成年牦牛皮肤中血管与神经的组织学观察及HIF-1α在皮肤中的表达

本研究旨在探讨牦牛不同部位皮肤内血管和神经的分布情况,及检测低氧诱导因子-1α（HIF-1α）在不同部位皮肤上的定位及相对表达量,探究牦牛皮肤对高原低氧环境的适应机制。采用HE、Masson’s三色和Verhoeff VG染色法,对成年牦牛皮肤内血管和神经结构进行观察与分析;采用免疫组织化学、实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹法,对HIF-1α的mRNA和蛋白在成年牦牛皮肤组织中表达与分布进行研究。结果表明,颈部血管与神经密度最高,前臂部和小腿部次之,跖部最低,部位间差异显著（P<0.05）。HIF-1α主要表达在表皮层、毛囊的上皮根鞘、皮脂腺、汗腺、血管、神经;颈部、前臂部和小腿部强阳性表达,跖部阳性表达。HIF-1α mRNA的相对表达量跖部明显低于其他部位（P<0.05）,其他三个部位两两比较差异不显著（P>0.05）。HIF-1α蛋白相对表达量颈部最高,跖部最低,差异显著（P<0.05）。研究结果提示,成年牦牛不同部位皮肤内不同血管和神经形态结构相似,密度从颈部到前肢再到后肢差异显著。HIF-1α的差异性表达进一步说明皮肤在牦牛适应低氧环境中发挥作用。     

HIF-2α在1岁牦牛肺脏的表达分布研究

目的:研究低氧诱导因子(hypoxia inducible factor-2α,HIF-2α)在1岁牦牛肺脏组织中的表达分布。方法:选取1岁牦牛肺脏组织作为试验样本,制成石蜡切片,通过免疫组织化学染色观察牦牛肺脏组织的形态并检测HIF-2α在牦牛肺脏器官中的分布。结果:血管外膜、肺泡导管、末端细支气管和肺泡上皮细胞中HIF-2α的表达为强阳性。结论:通过分析HIF-2α于牦牛肺脏组织不同细胞中的表达情况,得出低氧能够促进HIF-2α在牦牛肺脏中的表达,进而推测HIF-2α因子对牦牛适应高原低氧环境有着重要作用。     

中甸牦牛HIF-1α基因表达差异分析

[目的]以云南省迪庆州香格里拉市高山放牧和昆明市东郊小哨示范牧场圈养育肥1.5年以上的成年中甸牦牛为研究对象,比较两种饲养条件下组织器官中HIF-1α基因mRNA表达差异。[方法]采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术检测HIF-1α基因在不同饲养条件下中甸牦牛不同组织中的表达水平。[结果]结果表明:中甸牦牛不同器官组织HIF-1α基因的相对表达量差异极显著(P0.01);在不同饲养条件下相对表达量差异显著,高山放牧显著高于异地圈养育肥(P0.05);在高山放牧的中甸牦牛肝脏中相对表达量显著高于圈养育肥的(P0.05)。[结论]中甸牦牛不同组织器官中HIF-1α基因广泛表达且具有组织特异性,在不同海拔饲养的相对表达量具有显著差异,为牦牛的耐低氧机制研究提供了理论依据。     

TNF-α对牦牛卵母细胞HIF-1α和HSP70的表达及后续胚胎发育能力的影响

旨在研究肿瘤坏死因子(TNF-α)对牦牛卵母细胞体外成熟和对低氧诱导因子1α(HIF-1α)、热休克蛋白70(HSP70)的表达以及后续胚胎发育能力的影响。在牦牛卵母细胞体外成熟培养液中添加不同浓度的TNF-α(最终浓度分别为0、10、25、50 ng·mL^-1),牦牛卵丘-卵母细胞复合体(cumulus-oocyte complexes,COCs)培养成熟后,统计其卵母细胞成熟率及体外受精后早期胚胎的发育率,采用RT-PCR扩增牦牛 HIF-1α、 HSP 70基因,采用实时荧光定量PCR(qRT-RCR)、蛋白免疫印迹法(Western blotting)和免疫荧光染色技术检测HIF-1α、HSP70在基因和蛋白水平的表达情况。结果发现:1)成熟液中加入TNF-α,卵母细胞的成熟率提高,且随着TNF-α浓度的升高,卵母细胞的成熟率、卵裂率和囊胚率逐渐升高,当TNF-α浓度为 25 ng·mL^-1 时,卵母细胞的成熟率和卵裂率达到最高,分别为84.98%和66.85%,而囊胚率也达到了21.48%,均显著高于对照组( P <0.05);2)随着TNF-α浓度的升高, HIF-1α的表达量逐渐降低,对照组 HIF-1α的表达量极显著高于其他组(P <0.01),50 ng·mL^-1 TNF-α组 HIF-1α的表达量极显著低于其他组(P <0.01),HIF-1α在卵丘细胞和卵母细胞上均有表达;3)25 ng·mL^-1 TNF-α组的HSP 70表达量最高,极显著高于其他组(P <0.01),而当TNF-α达到50 ng·mL^-1 时,HSP 70的表达量最低。综上表明,在牦牛卵母细胞体外成熟过程中,TNF-α明显提高了卵母细胞的发育能力,同时还诱导了HSP 70的表达,抑制了HIF-1α的表达,为今后探讨TNF-α、 HIF-1α和HSP70在牦牛生殖过程中发挥的作用以及对胚胎发育的影响提供理论依据。     

TGF-β受体1和p38MAPK在绵羊不同部位皮肤中的表达差异

绵羊毛发的生长速度因部位的不同而存在差异,绵羊腹股沟及耳部的毛发生长速度慢,而背部的毛发生长速度快长。研究表明,多种因素会影响动物毛发的生长速度及其他性状,其中MAPK信号通路在皮肤发育及毛发生长过程中有一定的调控作用。应用免疫组织化学技术对TGF-β受体1及p38MAPK在绵羊背部、耳部以及腹股沟部皮肤的表达水平与定位进行研究,以探讨TGF-β受体1及p38MAPK与绵羊毛发生长发育的关系。结果显示,TGF-β受体1及p38MAPK在绵羊的背部、耳部与腹股沟部均有表达,且p38MAPK在背部表达量最多,耳部次之,腹股沟部最少;而TGF-β受体1在耳部毛囊中的表达量最高,腹股沟部次之,在背部毛囊中的表达量最低。研究结果提示,TGF-β受体1及p38MAPK可能与绵羊毛发的生长发育有关。     

HIF-1α和IL-17在牦牛、犏牛及黄牛睾丸中的表达比较研究

本研究旨在比较HIF-1α和IL-17在不同牛睾丸组织中的差异性表达,进一步探究HIF-1α与IL-17在牛睾丸组织中发挥调控功能的关联性。以成年牦牛、犏牛和黄牛的睾丸作为研究对象,采用Western-blot、实时荧光定量PCR法检测HIF-1α及IL-17蛋白和基因在3种牛睾丸组织的表达差异。结果显示,3种牛睾丸组织中HIF-1α与IL-17基因和蛋白表达都存在显著性差异,且在犏牛睾丸组织中的表达均极显著高于牦牛和黄牛（P<0.01）;此外,牦牛HIF-1α与IL-17蛋白水平表达显著高于黄牛（P<0.05,P<0.01）,而牦牛IL-17基因水平表达与黄牛差异不显著（P>0.05）。HIF-1α和IL-17基因和蛋白在不同牛睾丸组织中的表达差异说明其具有种属特异性;而牦牛和犏牛睾丸组织中显著性高表达提示HIF-1α和IL-17对适应低氧环境具有重要的调节作用。     

TGF-β1在羊驼睾丸的表达与定位

研究TGF-β1在羊驼睾丸的表达与定位,探索TGF-β1在羊驼睾丸发育及精子发生中的作用.以12和24月龄的羊驼睾丸为研究对象,采用Western blotting技术,对TGF-β1在羊驼睾丸蛋白水平的表达进行研究;采用免疫组织化学SABC法对TGF-β1在羊驼睾丸的表达进行组织学定位.Western blotting结果显示羊驼睾丸组织粗蛋白提取物中存在分子量约为25 ku且与多克隆兔抗TGF-β1抗体发生免疫阳性反应的蛋白条带;免疫组化结果显示TGF-β1在12和24月龄羊驼睾丸的间质细胞、支持细胞和各级生精细胞均有不同程度的表达.光密度测定结果显示TGF-β1在12、24月龄羊驼睾丸间质细胞的光密度分别为0.730 5±0.011 5、0.562 6±0.012 2;在支持细胞分别为0.420 7±0.013 0、0.325 7±0.008 2;在精原细胞分别为0.457 9±0.009 2、0.374 3±0.015 8(P＜0.01);在管周肌样细胞分别为0.645 5±0.082 0、0.656 9±0.023 0(P＞0.05);TGF-β1在同一年龄阶段不同细胞的表达差异显著(P＜0.01,P＜0.05).结果表明羊驼睾丸有TGF-β1的表达;TGF-β1参与羊驼睾丸发育与精子发生的调控.     

大通犊牦牛心肌组织超微结构与HIF-Iα表达量早期发育变化特点的研究

为研究低氧环境下大通牦牛这一杂交品种其心肌组织在早期发育过程中的代偿性改变,本实验选取出生1日龄、1月龄、3月龄、6月龄大通牦牛为研究对象.采用超微结构形态学方法,通过定性定量的方法对出生1日龄、1月龄、3月龄、6月龄大通牦牛心肌细胞线粒体的超微结构变化特点进行分析;采用实时荧光定量PCR(Real Time-PCR)...     

藏羊肺脏中HIF-1α的表达及其高原适应性研究

为研究藏羊肺脏中缺氧诱导因子1(hypoxia-induciblefactor-1α,HIF-1α)表达特性,揭示藏羊高原适应性,试验选取不同海拔生活的藏羊肺脏组织,采用石蜡切片、HE染色和Masson染色观察肺组织结构,采用免疫组织化学法检测肺脏中HIF-1α的表达.结果表明,较高海拔藏羊肺脏被膜厚度和肺泡平均大小与...     

HIF-2α在藏羊肺脏的表达分布研究

目的:研究藏羊肺脏组织中低氧诱导因子(Hypoxia-inducible factor-2α,HIF-2α)的表达分布。方法:取藏羊肺脏组织作为试验样本,制成石蜡切片,通过HE染色法观察藏羊肺脏组织的形态结构,之后通过免疫组织化学染色观察藏羊肺脏组织的形态,并分析HIF-2α在藏羊肺脏器官中的表达分布结果。结果:HIF-2α表达为强阳性的是藏羊肺脏中的肺泡导管、末端细支气管和肺泡Ⅱ细胞部位。结论:此次试验通过研究HIF-2α在藏羊肺脏中的表达结果的分布,表明藏羊肺脏在肌细胞等结构的表达程度远低于肺泡导管、终末支气管上皮细胞和Ⅱ型肺泡细胞的表达程度。     

纳米氧化铜对藏鸡肝脏TGF-β1表达的影响

为探讨不同质量浓度纳米氧化铜(nano-CuO)对藏鸡肝组织转化生长因子-β1 (TGF-β1)表达的影响,按常规条件饲养藏鸡120羽,随机均分为空白对照组和低、中、高不同剂量nano-CuO组,每组设置3个重复,空白对照组饲喂基础日粮,nano-CuO组在基础日粮中添加5,50,100 mg/kg nano-CuO,...     

牦牛低氧诱导因子-1α基因克隆及蛋白质结构分析

试验采用RT-PCR方法,以麦洼牦牛脾脏cDNA为模板扩增牦牛低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)基因,并运用生物信息学软件对其序列进行分析。结果发现,扩增得到的麦洼牦牛HIF-1α基因编码区长为2 472 bp,编码823个氨基酸;蛋白质预测结果显示,该蛋白质分子质量为92.13 ku,等电点5.09,为亲水性蛋白,二级结构以随机卷曲和α-螺旋为主,有69个磷酸化位点和4个N-糖基化位点;系统进化树显示,麦洼牦牛与牦牛、野牦牛、普通牛亲缘关系最近。本试验成功克隆麦洼牦牛HIF-1α基因并对其序列进行了分析,为进一步研究HIF-1α基因的功能提供参考。     

TGF-β1基因真核表达载体的构建及在猪脐静脉内皮细胞中的表达

应用RT-PCR技术从猪外周血单个核细胞扩增转化生长因子β1（Transforming growth factor-β1,TGF-β1）全基因,构建含有TGF-β1基因及EGFP报告基因的真核表达质粒pEGFP-C1-TGF-β1。采用脂质体法转染体外培养的猪脐静脉内皮细胞（SUVECs）后,通过直接荧光观察pEGFP-C1-TGF-β1融合蛋白在细胞中的分布定位,并通过RT-PCR、间接免疫荧光方法检测TGF-β1基因在SUVECs中的表达。结果在转染后1周观察到绿色荧光,RT-PCR、间接免疫荧光法检测TGF-β1表达均为阳性。本研究成功构建了含有绿色荧光蛋白基因的真核表达载体pEGFP-C1-TGF-β1,且TGF-β1基因在SUVECs中获得表达。     

牦牛MEF2A基因克隆与差异性表达分析

MEF2A是一种由MEF2A基因编码的蛋白质,在心脏和平滑肌细胞的形态发生和肌细胞的生成过程中发挥关键作用。该研究运用RT-PCR技术并结合生物信息学分析方法,对西藏类乌齐牦牛MEF2A基因CDS区序列进行克隆及差异表达分析。结果表明:牦牛MEF2A基因CDS区全长1469 bp,共编码489个氨基酸。分子式为C 2263 H 3601 N 647 O 742 S 20,蛋白质分子量52385.58,总原子数为7273,理论等电点(pI)为6.27,消光系数为27515,不稳定指数60.68。脂溶系数和亲水性平均值分别是64.60、-0.604,该蛋白属于亲水性不稳定蛋白。蛋白质二级结构和三级结构预测结果显示,MEF2A蛋白主要由无规则卷曲、α螺旋和延长链在空间上折叠形成。牦牛MEF2A基因CDS区编码的氨基酸序列与普通牛、家猫、家犬、绵羊、小鼠、金钱豹、宽吻海豚、抹香鲸、美洲野牛、白犀、马、东北虎、猴的同源性分别为99.6%、96.1%、96.4%、99.6%、89.3%、96.8%、96.6%、96.8%、93.6%、97.2%、96.1%、96.3%、96.7%,该基因在不同物种高度保守。利用实时荧光定量PCR检测可知,MEF2A mRNA在牦牛臀肌、心脏、肝脏、肺脏中均有表达,且在臀肌中的表达优势较为显著(P<0.05)。研究结果为进一步探讨MEF2A基因对牦牛肌肉代谢调控的分子机制研究提供了理论依据。     

整合素αv在牦牛繁殖周期输卵管不同部位中的表达与定位

旨在探究整合素αv在牦牛繁殖周期输卵管不同部位的表达差异,为进一步了解整合素αv在牦牛生殖过程中发挥的作用提供理论依据。本研究采集卵泡期、黄体期和妊娠期健康母牦牛（3~6岁）的输卵管伞部、壶腹部和峡部样品,将卵泡期、黄体期和妊娠期输卵管分别按照伞部、壶腹部和峡部分为9组,采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白免疫印迹法（Western-blotting,WB）检测整合素αv基因和蛋白的表达情况,运用免疫组织化学法检测整合素αv的定位。结果表明：1）qRT-PCR结果显示,在卵泡期,整合素αv基因在输卵管伞部的表达量最高,极显著高于壶腹部和峡部（P<0.01）;在黄体期,整合素αv基因在输卵管峡部的表达量最高,极显著高于伞部和壶腹部（P<0.01）;在妊娠期,整合素αv基因在输卵管伞部的表达量最高,极显著高于壶腹部和峡部（P<0.01）。2）Western-blotting结果显示,在卵泡期,整合素αv蛋白在输卵管伞部的表达量最高,极显著高于壶腹部和峡部（P<0.01）;在黄体期,整合素αv蛋白在输卵管峡部的表达量最高,极显著高于伞部和壶腹部（P<0.01）;在妊娠期,整合素αv蛋白在输卵管峡部和伞部的表达差异不显著,但二者极显著高于壶腹部（P<0.01）。3）免疫组织化学结果显示,整合素αv主要分布于输卵管伞部、壶腹部和峡部的纤毛细胞、分泌细胞、基细胞、肌层和浆液腺中。结果显示,整合素αv在牦牛繁殖周期输卵管不同部位中的表达存在显著差异,说明其可能参与了牦牛受精及早期胚胎发育等一系列生殖过程,为牦牛的繁殖性能研究提供了基础资料。     

犬氧化损伤性白内障晶状体结构和TGF-β_1 mRNA表达的变化

为了明确犬氧化损伤性白内障发展过程中晶状体结构的变化与转化生长因子β_1(TGF-β_1)mRNA表达的关系。本试验选取重庆本地杂交犬通过芬顿溶液进行晶状体囊袋内注射法建立犬氧化损伤性白内障模型,使用裂隙灯观察成模效果,借助光镜观察晶状体病理组织学变化,最后使用荧光定量PCR(real-time quantitative PCR)检测白内障发展过程中晶状体组织TGF-β_1基因的相对表达量。结果显示,随着犬氧化损伤性白内障发展,晶状体前囊膜下和赤道部晶状体上皮细胞(LECs)从Ⅰ期起大小、数量、形态、细胞核染色以及结构排列异常,发展到Ⅲ、Ⅴ期时LECs与前囊膜连接变的疏松;当犬白内障Ⅲ期向Ⅴ期发展时后囊膜与皮质区连接疏松,在Ⅴ期时前、后囊膜均破裂;在白内障Ⅴ期时位于赤道部周围皮质区的晶状体纤维连接疏松,出现断裂崩解,走向改变的现象。与空白对照组相比犬白内障Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期的TGF-β_1mRNA的表达水平均上调,差异极显著(P0.01),且Ⅱ期和Ⅲ期表达水平显著高于其他白内障发展的3个时期(P0.05),其中Ⅲ期最高,Ⅱ期其次。结果表明,犬氧化损伤性白内障发展过程中TGF-β_1mRNA呈高表达是晶状体上皮细胞(LECs)异常变化、囊膜的完整性遭到破坏而发生炎性反应,LECs的异常变化和TGF-β_1的高表达可能导致犬晶体纤维结构的病理变化。     

急性应激后小鼠空间学习记忆及脑内HIF-1α表达的变化

目的研究急性应激强度下小鼠学习记忆能力的变化以及海马和前脑皮层HIF-1α的表达。方法采用电击足底方式对小鼠急性应激处理,通过Morris水迷宫实验检测小鼠的空间学习记忆能力,采用免疫组织化学方法检测小鼠海马和前脑皮层缺氧诱导因子(HIF-1α)的表达。结果急性应激组小鼠在水迷宫实验中的空间学习记忆能力比正常对照组小鼠明显增强(P<0.05);脑内海马CA1区、CA3区、齿状回和前脑皮层HIF-1α的表达显著增加(P<0.01)。结论急性应激后,HIF-1α在海马和前脑皮层表达增加,可能参与应激引起小鼠学习记忆功能的增强。     

PCV2感染的IPEC-J2的IL-6/TGF-β/IL-12变化

【目的】探讨猪圆环病毒2型(PCV2)感染猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)后,IPEC-J2中病毒载量和部分炎性因子的变化。【方法】病毒感染IPEC-J2细胞,于不同时间收取样品,提取总DNA,用荧光定量PCR方法测定病毒载量变化;提取总RNA反转录,用荧光定量PCR方法测定IL-6、TGF-β1、IL-12的含量变化。【结果】病毒载量随时间持续增高,且在72h达到顶峰。IL-6在48h显示明显上调,24h下调;TGF-β1在12h和72h均明显上调;IL-12在不同时间点变化不大。【结论】PCV2可在IPEC-J2中增殖,上调IPEC-J2中IL-6和TGF-β1的表达。该结论为进一步研究PCV2的肠道免疫致病机制提供研究数据。