Toll样受体7基因敲除对水疱性口炎病毒增殖的影响

【目的】 探究敲除Toll样受体7（Toll-like receptor 7，TLR7）基因对水疱性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus，VSV）复制的影响。【方法】 利用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因编辑技术构建TLR7基因敲除的稳定猪肾上皮细胞（porcine renal epithelial cells，PK15）系。通过构建pTLR7-sgRNA重组质粒并转染至HEK293T/17细胞，收获慢病毒并感染PK15细胞，经嘌呤霉素筛选后得到PK15-TLR7^-/-多克隆细胞，并在Western blotting鉴定后通过有限稀释法获得PK15-TLR7^-/-单克隆稳定细胞系。为验证敲除TLR7基因稳定细胞系是否构建成功，分别利用光学显微镜和细胞毒性检测（cell counting kit 8，CCK-8）观察并检测PK15、PK15-TLR7^-/-细胞的形态与活力；利用荧光倒置显微镜和流式细胞术观察VSV-GFP感染PK15、PK15-TLR7^-/-细胞后病毒增殖情况；利用Western blotting和实时荧光定量PCR分别检测VSV-GFP感染PK15、PK15-TLR7^-/-细胞后GFP蛋白和VSV-N基因mRNA水平的表达情况；利用病毒滴度检测VSV-GFP感染PK15、PK15-TLR7^-/-细胞后子代病毒产生情况。【结果】 采用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建的3种sgRNA均对TLR7进行了有效的编辑，其中sgRNA2的基因编辑效率最高，但敲除TLR7基因并不影响PK15细胞的形态及活力；当感染VSV-GFP后，通过荧光显微镜观察发现，荧光强度随着时间逐次增加，且PK15-TLR7^-/-细胞的GFP荧光强度强于PK15细胞。流式细胞术检测结果显示，相同时间点的PK15-TLR7^-/-细胞感染VSV-GFP的比例显著或极显著高于PK15细胞（P<0.05；P<0.01）；实时荧光定量PCR结果表明，感染4~36 h VSV-N基因mRNA相对表达量随着时间逐渐增加，且PK15细胞中VSV-N基因的mRNA相对表达量显著或极显著低于PK15-TLR7^-/-细胞（P<0.05；P<0.01）；Western blotting结果表明，PK15与PK15-TLR7^-/-细胞中的VSV-GFP GFP蛋白均从6 h开始表达，表达量随时间逐渐增多，且在PK15-TLR7^-/-细胞中VSV-GFP GFP蛋白含量比PK15细胞更高；感染VSV-GFP 6 h后子代病毒开始释放，此时PK15细胞中VSV-GFP子代病毒滴度低于PK15-TLR7^-/-细胞（P>0.05），但PK15细胞中VSV-GFP子代病毒滴度随着感染时间的增加显著或极显著低于PK15-TLR7^-/-细胞（P<0.05；P<0.01）。【结论】 TLR7基因的敲除可以促进VSV在PK15细胞中的复制，初步验证了TLR7在天然免疫中的作用，为VSV等RNA病毒性疾病的防控提供新思路。     

鸡Apob基因组织表达与CRISPR/Cas9敲除系统的构建

旨在探究Apob基因在鸡肝脂质代谢过程中的功能。本研究对鸡Apob蛋白进行理化性质分析；利用RT-qPCR检测Apob基因在4周龄黄羽肉鸡组织中的表达情况，每组设置3个重复，进行3次平行试验。根据鸡Apob蛋白关键结构域，在Apob基因外显子设计3对sgRNA，构建Cas/gRNA载体；将重组质粒转染DF-1细胞后，利用T7核酸内切酶I （T7 endonuclease I，T7EI）酶切法和TA克隆测序法筛选敲除活性位点并计算敲除效率。利用RT-qPCR检测基因敲除后亚克隆细胞中Apob基因mRNA表达情况。结果表明，鸡Apob的相对分子质量为523.356 ku，平均亲水性为-0.300，为稳定的蛋白质，并且该基因主要在鸡的肝、肾和小肠组织表达。敲除载体转染至DF-1细胞后，T7EI酶切发现，Cas/gRNA6、Cas/gRNA7和Cas/gRNA8三个位点均可发挥敲除活性，TA克隆测序结果表明，三者的敲除效率分别为33.3%、65%和80%。同时，RT-qPCR结果显示，转染Cas9/gRNA7、Cas9/gRNA6、Cas9/gRNA8的细胞中Apob基因mRNA表达水平约分别下调99.96%（P<0.01）、85%（P<0.01）、47%（P<0.05）。综上所述，本研究揭示了鸡Apob基因在组织中的表达特点和蛋白的理化性质；成功构建了鸡Apob基因CRISPR/Cas9敲除载体，并筛选出最佳敲除位点，获得了Apob基因敲除的亚克隆细胞，为进一步探索Apob基因在鸡肝中的功能奠定了基础。     

CREB-H基因在猪不同组织中表达谱及肝脏中的表达规律

本研究旨在分析环腺苷酸应答元件结合蛋白H（cyclic AMP-responsive element-binding protein 3-like 3，CREB-H）在猪不同组织中的表达谱及其在马身猪和大白猪肝脏中的发育性表达规律。采用实时荧光定量PCR和Western blotting技术检测1日龄猪12个组织（心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、小肠、小脑、下丘脑、背最长肌、股肌和腰肌）中CREB-H基因的表达谱，以及CREB-H在1、30、60、90、120、150和180日龄马身猪和大白猪肝脏中的表达规律。结果显示，CREB-H基因mRNA在马身猪的12个组织中广泛表达，其中在肝脏和小肠中高表达；CREB-H蛋白在肝脏组织中的表达量显著高于其他组织（P<0.05），在心脏、脾脏和小脑中不表达。猪肝脏CREB-H基因mRNA和蛋白的发育表达受日龄、品种、品种与日龄相互作用的影响（P<0.01）。马身猪和大白猪肝脏中CREB-H基因mRNA和蛋白的表达量均在1日龄时达到最大值。在各发育阶段，马身猪CREB-H蛋白的表达量均极显著高于大白猪（P<0.01），且CREB-H主要在猪肝脏中表达。CREB-H在两猪种肝脏中的表达存在时空差异，可能与猪在不同发育期的脂质代谢能力有关，本试验结果为研究猪的脂质代谢调控机制提供一定的理论依据。     

猪肌内脂肪沉积相关基因的筛选及其表达特性分析

【目的】 通过分析马身猪和大白猪背最长肌转录组测序数据,筛选肌内脂肪沉积相关基因,并对其表达特性进行分析。【方法】 采集180日龄马身猪和大白猪背最长肌,采用RNA-Seq技术对其进行转录组测序,筛选差异表达基因并进行GO功能和KEGG通路富集分析;采用GeneCards在线查询基因功能,进一步筛选与肌内脂肪沉积相关的差异基因;采用实时荧光定量PCR技术检测差异基因在2个品种猪不同组织以及肌内脂肪细胞成脂分化过程中的表达变化。【结果】 获得2个品种猪背最长肌差异表达基因共280个,其中128个表达显著上调,152个表达显著下调。GO功能富集分析注释到46个条目,其中生物过程24条,分子功能8条,细胞组分14条。KEGG通路分析显著富集到PPAR信号通路、MAPK信号通路和脂肪细胞因子信号等脂肪沉积相关通路。GeneCards功能查询获得TRAF2、DUSP1、ACOT4、NR4A1、SLC27A6、PLIN5共6个与脂肪沉积相关的基因。实时荧光定量PCR分析表明,马身猪和大白猪背最长肌中NR4A1、DUSP1、PLIN5基因表达量差异显著或极显著(P<0.05;P<0.01),TRAF2、ACOT4和SLC27A6基因表达量差异不显著(P>0.05),但表达变化趋势与测序结果一致;马身猪腹部皮下脂肪组织中NR4A1和PLIN5基因表达量极显著高于背部皮下脂肪组织(P<0.01),而大白猪背部皮下脂肪组织中NR4A1和DUSP1基因表达量极显著高于腹部皮下脂肪组织(P<0.01),PLIN5基因表达量显著高于腹部皮下脂肪组织(P<0.05)。在背部皮下脂肪组织中,NR4A1、DUSP1和PLIN5基因在大白猪中的表达量极显著高于马身猪(P<0.01);在腹部皮下脂肪组织中,NR4A1和DUSP1基因在大白猪中的表达量显著高于马身猪(P<0.05),PLIN5基因表达量在2个品种间无显著差异(P>0.05)。体外培养的猪肌内脂肪细胞分析表明,随着成脂天数的增加,NR4A1基因表达量呈下降趋势,DUSP1和PLIN5基因表达量均呈上升趋势。【结论】 本研究获得了NR4A1、DUSP1、PLIN5 3个与猪肌内脂肪沉积相关的候选基因,可为后续进一步探讨猪肌内脂肪沉积调控机制提供一定的参考。     

猪lncRNA TCONS_00791383对骨骼肌卫星细胞增殖分化的影响

为了探究lncRNA TCONS_00791383对猪骨骼肌卫星细胞增殖和分化的影响。本研究利用qRT-PCR技术检测出生7 d内大白仔猪6种组织（心、脾、肺、肾、背肌和腿肌）以及猪骨骼肌卫星细胞增殖分化前后TCONS_00791383的表达水平；通过设计反义核苷酸（antisense oligonucleotides，ASO）片段在猪骨骼肌卫星细胞中对TCONS_00791383进行敲低，检测敲低TCONS_00791383之后增殖分化标志基因的表达量变化；通过trans （co-expression）对TCONS_00791383进行靶基因预测，使用DAVID对其进行GO富集和KEGG通路分析。结果显示，TCONS_00791383在猪心脏中表达量最高，在脾和肾组织中不表达。在骨骼肌卫星细胞从增殖到分化的过程中，TCONS_00791383的表达量逐渐上升，且在分化后30 h表达量达到最高。在使用ASO片段敲低TCONS_00791383之后，与对照组相比，在分化24 h，增殖标志基因Pax3、Pax7表达量显著或极显著降低（P<0.05，P<0.01），分化标志基因MyoG表达量极显著降低（P<0.01），在分化48 h，增殖标志基因Pax3表达量极显著降低（P<0.01），Pax7表达量显著降低（P<0.05），分化标志基因MyHC表达量显著降低（P<0.05）。预测得到的相关靶基因富集到AMPK、ATP等多个与骨骼肌卫星细胞增殖和分化过程相关的重要信号通路。本研究表明，lncRNA TCONS_00791383可能促进猪骨骼肌卫星细胞的增殖和分化。     

基于CRISPR/Cas9技术的法尼醇X受体缺失株的构建及其对HeLa细胞增殖的影响

试验旨在利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建法尼醇X受体（FXR）基因稳定敲除细胞株,并考察其对HeLa细胞增殖的影响。根据CRISPR/Cas9靶点设计规则,设计3对特异性识别FXR基因第1外显子相关序列的上下游小向导RNA（small guide RNA,sgRNA）,以PX459质粒为载体,构建真核重组表达质粒。酶切和测序鉴定后将重组质粒转染至HeLa细胞中,用嘌呤霉素进行阳性细胞筛选,再用实时荧光定量PCR检测HeLa细胞FXR基因敲除稳定株中FXR的表达量,并用Western blotting方法鉴定HeLa细胞FXR基因敲除效果。最后用结晶紫染色试验检测FXR基因敲除对HeLa细胞增殖的影响。结果显示,经测序后,3对sgRNA位置与方向均正确插入到PX459质粒载体内,成功构建出重组表达质粒PX459-sgRNA;实时荧光定量PCR和Western blotting检测结果显示,转染后筛选出的细胞中FXR蛋白不表达,表明构建出稳定敲除FXR基因的HeLa细胞株;结晶紫试验结果发现,FXR基因敲除的HeLa细胞染色深度明显低于正常HeLa细胞,FXR基因敲除HeLa细胞孔D_{595 nm}值极显著低于野生型HeLa细胞孔（P<0.01）,说明HeLa细胞FXR基因敲除株的增殖能力较正常HeLa细胞显著降低。本试验利用CRISPR/Cas9技术成功获得了内源FXR基因敲除细胞株,且FXR基因敲除对癌细胞增殖具有显著抑制作用,为研究FXR的功能和作用机制提供了细胞模型,并为研究FXR在相关癌症发生发展中的作用奠定了基础。     

DDR1对奶牛乳腺上皮细胞增殖与凋亡的调控作用

旨在通过干扰或过表达盘状蛋白结构域受体1（DDR1）基因,探讨其对奶牛乳腺上皮细胞增殖、凋亡及周期的影响。本研究将DDR1基因小干扰RNA片段和过表达载体pcDNA3.1-DDR1转染奶牛乳腺上皮细胞,采用qRT-PCR和Western blot检测细胞中DDR1的干扰和过表达效果;利用CCK-8法检测细胞增殖能力;流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡（早凋、晚凋）的变化;利用qRT-PCR检测增殖与凋亡相关基因的表达情况。结果,在奶牛乳腺上皮细胞中干扰DDR1基因后,其mRNA和蛋白表达分别下调94%和30%,而过表达DDR1基因后,其mRNA和蛋白表达分别上调68.24和1.38倍;干扰DDR1极显著抑制细胞的增殖（P<0.01）,细胞早凋与晚凋比例极显著上升（P<0.01）;干扰组G1期细胞比例极显著上升（P<0.01）,S期细胞比例极显著下降（P<0.01）,G2期细胞比例显著下降（P<0.05）,提示细胞阻滞在G0/G1期。相反,过表达DDR1能显著促进细胞增殖（P<0.05）,显著抑制细胞晚期凋亡（P<0.05）,G1期细胞比例极显著下降（P<0.01）,S期细胞比例极显著上升（P<0.01）,促进细胞由G1期向S期的转换。qRT-PCR检测结果显示,干扰DDR1后显著上调BAX、Caspase9基因的表达（P<0.05）,极显著上调P53、FAS基因的表达（P<0.01）,且显著下调PCNA、CyclinB1基因的表达（P<0.05）;过表达DDR1后,分别显著和极显著下调Cytc与BAX基因的表达（P<0.05,P<0.01）,并极显著上调CyclinB1基因的表达（P<0.01）。综上可见,DDR1能够调控奶牛乳腺上皮细胞的增殖、凋亡和周期,可为阐明DDR1参与奶牛乳腺上皮细胞生长发育的分子机制提供参考。     

CRISPR/Cas13d介导猪胎儿成纤维细胞SUV39H1/SUV39H2基因敲降

研究旨在利用CRISPR/Cas13d系统对猪胎儿成纤维细胞（PEF）中的胚胎发育相关基因SUV39H1/SUV39H2进行RNA水平的敲降，从而在猪上建立CRISPR/Cas13d介导的基因敲降系统。根据SUV39H1、SUV39H2基因的编码序列各设计3个靶向编码链的sgRNAs，并以单链寡核苷酸的形式合成，退火后与BspQⅠ线性化的sgRNA表达载体进行连接，构建SUV39H1-sgRNA和SUV39H2-sgRNA表达载体，用Sanger软件进行测序；将Cas13d表达载体和靶向SUV39H1/SUV39H2基因的sgRNA载体按照1∶1、1∶2、1∶4、2∶1和4∶1比例转染猪胎儿成纤维细胞，48 h后收集细胞，用流式细胞术分选检测细胞转染效率，用半定量PCR和实时荧光定量PCR检测敲降效率；用半定量PCR和免疫荧光检测敲降SUV39H1/SUV39H2基因后，靶基因转录水平及组蛋白H3K9me3水平的变化。测序结果表明，针对2个基因设计的各3条sgRNAs均成功连入载体中；流式细胞术分选结果显示，转染效率约70%；半定量PCR结果表明，与对照组相比，3个sgRNAs均极显著降低了SUV39H1和SUV39H2基因的表达（P<0.01），其中SUV39H1-sgRNA-2和SUV39H2-sgRNA-1均可使SUV39H1和SUV39H2的表达降低50%；Cas13d∶sgRNA为1∶1、1∶2和1∶4组细胞的存活率高于2∶1和4∶1组；实时荧光定量PCR结果表明，Cas13d∶sgRNA为1∶2、1∶4、2∶1和4∶1组敲降效率均显著高于1∶1组（P<0.05），且Cas13d∶sgRNA为1∶2组敲降效率最高（70%）。半定量PCR结果显示，转染SUV39H1-sgRNA-2和SUV39H2-sgRNA-1极显著降低SUV39H1和SUV39H2的表达，表达量为对照组的25%~30%（P<0.01）。免疫荧光检测结果表明，敲降SUV39H1和SUV39H2基因后，组蛋白H3K9me3水平显著降低（P<0.05）。因此，本研究利用CRISPR/Cas13d系统在猪胎儿成纤维细胞中成功敲降SUV39H1和SUV39H2，并下调其催化的H3K9me3水平。     

载脂蛋白CⅡ基因在猪肝脏组织中的发育性表达研究

试验旨在探究载脂蛋白CⅡ(apolipoprotein Ⅱ,ApoCⅡ)基因mRNA在马身猪和大白猪肝脏组织中的发育性表达规律,揭示ApoCⅡ基因表达水平与猪脂质代谢之间的关系。采用实时荧光定量PCR技术检测了马身猪和大白猪1~180日龄(1、30、60、90、120、150和180日龄)肝脏组织中ApoCⅡ基因mRNA表达。结果表明,马身猪和大白猪肝脏组织ApoCⅡ基因mRNA发育性变化趋势存在差异,马身猪ApoCⅡ表达量从1日龄到60日龄逐渐降低,在90日龄时上升,之后逐渐降低;而大白猪从1日龄到150日龄呈现逐渐降低趋势,180日龄时回升。1日龄时,马身猪和大白猪肝脏中ApoCⅡ基因mRNA的表达量差异不显著(P>0.05),在其他阶段,两品种间的表达量存在显著或极显著差异(P<0.05或 P<0.01)。这表明肝脏中ApoCⅡ mRNA的表达具有显著的日龄依赖性和明显的品种差异性,其表达可能对猪脂质代谢有显著影响。     

Cellular Localization,Expression Patterns of CCAR1 Gene,and Its Effect on Cell Proliferation in Pig

The aim of this study was to obtain the complete coding sequence (CDS) of CCAR1 gene, and to explore its subcellular localization, expression profile and its effects on cell prolification and action mechanism in pig. In this study, the cDNA from kidney tissue of 1-day-old Mashen pigs were used as the template to obtain the full-length CDS of CCAR1 gene by RT-PCR and sequencing. The cellular immunofluorescence staining was used to explore the subcellular localization of CCAR1 in PK15 cells. The temporal and spatial expression profile of CCAR1 was investigated by qRT-PCR in this study. The CCAR1 gene in PK15 cells was knocked out by using CRISPR/Cas9 gene editing technology, and the effects of CCAR1 gene on cell proliferation and expression of cell proliferation and apoptosis related genes were investigated by qRT-PCR, Western blot and CCK8 (cell counting kit 8) technologies in this experiment. The results showed that the complete CDS region of pig CCAR1 gene was 3 459 bp in length (MH301308.1). CCAR1 protein was localized in both cytoplasm and nucleus of PK15 cells. The expression profiles of CCAR1 mRNA between Large White and Mashen pigs was similar, which was expressed in all detected tissues, with the highest expression in kidney and small intestine, middle expression in spleen, liver, cerebellum and muscle, and the lowest expression in heart and subcutaneous fat. Temporal expression results showed that CCAR1 was expressed in both psoas muscle and longissimus dorsi muscle at 3 developmental stages both in Mashen and Large White pigs. The CRISPR/Cas9 gene editing system effectively reduced the expression of CCAR1. CCK8 results showed that after 48 hours of transfection, compared with the control group, the proliferation of cells in the experimental groups were extremely significantly inhibited (P<0.01). After CCAR1 gene knocked out, the expression level of Mki67, a marker of cell proliferation, was significantly decreased (P<0.05). There was no significant difference in the expression level of Caspase3 and the core protein β-catenin in Wnt pathway between control group and experimental groups, and the expression level of downstream target gene C-myc of Wnt pathway was decreased significantly(P<0.05). CCAR1 gene was expressed almost in all tissues at different developmental stages, and affected cell proliferation by regulating the expression levels of Mki67 and C-myc, and played an important role in growth and development of pig.     

Study on Developmental Expression of ApoCⅡ Gene mRNA in Liver Tissues of Pigs

The aim of this study was to investigate the developmental patterns of ApoCⅡ gene mRNA in liver in Mashen and Large White pigs, and study the relationship between the expression level of ApoCⅡ and the lipid metabolism in pigs.The mRNA relative expressions of ApoCⅡ gene in liver at seven stages of 1,30,60,90,120,150,and 180-day old in Mashen and Large White pigs were determined by quantitative Real-time PCR.The results showed that the developmental trend of ApoCⅡ mRNA expression in liver between Mashen and Large White pigs was different.The ApoCⅡ mRNA abundance was decreased from birth to 60-day old,then increased at 90-day old,and decreased again after that in Mashen pig.However,the relative expression amount in Large White pig was gradually decreased from birth to 150-day old and increased again at 180-day old.Except for the ApoCⅡ mRNA expression amount at 1-day old,the differences of the expression amount at other stages in Mashen and Large White pigs were significant or extremely significant (P<0.05 or P<0.01).The ApoCⅡ mRNA expression in liver was affected by age and breed,and could play an important role in lipid metabolism in pigs.     

猪NR1H3基因可变剪接体的克隆及表达特性研究

旨在克隆猪NR1H3基因的可变剪接体,并预测编码蛋白的结构与功能,研究其转录本的表达特性。本试验以马身猪为研究对象,采用RT-PCR及克隆测序技术对猪NR1H3基因CDS区进行扩增和克隆,采用生物信息学方法分析NR1H3蛋白的生物学特性,采用qRT-PCR技术检测NR1H3基因在心、肝、脾、肺、肾、胃、小肠、股二头肌、腰大肌和皮下脂肪组织中的表达谱及在脂肪组织中的发育性表达规律。结果表明,本研究成功克隆出猪NR1H3基因的两个转录本NR1H3-1和NR1H3-2,其中NR1H3-2为新发现的转录本（MN082630）,其CDS区全长1 203 bp,编码的蛋白质含400个氨基酸,属于中性不稳定蛋白;与NR1H3-1相比,NR1H3-2缺失了长度为95 bp的第9外显子,编码的蛋白质NR1H3-2比NR1H3-1少了一个肝X受体的配体结合结构域;氨基酸的相似性分析发现,猪NR1H3蛋白氨基酸序列与北大西洋小须鲸、山羊、绵羊、抹香鲸、长江江豚等物种的相似性较高。NR1H3-1和NR1H3-2在所检测组织中均有表达,且在不同组织间的表达量具有显著差异（P<0.05）;NR1H3-1转录本在小肠中表达量最高,其次是脾、肝、股二头肌等,在心脏中表达量最低;NR1H3-2则在肝中表达量最高,其次是脾、小肠、胃和股二头肌等,在心脏中表达量最低。在各组织中（除小肠、心、肺）,NR1H3-2的表达量均高于NR1H3-1,其中在肝和皮下脂肪组织中,NR1H3-2的表达量极显著高于NR1H3-1（P<0.01）,在胃中差异达显著水平（P<0.05）。随着日龄的增加,皮下脂肪组织中NR1H3-1和NR1H3-2的表达量整体呈上升趋势,推测该基因对猪的脂肪沉积有调控作用。本试验成功克隆了猪NR1H3基因的两个可变剪接体,并推测其对猪脂质代谢及脂肪生成具有重要的生理作用。     

Cloning of Porcine SKP1 Gene and it's Expression Studies between Meishan and Duroc Pigs with Follicle

To detect the expression pattern of S-phase kinase association protein 1 (SKP1) gene in during porcine follicle development.The coding sequence (CDS) of SKP1 gene was cloned from porcine follicular tissue.To analyze the tissue expression profiling of SKP1 gene and its expression level in follicles with different diameter (S,M1,M2,L) from Duroc and Meishan pigs were investigated by Real-time fluorescence quantitative PCR.The results showed that the length of CDS of porcine SKP1 was 492 bp,and it's similarity with that of Ovis aries,Homo sapiens,Pan troglodytes,Bos taurus and Rattus were 93.10%,92.90%,92.29%,91.89% and 89.86%,respectively.SKP1 mRNA was expressed in all tested tissues (muscle,fat,heart,liver,spleen,lung,kidney,stomach,duodenum,ovarian,tubal,uterine,uterine horn,pituitary,corpus luteum,brain,hypothalamus),and especially high in uterine,spleen and tubal.Both in Meishan pig.The expression of SKP1 mRNA in S,M1 and M2 follicles were higher than Duroc pig.Especially,the expression in Meishan pig M1 and M2 follicles were significantly higher than Duroc pig (P<0.01),respectively 2.39,2.82 times,and the expression of L follicle in Duroc pig was higher than Meishan pig,which suggested that SKP1 gene might be involved in the process of procine's follicular development.     

猪SKP1基因的克隆及其在梅山猪与杜洛克猪卵泡中的表达研究

为探索SKP1(S-phase kinase association protein 1)基因在猪卵泡中的表达规律,本试验从猪卵泡组织中克隆了猪SKP1基因CDS区全长序列,采用Real-time PCR方法检测SKP1基因在不同组织中的表达谱,进一步分析了该基因在梅山猪和杜洛克猪S卵泡、M1卵泡、M2卵泡、L卵泡中的表达。结果表明,经克隆测序,得到了猪SKP1基因492 bp编码区全长序列,与羊、人、黑猩猩、牛、大鼠的同源性分别为93.10%、92.90%、92.29%、91.89%、89.86%。SKP1基因在各组织中均有不同程度的表达(肌肉、脂肪、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、十二指肠、卵巢、输卵管、子宫、子宫角、垂体、黄体、大脑、下丘脑),其中在子宫、脾脏、输卵管中表达量较高。SKP1基因的表达量在梅山猪S卵泡、M1卵泡和M2卵泡中的表达量均高于杜洛克猪,特别是在梅山猪M1卵泡和M2卵泡中SKP1基因的表达量极显著高于杜洛克猪(P<0.01),分别达到了2.39、2.82倍,而在L卵泡中的表达量却是杜洛克猪高于梅山猪,结果提示SKP1基因可能参与猪卵泡发育过程。