、Pink1、Parkin、LCB3、p62的mRNA和蛋白表达水平。结果显示,随着灌胃铜水平的增加,蓄积在肝组织中的铜含量呈剂量依赖性增加,且长期高水平铜暴露会造成明显的肝组织结构破坏;随着铜暴露水平的增加,线粒体自噬和细胞焦亡水平呈先上升后下降趋势;与对照组相比,高铜Ⅱ组、Ⅲ组中PINK1和LC3II/LC3I的mRNA和蛋白表达水平显著上升(P＜0.05),高铜Ⅱ组中p62的mRNA和蛋白表达水平显著降低(P＜0.05),高铜Ⅲ组NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β的mRNA和蛋白表达水平显著上升(P＜0.05),高铜IV组表现为下调。高铜长期暴露可通过影响线粒体自噬和细胞焦亡诱导大鼠肝组织损伤。     

猪孕烷X受体基因真核表达载体的构建与表达

为构建猪的孕烷X受体(PXR)基因真核表达质粒,用RT-PCR技术从新鲜猪肝中扩增到猪孕烷X受体(pgPXR)基因,将其连接到真核表达载体pCI-neo中,得到重组质粒pCI-pgPXR。对该重组质粒进行PCR、测序及酶切鉴定后,采用脂质体法将其转染到人肝癌细胞HepG2细胞,用RT-PCR和双荧光素酶检测系统进行鉴定。结果表明,猪孕烷X受体基因真核表达质粒pCI-pgPXR构建成功,可在HepG2细胞中表达,为猪孕烷X受体的药理学和毒理学研究奠定了基础。     

GnRH-6与麦芽糖结合蛋白的融合表达及鉴定

将人工合成的哺乳动物型GnRH六聚体基因插入原核表达质粒pMAL-c2中,重组质粒转化到大肠埃希菌BL21中,采用IPTG进行诱导表达,用多糖树脂亲和层析法纯化蛋白,用SDS-PAGE对纯化蛋白进行分析,用间接ELISA方法鉴定融合蛋白的反应原性.结果表明,与麦芽糖结合蛋白基因融合的GnRH六聚体基因在大肠埃希菌BL21中能够高效表达;用多糖树脂进行亲和层析纯化蛋白,具有良好的纯化效果;表达的融合蛋白分子质量大小与理论值一致,且融合蛋白与GnRH抗体的反应较好.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白基因的原核表达及纯化

利用含有PRRSV N蛋白基因的重组表达质粒pREST-N的大肠埃希菌,在37℃条件下,用终浓度为1 mmol/L的IPTG进行诱导表达,经SDS-PAGE分析,目的基因高效表达出分子质量约为17.8 ku的可溶性融合蛋白,分子质量与预期设计的N蛋白大小相符。经His-Ni2+柱亲和层析纯化后,得到了高纯度的N蛋白。通过Western blot分析,该重组N蛋白与兔抗PRRSV高免血清能够发生特异性反应,说明其具有良好的反应原性,为进一步研究PRRSV的抗体检测方法及诊断抗原的批量生产工艺奠定了基础。     

饲用枯草芽孢杆菌表达系统研究进展

枯草芽孢杆菌是一种广泛应用于畜牧业生产的革兰氏阳性菌。随着现代生物技术的发展,利用重组枯草芽孢杆菌生产饲用酶、饲用活性代谢产物以及作为肠道益生茵成为热点研究领域。枯草芽孢杆菌表达系统是重组枯草芽孢杆菌的核心,论文对枯草芽孢杆菌表达系统的研究进展与存在问题进行了简要综述。     

减毒沙门菌介导的apo-tPA融合基因在鸡体组织的分布与表达

探讨以减毒沙门菌为载体,介导外源基因在动物体内的组织分布和表达的可行性。将编码人t-PA功能区的基因片段与鸡VLDLy组装前体apo-B100基因融合,定向克隆到荧光蛋白表达载体SV40启动子下游,构建pApo-tPA-GFP表达质粒。应用电转化法将pApo-tPA-GFP表达质粒转化减毒沙门菌,阳性减毒沙门菌经翅下静脉注入鸡体内,分别于注射后第1、2、3、4、5周随机剖检试验用鸡,无菌取内脏器官,经组织细菌培养、RT-PCR检测各脏器中基因分布,涂片荧光镜检基因表达情况。结果显示,在肝脏、脾脏和十二指肠均分离到沙门菌,PCR鉴定均为减毒沙门菌载体;RT-PCR检测在肝脏、脾脏、十二指肠中有目的基因存在;荧光检测在肝脏、脾脏中有荧光蛋白。结果表明,减毒沙门氏菌能够作为载体将目的基因有效的转入到动物体内,这一方法有望为动物转基因提供便捷、有效的途径。     

白喉毒素DAB389-aMSH重组毒素的构建及表达

摘要:利用含有白喉毒素N端序列的基因作上游引物、含有aMSH全序列作下游引物,以pET28a/DAB389-EGF为模板,PCR扩增DAB389-aMSH基因片段,用限制性内切酶EcoR I和Nco I酶切,并插入原核表达载体pET28a的相应位点,构建了重组表达载体pET28a/DAB389-aMSH,在大肠杆菌中表达重组融合蛋白DAB389 -aMSH,转化菌经1mmol/L IPTG、30C诱导5h,用SDS-PAGE 和Western blot 鉴定表达的重组毒素质。结果表明扩增的片段与理论值一致。重组质粒的DNA序列分析正确。SDS-PAGE表明,重组毒素相对分子量为43.76KD,且表达量达菌体总蛋白量的31.6%左右。Western blot分析显示,重组毒素能特异性地与抗白喉抗体结合,表明已成功构建表达了重组DAB389-aMSH的工程菌株,表达产物具有生物学活性。     

皮蝇素A基因的克隆及其毕赤酵母表达载体的构建

提取采自甘肃玛曲皮蝇一期幼虫的总RNA,合成cDNA,根据设计的特异引物,利用PCR技术扩增出皮蝇素A(Hypodermin A,HA)基因片段,用Xho Ⅰ、Xba Ⅰ消化,将消化后的目的基因HA纯化并回收,与经同样的酶消化后并纯化回收的裁体pPICZa连接并转化,获得重组表达质粒pPICZa-HA,经PCR、酶切、测序表明,目的基因插入位置、方向和阅读框正确.