禽呼肠孤病毒C-98、T-98分离株S2基因的克隆及序列分析

参考GenBank中禽呼肠孤病毒176株(ARV 176)S2基因设计引物,对禽呼肠孤病毒内蒙古地区分离株C-98和禽呼肠孤病毒天津地区分离株T-98进行总RNA的提取,以其为模板,应用RT-PCR方法扩增病毒S2基因的cDNA片段,将纯化的cDNA片段克隆到pEASY-T1载体后进行序列测定。结果表明,获得的ARV C-98和ARV T-98的S2基因全长为1324bp,包括15bp的5′非编码区和58bp的3′非编码区,阅读框位于5′端第16位核苷酸和第1266位核苷酸之间。ARV C-98和ARV T-98分离株S2基因的核苷酸同源性很高,达到了99.8%,将C-98、T-98株的S2基因核苷酸序列和参考毒株的S2基因序列进行同源性分析,结果表明,ARV C-98和ARV T-98分离株的S2基因与参考毒株ARV 176、ARV 918、ARV 919、ARV 1733、ARV GX2010、ARV S1133和DRV YJLS2基因的核苷酸同源性最高,在99.2%～99.8%之间;与参考毒株ARV 138和ARV AVS-BS2基因的核苷酸同源性在92.1%～94.1%之间;与参考毒株ARV601SI、ARV 916和ARV 1017-1S2基因的核苷酸同源性在87.3%～87.8%之间;与参考毒株DRV 091、DRV S12和DRV S14 S2基因的核苷酸同源性在77.3%～78.2%之间;与参考毒株MRV 3、MRV 3-jin-1和MRV 3-T3D S2基因的核苷酸同源性最低,在2.4%～5.5%之间。遗传进化树分析显示:ARV C-98和ARV T-98分离株与参考毒株共分为4个遗传进化分支。     

番鸭呼肠孤病毒非结构基因的克隆和序列分析

参考GenBank禽呼肠孤病毒(Avian Reovirus,ARV)和番鸭呼肠孤病毒(Muscovy Duck Reovirus,MDRV)非结构基因(NS)序列设计合成一对引物,对番鸭呼肠孤病毒S14和C4株NS基因进行RT-PCR扩增,克隆到pMD18-T载体中,并对克隆产物进行酶切鉴定和测序;番鸭呼肠孤病毒NS基因由1 291 bp核苷酸组成,与禽呼肠孤病毒NS基因相比,在非编码区第1155位少一个碱基,本文第一次证实1291bp是番鸭呼肠孤病毒NS基因特有的长度;番鸭呼肠孤病毒S14和C4株NS基因的5'末端和3'末端分别为5‘GCTTTT和TCATC-3',是禽类呼肠孤病毒基因末端特有的碱基序列,S14和C4株NS基因的的有效阅读框(24～1127bp)编码367个氨基酸组成的蛋白,分子量约为40kDa;番鸭呼肠孤病毒S14和C4株NS蛋白等电点分别是7.3和7.0,GC含量分别为54.26%和53.71%,番鸭呼肠孤病毒S14和C4株NS基因间核苷酸同源性为99.3%,仅有4个氨基酸差异,S14和C4与法国番鸭呼肠孤病毒89026株NS基因核苷酸同源性分别为87.8%和87.9%,与鸡关节炎病毒S1133 NS基因同源性分别为79.0%和79.3%;进化树分析表明本研究中的两株番鸭呼肠孤病毒非结构基因(NS)与番鸭呼肠孤病毒的亲缘关系比禽呼肠孤病毒近的多,建议番鸭呼肠孤病毒应归属为正呼肠孤病毒属第二个亚群中不同于禽和内尔森贝海湾呼肠病毒独立基因群.     

新型鸭呼肠孤病毒S组基因克隆及序列分析

采用RT-PCR方法对NDRV-QY分离株的S组基因编码区进行RT-PCR扩增、克隆及序列测定。结果表明,QY株S组基因包含的ORF大小分别为1 517 bp、1 251 bp、1 104 bp和1 104 bp。将QY株的S组基因各节段编码区核苷酸序列及其推导氨基酸序列与正呼肠孤病毒属的呼肠孤病毒的相似性比较和遗传进化分析结果表明,QY株与ARV、TRV、MDRV、NDRV均有不同程度的同源性,其中与NDRV的同源性最高,核苷酸序列和氨基酸序列同源性均达90%以上。QY株与NDRV、MDRV、ARV同在正呼肠孤病毒的第Ⅱ亚群,与NDRV处在同一个分支,与MDRV和ARV处在不同分支,建议将新型鸭呼肠孤病毒分类在正呼肠孤病毒属的第Ⅱ亚群当中。     

禽呼肠孤病毒C-98分离株S3基因的克隆及序列分析

参考GenBank中禽呼肠孤病毒S3基因序列设计一对引物,以禽呼肠孤病毒内蒙古分离株(C-98)基因组RNA为模板,应用RT-PCR方法获得病毒的S3基因,并克隆到pMD19-T载体后测序。应用计算机软件将所测定序列与参考毒株ARV 176、ARV S1133、ARV 138的S3基因序列进行比较,核苷酸同源性分别为99.8%,99.6%,87.7%,推导其氨基酸同源性分别为99.5%,98.9%,94.8%。应用PHD程序和DNAStar软件,对S3基因所编码的σB蛋白结构进行预测,结果表明,σB蛋白为结构紧密的球状蛋白分子。     

禽呼肠孤病毒C-98分离株M1基因的克隆及序列分析

参考GenBank发表的禽呼肠孤病毒M1基因序列设计2对引物（M1-1、M1-2）。应用RT-PCR扩增禽呼肠孤病毒内蒙古分离株C-98的M1基因序列。将纯化的目的基因片断与PMD19-T载体连接并转化DH5α感受态细胞，将经鉴定为阳性的重组菌送生物工程公司测序。结果表明,ARVC-98株M1基因片段长2283bp，具有完整的开放性阅读框架，编码732个氨基酸残基的μ1蛋白。ARVC-98分离株M1基因与ARV参考毒株M1的核苷酸同源性为89．1％～99．7％，与哺乳动物M1基因序列同源性较低，约为28％。     

中国禽(番鸭)呼肠孤病毒YB株S4基因序列分析

应用非免疫番鸭胚增殖中国禽(番鸭)呼肠孤病毒YB分离株,用LSTRIAZOL提取病毒RNA,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增中国禽(番鸭)呼肠孤病毒YB分离株S4基因节段cDNA.将S4cDNA克隆到PMDl8-T载体上,并进行了鉴定和核苷酸序列测定.序列分析结果,克隆的S4cDNA共1 124bp,包括非编码区和完整的阅读框架.分子进化系统分析表明该毒株与禽呼肠孤病毒(鸡呼肠孤病毒)的亲缘关系较远,DRV-YB与DRV-89330同缘率为93.3%.     

鸡病毒性关节炎病毒C-98分离株S1基因的克隆与序列分析

提取鸡病毒性关节炎病毒（AVAV）内蒙古分离株（C-98株）总RNA，参考GenBank中禽呼肠孤病毒（ARV）S1133株S1基因序列设计了2对引物，应用RT—PCR技术扩增了病毒S1基因，将S1基因cDNA克隆到pGEM—T Easy载体后测序。将测定序列拼接后与参考毒株ARV-176、ARV-138、ARV-S1133、MDRV—YJL的S1基因序列进行了比较。结果显示，AVAV C-98分离株的S1基因与强毒株ARV-176株的同源性最高，达99．9％；与MDRV—YJL的同源性为99．3％，与弱毒疫苗株ARV—S1133的同源性也达97．9％；与ARV-138株的同源性最低，为81．2％。表明，AVAVC-98株与参考毒株的差异较小，与疫苗株ARV-S1133有很高的同源性。     

番鸭呼肠孤病毒σB和σNS基因克隆及序列分析

参考GenBank番鸭呼肠孤病毒(muscovy duck reovirus,DRV)σB和σNS基因序列设计合成引物,对番鸭呼肠孤病毒MW9710株σB和σNS基因进行RT-PCR扩增,并对PCR产物进行了克隆和测序。结果显示扩增产物分别为1154bp和1113 bp,与预期的目的片段大小一致。核苷酸序列经BLAST软件分析表明：番鸭呼肠孤病毒MW9710株σB基因与番鸭呼肠孤病毒法国89026株同源性为88．1%；氨基酸同源性为94．0%：σNS基因与法国89026株和89330株同源性分别为93．8%和93．1%；氨基酸同源性为95．9%和95．1%。而σB和σNS基因与禽呼肠孤病毒的同源性约为60%～80%。表明番鸭呼肠孤病毒是不同于禽呼肠孤病毒的独立基因群。     

番鸭呼肠孤病毒MW9710σC蛋白基因克隆及其在E.coli中表达

应用RT2PCR扩增出番鸭呼肠孤病毒MW9710株的σC基因,序列分析表明σC基因核苷酸数为810bp,编码269个氨基酸,相对分子量为29.4ku,DNAstar软件分析MW9710株的σC核苷酸序列和法国番鸭呼肠孤病毒89026株有93%的同源性,而与禽呼肠孤病毒的同源性仅在21%～25%之间,表明番鸭呼肠孤病毒是一类不同于禽呼肠孤病毒的新病毒。将σC基因片段亚克隆到原核表达载体pET32a中,经IPTG诱导后在大肠杆菌BL21(DE3)中得到高效表达,Western2blot进一步验证了表达产物与番鸭呼肠孤病毒阳性血清反应,表明σC基因表达产物具有免疫原性,为下一步研制番鸭呼肠孤病毒诊断试剂盒和基因工程疫苗奠定基础。     

禽呼肠孤病毒分离株δ3蛋白基因克隆及序列分析

本研究将禽呼肠孤病毒广西两分离株R1、R2和美国分离株Iso1 S1基因中编码σ3蛋白的基因片段进行克隆和鉴定.对克隆片段测序后与参考株S1133、1733、138、176毒株的S1基因相应序列进行比较分析.结果表明,广西分离株R1、R2与美国分离株Iso1以及S1133、1733、176毒株的核苷酸和推导氨基酸的同源性均在95%以上,上参考株138的同源性在81%～85%之间.由此可见,除了与138参考株外,广西分离株R1、R2和美国分离株Iso1与其他比较的毒株的S1基因上存在很大的相关性.     

鸭Ⅰ型禽副粘病毒YH99V株HN基因的克隆和序列分析

在浙江地区进行鸭病病因的调查过程中，从患病鸭群中分离到一株引起鸭产蛋锐减而不死亡的病毒，经鉴定该病毒属于禽副粘病毒Ⅰ型，命名为YH99V株。以YH99V株的基因组RNA为模板，通过RT—PCR一步法扩增出其HN基因的cDNA片段，然后将其克隆至pMD18-T载体中，对其进行序列测定。测序后拼接出HN基因的序列长度为1785bp，该基因的ORF总长为1734bp，编码577个氨基酸。将YH99V株HN基因序列和推导的氨基酸序列与新城疫毒株的HN基因相应序列比较后发现，它们的核苷酸序列同源性分别在82．1％～99．7％，氨基酸序列同源性为87．2％～99．5％。在同源性比较的基础上，进一步绘制了Ⅰ型禽副粘病毒株HN基因的系统发育树。这对于Ⅰ型禽副粘病毒毒力基因的功能分析和该病的分子流行病调查有着重要的意义。     

新城疫病毒贵州不同鸡源分离株F基因的克隆与序列分析

应用PCR技术扩增NDV贵州不同鸡源分离株,包括肉鸡源P1株与BY株、蛋鸡源H2株与FW株、七彩山鸡源N98株和越南斗鸡源DQ株的F蛋白基因,将该基因片段分别进行克隆和测序,并与国内外NDV参考株的对应序列进行比较分析。结果表明:6株NDV贵州不同鸡源分离株的F基因长度均为1 662 bp,编码553个氨基酸;分离株间核苷酸同源性为86.9%~99.7%,氨基酸同源性为91.0%~99.3%;与国内外NDV代表株(LaSota株、B1株、F48E9株、CH2000株和TW 2000株)的核苷酸同源性为84.0%~98.9%,氨基酸同源性为87.2%~98.6%;经系统发育进化树分析,DQ株、N98株、P1株和H2株为基因VIId型,而BY株和FW株为基因IX型。这些结果提示贵州省不同鸡群间存在相同NDV毒株感染的可能性,不同年份间NDV毒株发生基因型改变,而近年来贵州省流行的ND疫情主要是由NDV基因VII型引起。     

应用RT-PCR技术检测番鸭呼肠孤病毒

参考 Gen Bank中番鸭呼肠孤病毒 (m uscovy duck reovirus,MDRV ) S1基因序列 ,用计算机设计并合成了 1对引物 HP11、HP12 ,以此引物用 RT- PCR对番鸭呼肠孤病毒 S1基因进行了特异性扩增。结果表明 :引物 HP11、HP12能从所有供试的 4株分离毒 MDRV- MW9710、MW980 6、MW980 9、MW9810扩增出 30 0 bp S1基因 c DNA片段 ,而不能从禽呼肠孤病毒 (ARV) S1133株和番鸭胚成纤维 (MDEF)细胞培养物中扩增出任何片段 ;该 RT- PCR的检测灵敏度为 1pg的病毒核酸 ,特异性强 ,重复性好 ,对含毒细胞培养液和尿囊液只需用氯仿进行简单处理 ,即能检测出 MDRV核酸。因此认为 ,该 RT- PCR可以用于番鸭呼肠孤病毒的快速检测     

中国禽(番鸭)呼肠孤病毒分离株S1基因全序列分析

采用RT-PCR技术,分别以DRV-YH、DRV-YJL两株中国禽(番鸭)呼肠孤病毒RNA为模板,扩增了S1全基因的cDNA片段.将S1 cDNA克隆到T载体后进行序列测定,测序结果表明所扩增的cDNA片段长1643个核苷酸,包含了完整的S1基因的三个开放阅读框架(ORF1,ORF2和ORF3)和基因两端的非编码区.核苷酸序列比较分析结果表明:DRV-YH与ARV-S1133,176分别有6个,10个核苷酸的差异,DRV-YJL与ARV-S1133,176分别有8个,12个核苷酸的差异,DRV-YH与DRV-YJL有4个核苷酸的差异.     

番鸭"新鸭疫"病原中呼肠孤病毒的初步确证

1999年底以来,在浙江省的青壮年番鸭中新爆发了主要表现为食欲下降、咳嗽、流涕、喙和蹼发绀、拉稀、死亡率很高的烈性传染病,病理剖解主要表现为肝脏肿大、质脆,个别病例有不规则的坏死斑;脾肿大、有的病例坏死呈花斑;胰有多量、点状的坏死灶;肠道黏膜常有环状出血灶等。据当地百姓的俗称,笔者暂时把这种疾病定名为番鸭“新鸭疫”。     

猪巨细胞病毒gB基因的克隆与序列分析

应用PCR方法,从郑州、福建、浙江金华和宁波猪肺脏中分别扩增出4段PCMV gB基因,并将其分别克隆入pMD18-T载体,经蓝白斑筛选和PCR鉴定,将阳性克隆进行序列分析并构建系统进化树。序列分析表明,其gB基因全长为2 580bp,编码860个氨基酸,与PCMV其他序列相比,其同源性在96.1%～99.7%,与β疱疹病毒亚科中其他常见毒株同源性在25.9%～38.1%;推导的氨基酸序列,有11个半胱氨酸,17个潜在N-糖基化位点,其裂解位点是RYKR;系统进化树分析发现,推导的氨基酸序列出现两个分支,而且来自上述4个地区PCMV gB糖蛋白氨基酸序列处在不同的分支中。     

水貂奇异变形杆菌的分离鉴定及16S rRNA基因序列分析

从辽宁某貂场发病水貂中分离到1株致病菌,命名为PMSD株,通过形态学观察和生化试验等常规鉴定发现符合奇异变形杆菌特性,进一步经VITEK 2Compact 30全自动细菌鉴定及药敏分析系统鉴定该株细菌为奇异变形杆菌。药敏试验结果显示PMSD株对氨基糖苷类药物、喹诺酮类药物等敏感,而对β-内酰胺类药物和磺胺类药物等不敏感。以细菌16SrRNA基因为模板应用通用引物进行PCR扩增,得到PMSD株的16SrRNA基因序列,长约1 504bp,提交到GenBank中,登录号:KM229530。将该序列与GenBank中序列进行BLAST比对,结果发现与其匹配度最高的均是奇异变形杆菌各株系的16SrRNA序列,均高达99%以上。选取其中前20株作为参考序列,运用生物学软件构建系统发育树并进行同源性比对,结果表明,分离菌PMSD株与20个代表菌株的同源性为98.9%~99.7%,其中与BB2000株、HI4320株、B1株和FCC141株同源性最高,为99.7%。本研究为预防和控制奇异变形杆菌引起的水貂疾病奠定了一定的基础。     

Comparison of a vaccine strain and field isolates of avian reovirus by T1-oligonucleotide mapping.

Total RNA of eight avian reovirus isolates and the S1133 strain were compared by RNase T1-oligonucleotide mapping. The viruses were propagated in Vero cell cultures, and viral genomes were extracted from purified virions for comparison. Pairwise comparisons of the oligonucleotide maps showed genetic variation among reovirus isolates ranging from 78% to 99%. The T1 fingerprints of the RNA of isolates 1103, 724, 615, and 684 differed slightly from the standard S1133 strain, suggesting that the vaccine strain might have changed and became part of the circulating reoviruses. In contrast, when compared with the vaccine strain, isolates 902, 644, and 6207 showed greater differences in the fingerprint pattern. This genomic diversity may be due to the differences in immunological status of the affected avian population and/or due to simultaneous coinfection with different reovirus strains.