Clade2.3.2 H5N1亚型禽流感疫苗候选株的构建

近年来Clade2.3.2H5N1亚型的禽流感病毒逐渐成为我国及越南等其他一些国家流行的优势毒株,并呈现出一定变化规律的氨基酸进化趋势。本研究以A/Puerto Rico/8/34(H1N1)(PR8)AIV为内部基因供体,以Clade2.3.2H5N1亚型AIV A/chicken/Yangzhou/1117/2011(YZC3)为表面抗原血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因供体,通过反向遗传操作,在符合人类疫苗生产标准的COS-1细胞中救获低致病性的疫苗毒株。结果成功拯救出1株重组病毒rYZC3,该病毒在鸡胚和MDCK细胞上均具有较好的繁殖能力,对SPF鸡和鸡胚无致病性。本研究为防控当代流行的H5亚型禽流感提供了良好的疫苗候选株。     

鸭源H5亚型禽流感全禽源分子标记疫苗候选株的构建

为了开发用于南方水禽且适合血清学监测的H5亚型禽流感疫苗,作者通过反向遗传技术,删除A/mallard/Huadong/S/2005(H5N1,S株)病毒HA编码多碱性氨基酸序列,使之成为低致病特征,分别与A/duck/England/1/1956(H11N6,E株)和A/Chicken/Shanghi/F/98(H9N2,F株)的NA组合,再以本室禽源高产病毒F株的6个内部片段为骨架,构建全部基因都来自禽流感的疫苗株.成功拯救出2株重组病毒,分别命名为rH5N6/F和rH5N2/F,并引入分子标记N6和N2.重组病毒在鸡胚和MDCK细胞上均具有较好的繁殖能力,且rH5N6/F更适合在鸡胚中生产,对SPF鸡和鸡胚无致病性.重组病毒在clade2.3.4毒株中具有很好的抗原代表性,引入的分子标记有利于血清学监测的区分,为防控水禽H5亚型禽流感提供了良好的疫苗候选株.     

第2.3.2.1分支H5亚型禽流感变异株候选疫苗株的构建及免疫效力试验

第2.3.2.1分支H5N1亚型禽流感病毒(AIV)抗原性目前已发生显著变异。为应对变异株可能引发的流行,利用反向遗传技术,以鸡胚适应毒A/Puerto Rico/8/34(PR8)的内部基因为骨架,以H5N1亚型AIV A/duck/JS/ZJ/2016(H5N1)(ZJ,第2.3.2.1d分支)、A/Chicken/SD/YT/2015(H5N1)(YT,第2.3.2.1e分支)的基因组为模板,扩增其HA及NA基因,并对HA基因进行修饰,去除裂解位点处的多个碱性氨基酸,使其获得低致病性AIV的分子特征,成功构建了第2.3.2.1分支H5N1亚型AIV疫苗候选株rZJ和rYT。抗原性分析显示,rZJ和rYT与Re-6疫苗株之间的抗原性已有显著差异。免疫效力试验表明,rZJ和rYT重组灭活疫苗免疫21 d的平均HI抗体效价分别达到8.8 log2和8.9 log2,说明重组疫苗具备良好的免疫原性。免疫攻毒保护试验表明,rZJ和rYT重组灭活疫苗可以提供SPF鸡抵抗同源H5N1病毒100%的保护,而针对第2.3.2.1分支的Re-6疫苗仅能提供大约40%和30%的保护。利用反向遗传技术构建的rZJ和rYT重组候选疫苗株为该分支病毒的防控提供了技术支持。     

新型H5亚型禽流感疫苗研制成功

在农业部和科技部共同主持及国家“973”、“863”和“攻关”项目资助下,通过30多位科研人员不懈的努力,具有国际先进水平的高效、安全新型H5N1亚型禽流感灭活疫苗和重组禽痘病毒活载体疫苗研制成功。新型H5亚型禽流感灭活疫苗系由高度致弱的H5N1亚型疫苗种子株制备,该疫苗种     

H5亚型禽流感病毒多肽疫苗的初步研制

本试验利用生物软件对H5亚型禽流感病毒A/CK/GD/178/04的血凝素进行抗原特性分析,结合关于禽流感病毒血凝素抗原位点的文献报道,选定97～212位氨基酸和369～529位氨基酸两个区域作为多肽表位候选区域.利用本实验室自主研发的原核表达载体pBT载体,串联表达HA的两个区域,经SDS-PAGE和Western Blotting分析,证明重组产物得到表达,Ni2+柱纯化重组蛋白后,对2周龄SPF鸡进行免疫,经HI试验检测该重组蛋白可以刺激机体产生HI抗体.本研究为H5亚型AIV多肽疫苗的进一步研制奠定了基础.     

H5N6亚型禽流感病毒反向遗传疫苗株的构建及免疫保护试验

为应对抗原性已发生变异的第2.3.4.6分支H5N6亚型禽流感病毒(AIV)引发的潜在流行,本研究利用反向遗传操作技术,以A/Puerto Rico/8/34(PR8)的内部基因为骨架,以H5N6亚型AIV A/Chicken/SC/6/2014(C6)的基因组为模板,经RT-PCR扩增其HA及NA基因,并对HA基因进行分子修饰,去除与H5亚型AIV致病力有关的HA蛋白裂解位点处的多个碱性氨基酸,使其获得低致病性AIV的分子特征(即将-PLRERRRKR-突变为-PQRETR-),成功构建了H5N6亚型AIV疫苗候选株r C6。免疫效力试验表明,r C6重组灭活疫苗可以诱导产生高水平的血凝抑制抗体。免疫攻毒保护试验表明,r C6重组灭活疫苗可以提供SPF鸡抵抗同源和异源H5N6病毒100%的保护,而针对第2.3.4分支的Re-5疫苗仅能提供大约10%的保护。利用反向遗传技术构建的r C6重组疫苗候选株为该分支病毒的防控提供了有益的尝试。     

H7N9亚型禽流感病毒反向遗传操作系统的建立及其疫苗候选株的构建

为建立H7N9亚型禽流感病毒(AIV)反向遗传操作系统,本研究以H7N9亚型(AIV)A/CK/Shanghai/S1053/2013(CK/53)株为亲本病毒,构建了该病毒株的8质粒反向遗传操作系统,并拯救出救获株rCK/53。全基因组序列测定结果表明,rCK/53与亲本病毒的核苷酸序列完全一致。同时以A/PueaoRico/8/34(PR8)的内部基因为骨架,以CK/53的HA和NA的表面基因为供体,构建H7N9亚型AIV疫苗候选株CK53/PR8,疫苗株的8个基因来源与预期完全一致。对rCK/53以及疫苗候选株CK53/PR8在MDCK和A549两种细胞中进行生物学特性的比较,在A549中复制差异不显著,而在MDCK中48 h和72 h两者复制具有明显差异。rCK/53反向遗传操作系统的建立和疫苗候选株CK53/PR8的构建为进一步开展H7N9亚型AIV跨宿主传播机制、致病机理及进一步的免疫保护实验奠定了基础。     

成年鸽子禽流感H5亚型疫苗筛选试验报告

采用禽流感H5N1疫苗和H5N2疫苗分别对6月龄以上成年肉鸽和信鸽进行免疫试验,于免疫后0～72h观察免疫鸽群有无不良组织反应产生,并用血凝抑制试验作为评估H5N1疫苗和H5N2疫苗反应的标准,来评估两种疫苗对鸽子的免疫效力。试验结果表明,成年信鸽和成年肉鸽对H5N1疫苗和H5N2疫苗均无不良组织反应产生;成年信鸽和成年肉鸽免疫H5N1疫苗和H5N2疫苗后产生HI抗体效价比较,H5N1疫苗较H5N2疫苗免疫抗体效价高;信鸽试验组和肉鸽试验组免疫同种疫苗组间差异不显著。     

H9N2亚型禽流感疫苗株的筛选

为了筛选免疫原性更好的H9N2亚型禽流感病毒疫苗株。本研究在分析H9N2病毒HA基因遗传进化规律基础上,对预选的毒株进行血凝效价(HA)、鸡胚半数感染量(EID50)测定及交叉血凝抑制试验,筛选出疫苗用毒株进行免疫攻毒保护试验。结果显示,CK/AH/AJ3/15株HA效价达11 log2、EID50值为9.17 log10/0.1 mL,有很好的繁殖能力;对当前流行株的HI反应效价比疫苗株F/98高2-3个滴度;以CK/AH/AJ3/15株制作灭活疫苗,整体保护率达到97.5%,比F/98疫苗株的85%明显提高。表明CK/AH/AJ3/15株可以作为H9N2亚型禽流感新型疫苗株的候选株。     

H5亚型禽流感重组鸡痘病毒活载体疫苗

H5亚型禽流感重组鸡痘病毒活载体疫苗系以高度成熟安全的鸡痘病毒为载体研制的新型基因工程禽流感一鸡痘二联疫苗，该疫苗毒株的研制是采用重组DNA技术，将我国H5N1亚型禽流感病毒早期分离株的HA和NA基因同源重组到鸡痘病毒疫苗株的基因组中，构建重组鸡痘病毒(rFPV—HA—NA)，经体外、体内试验表明该重组鸡痘病毒具有良好的免疫原性。同时经细胞连续传代，证实了重组鸡痘病毒具有良好的遗传稳定性，从而进一步保证了该疫苗的免疫原性。     

H5亚型禽流感DNA疫苗质粒pCAGGoptiHA5对高致病力禽流感病毒攻击的免疫保护

对H5亚型禽流感DNA疫苗质粒pCAGGoptiHA5的免疫效果进行了研究。pCAGGoptiHA5分别以100和10μg剂量一次或两次免疫3周龄SPF鸡，首次免疫后4周以同样剂量和途径进行第二次免疫，一次免疫后4周、两次免疫后2周分别用100LD50的HPAIV A／Goose／GuangDong／1／96（H5N1）鼻腔途径进行攻击，观察发病与死亡情况，分别于攻毒后第3、5、7天采集喉头及泄殖腔拭子进行病毒分离、滴定检测排毒情况，同时检测免疫后、攻毒前及攻毒后血清HI抗体、NT抗体以及AGP抗体的动态变化。结果，100μg pCAGGoptiHA5一次免疫、100μg pCAGGoptiHA5两次免疫以及10μg pCAGGoptiHA5两次免疫均可对免疫鸡形成100％完全保护（不发病、不致死、不排毒），10μg剂量pCAGGoptiHA5一次免疫可对免疫鸡形成100％的保护（不发病、不致死），结果表明，pCAGGoptiHA5作为疫苗效果良好、成本低廉，有望成为预防H5亚型高致病力禽流感的高效、安全新型基因工程疫苗。     

肉鹅H5亚型禽流感疫苗免疫效果的研究

选用H 5亚型禽流感油乳剂灭活疫苗(H 5N 1,R e1株)对马岗鹅作首免日龄、免疫次数与免疫剂量的免疫试验。结果表明,雏鹅在7、14或21日龄作1次免疫均产生免疫应答,其中14与21日龄免疫组免疫后第5周抗体水平均达4 log2以上,抗体动态变化均值与峰值均高于7日龄免疫组2~3个滴度。用0.5、1和2 m l/只3个剂量对14日龄雏鹅的免疫试验中,0.5m l组抗体水平上升过程缓慢,免疫后4周抗体水平才达4 log2以上,1与2 m l组在免疫1周后上升速度较快,免疫后2周即达4 log2以上,抗体水平相近,但2 m l免疫组免疫后5~7周抗体水平均低于1 m l免疫组。说明接种剂量为1或2 m lH 5N 1油苗比接种0.5 m l的免疫效果好,尤以1 m l免疫剂量效果最好。雏鹅在7、14日龄或14、21日龄作2次免疫和7、14、21日龄作3次免疫,首免后抗体上升速度快,各检测点抗体水平均值相近,均在首免后3周达到4 log2以上,4~5周达6 log2以上,4~7周的抗体水平均高于14日龄1次免疫组,且提前2周达到4 log2以上,说明2次、3次免疫组的抗体水平高于1次免疫组,而2次与3次免疫组的抗体水平无明显差异。以上结果说明,在肉鹅生产的禽流感免疫中,选择以14日龄首免0.5 m l/只,21日龄2免接种1 m l/只可取得较为理想的免疫效果。     

禽流感H9亚型病毒WD株毒种的纯化研究

采用鸡胚终点稀释法并结合ND抗血清中和法对禽流感H9亚型病毒WD株毒种进行了纯化。将纯化的WD株毒种在SPF鸡胚连续传12代，对各代次毒种进行了毒价测定，选择一定代次的毒种进行了免疫原性试验及外源病毒检验。结果表明，WD株在鸡胚中连续传12代，其HA价稳定在1：512—1：1024，毒价在10^7.0-10^8.3 EID50／0．1mL；不同代次毒种不含外源病毒，免疫原性均符合要求。由此可见，毒种的纯化方法是有效的，将WD株毒种限制在12代内是可行的，并建立了该毒种的种子批。     

一株H5N6亚型禽流感病毒对鸭和小鼠的致病性研究

为了研究一株从鹭中分离到的禽流感病毒(AIV)A/Heron/Guangdong/C1/2013(H5N6)对鸭和小鼠的致病力,本研究通过对鸭和小鼠滴鼻点眼和鸡的颈静脉注射进行攻毒试验,观察其致病力和组织病理学等变化,对其生物学特性进行初步研究。结果显示,该毒株的鸡胚半数感染量(EID₅₀)为10^-8.16/0.1 mL,静脉接种致病指数(IVPI)为2.76。对鸭的半数致死量(LD₅₀)为10^-4.0/0.2 mL,对小鼠的LD₅₀为10^-4.67/0.05 mL。以10⁶ EID₅₀/只滴鼻点眼感染鸭,主要表现为食欲下降、精神萎靡、肿头流泪等症状,大多数鸭在感染后4~7 d死亡,感染后第7 天肝脏、肺脏、肾脏仍在排毒,解剖可见心包积液、肺脏淤血、肾脏肿大等症状,病理切片可见心脏、肝脏、脾脏、肾脏炎性细胞浸润,脑细胞核固缩等病变。以5×10⁵ EID₅₀/只滴鼻感染小鼠,主要表现为食欲下降、精神萎靡、被毛粗乱、聚堆等症状,大部分小鼠在感染后5~7 d死亡,第7天时只有肺脏仍在排毒,各脏器解剖学病变不明显,病理切片可见心脏、肾脏、肺脏炎性细胞浸润,脑细胞核固缩等病变。研究结果表明,该H5N6亚型AIV毒株对鸭和小鼠具有很强的致病力,IVPI大于1.2,为高致病性AIV,本研究为H5N6亚型AIV研究和防控提供了理论基础。     

Pathogenicity of a Strain of H5N6 Subtype Avian Influenza Virus in Ducks and Mice

To investigate the pathogenicity of A/Hero/Guangdong/C1/2013(H5N6), an AIV strain isolated from Heron on ducks and mice, pathogenicity of this new virus strain and changing of histopathology as well as a preliminary study on its biological characteristics were studied by virus challenges test via intranasal and eye-drop and in chicken via jugular vein injection.Results showed that the EID₅₀ of this strain of virus was 10^-8.16/0.1 mL in embryonated chicken eggs and the intravenous inoculation of pathogenic index (IVPI) was 2.76.In ducks and mice, the 50% lethal doses (LD₅₀) of it were determined to be 10^-4.0/0.2 mL and 10^-4.67/0.05 mL, respectively.Symptoms of infection included loss of appetite, depression, swollen head and tears after being infected with 10⁶ EID₅₀ per duck by intranasal and eye-drop administration.Most of ducks died 4 to 7 days post-infection, liver, lung and kidney still eliminated toxicants at day 7 post-infection.Anatomy showed symptoms of pericardial effusion, pulmonary congestion and kidney enlargement, while pathological section showed pathological change like karyopycnosis and inflammatory cell infiltration in heart, liver, kidney and spleen.Mice developed symptoms of infection like loss of appetite, depression, shaggy coat and ruffled coat after being infected with 5×10⁵ EID₅₀ per mouse by intranasal and eye-drop administration.Most of the infected mice died 5 to 7 days post-infection and only liver still eliminated toxicants at day 7 post-infection.Although organ anatomy showed no obvious pathological changes, pathological section showed pathological changes like karyopycnosis and inflammatory cell infiltration in heart, kidney and lung.Our research demonstrated that this H5N6 subtype AIV had a strong pathogenicity and could be defined as a highly pathogenic AIV strain as its IVPI was greater than 1.2.Our work laid a theory foundation for study, prevention and control of H5N6 subtype AIV.     

H5N1亚型禽流感病毒疫苗的研究现状及应用前景

H5N1亚型禽流感病毒是目前发现的禽流感病毒中感染性最强、致死率最高、流行最广的一类病毒,该病毒已在世界上多个国家发生流行,给禽类养殖业带来了巨大的经济损失。当前针对该病尚无高效特异的治疗方法,进行疫苗的接种是目前最为有效的预防措施和关键环节。因此,研制安全、高效、廉价的新型疫苗成为当前禽流感防制工作的热点之一,且取得了大量的研究成果。作者从禽流感病毒灭活疫苗、减毒活疫苗、基因工程疫苗和RNAi技术应用等方面对H5N1亚型禽流感病毒疫苗的研究现状作一综述,归纳出该领域中存在的问题和不足,并对禽流感疫苗的应用前景作一展望,以期为深入进行禽流感的防制研究提供参考。