玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63nsdAmgh基因的验证

玫瑰黄链霉菌(Streptomyces roseoflavus)Men-myco-93-63是分离自马铃薯疮痂病自然衰退土壤中的一株拮抗菌。该菌株及其发酵液对棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae)等多种重要的植物病原真菌都具有较强的抑制作用。nsdA(negative regulator of Streptomyces differentiation)基因是从天蓝色链霉菌中发现的与抗生素合成相关的负调控基因。根据天蓝色链霉菌A3(2)的序列设计引物,PCR扩增出Men-myco-93-63nsdAmgh基因,经斑点杂交法验证,nsdAmgh确实在该生防菌中存在。该基因的发现有助于进一步了解该生防菌产生抗生素调节的分子机制,也为抗生素高产菌株的获得提供了新的靶标。     

玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63原生质体形成 和再生条件的初探

玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63在温室及大田试验中都对棉花黄萎病菌表现出很强的拮抗作用,是一株很有应用潜力的生防菌株。不论是菌丝体本身还是其代谢产物都对多种植物病原菌有很强的抑制作用。对该生防菌株进行深入研究,尤其是分子水平的研究尤为重要。笔者通过研究影响链霉菌原生质体形成的多种条件和因素,包括培养基的选择、培养时间、甘氨酸浓度、溶菌酶浓度、酶解时间等,最终成功的制备出了生防菌Men-myco-93-63的原生质体,初步确定了其形成条件:TSB培养基一级培养24h,用SGGP作为二级培养基培养菌丝体40h(补加甘氨酸2%),将菌丝体加入2mg/ml溶菌酶37℃水浴60min后即可得到原生质体,涂在再生培养基R5上再生培养,再生数可达4.8×106个/ml。为该生防菌原生质体的转化、基因表达等研究奠定了重要的基础。     

玫瑰黄链霉菌Men myco 93 63固体发酵培养基的优化

研究玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63固体发酵培养基优化条件。采用单因素试验筛选的适宜得到固体基质为硅藻土,m(硅藻土)∶V(种子液)=2∶1,对菌落形成单位数有影响的因素为葡萄糖、蛋白胨、复合维生素和复合微量元素。在此基础上,通过响应面法对4个因素的组合进行优化,优化后这4个因素的质量分数最佳组合为葡萄糖2.2%、蛋白胨0.7%、复合维生素1.0‰、复合微量元素1×10-5。在此条件下,菌落形成单位数有了很大提高,达到1.7×108cfu/g。     

玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63有效成分的初步提取与纯化

为了解玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63的代谢产物和其生物活性,对该菌株进行摇瓶培养,从菌丝中提取到一种对棉花黄萎病菌有明显抑制作用的有效成分。经过XAD-1600型大孔吸附树脂,ODS C18硅胶中压柱分离得到黄白色粉末。HPLC检测后,初步断定该物质是一类非常相似的物质组成的混合物,并且极有可能具备互变异构的特性。     

玫瑰黄链霉菌抗药性标记及其定殖和促生作用研究

选用腐霉利、多菌灵、甲基托布津、利福平、青霉素、链霉素、泰乐菌素、重铬酸钾等8种常用抗生素或杀菌剂,通过抗药性标记试验,建立了玫瑰黄链霉菌(Stremptomyces roseoflavus)Men-myco-93-63的抗药性标记,确定了重铬酸钾(0.06g/L)/青霉素(0.2g/L)为适合检测该菌株的标记药剂及浓度。通过获得的抗药性标记,结合菌落形态观察和16SrDNA序列分析,研究了Men-myco-93-63在番茄根际土壤中的定殖动态和对植株生长的影响。结果表明,该生防菌在番茄根际土壤中能够定殖,接菌15d后定殖量达到最高,为5.6×105 cfu/g,之后下降,到30d后检测不到Men-myco-93-63菌株的存在。当使用Men-myco-93-63的固体发酵物与土壤以体积比1∶400混合时,对番茄苗期生长有促进作用。     

玫瑰黄链霉菌活性代谢产物诱导烟草灰霉病抗性机制研究

【目的】解析温室条件下玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63活性代谢产物Roflamycoin和Men-myco-A（简称R&M）诱导烟草灰霉病抗性的作用机制,为利用R&M绿色防控烟草灰霉病提供理论依据。【方法】通过80 mg/L R&M注射4~5叶期本生烟草叶片后过敏反应（HR）染色验证及100 mg/L R&M注...     

玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63中3个调控基因的检测

玫瑰黄链霉菌(Streptomyces roseoflavus)Men-myco-93-63及其发酵液对多种重要植物病原菌均表现出很强的抑制作用,在植物病害生物防治方面有很大的应用潜力。根据天蓝色链霉菌A3(2)调控基因tcrA、sarA和scrX序列设计引物,扩增Men-myco-93-63基因组DNA,分别获得705bp、1 472bp和473bp的片段,经测序和比对,上述片段与天蓝色链霉菌A3(2)的tcrA、sarA和scrX基因在核苷酸序列和氨基酸序列上同源性均为99%,因此,推测玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63中很可能含有这些调控基因。Men-myco-93-63中这3个调控基因的初步检测为玫瑰黄链霉菌功能基因的获得、菌株的遗传改良和代谢调控途径的研究提供了重要依据。     

玫瑰黄链霉菌Men myco 93 63抗南方根结线虫相关酶活性及其防效

根据雌虫会阴花纹特征将采集地河北省定州市西南合村黄瓜棚的根结线虫鉴定为南方根结线虫,并研究对多种植物病原菌具有较强抑制作用的玫瑰黄链霉菌Men myco 93 63对南方根结线虫的防效及其产生的与防治线虫相关的酶。结果表明,Men myco 93 63发酵液对根结线虫二龄幼虫的校正致死率达到100%,粗酶液对线虫的校正致死率达到94.87%。Men myco 93 63具有较强的胶原蛋白酶产生能力,也可产生丝氨酸蛋白酶和蛋白酶,发酵液中蛋白酶的活力达到473.363 7 U/mL。推测胶原蛋白酶、蛋白酶、丝氨酸蛋白酶等酶类在该生防菌对南方根结线虫的防治中起重要作用。温室盆栽试验结果表明,玫瑰黄链霉菌Men myco 93 63发酵液及其固体发酵物对根结线虫均有防效;其中,发酵液5倍稀释液对根结线虫的防效最好,达到39.99%。     

生防链霉菌Men-myco-93-63遗传转化体系的建立和优化*

玫瑰黄链霉菌(Streptomyces roseoflavus)Men-myco-93-63是分离自马铃薯疮痂病(S.scabies)自然衰退土壤中的一株拮抗菌.该菌株及其发酵液对棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae)、瓜类白粉病菌(Sphaerotheca fuziginea Poll.)等多种重要的植物病原菌具有很强的抑制作用,有良好的生防应用潜力.为了对玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63中一些功能基因进行研究,得到高产抗生素的工程菌株,首先应对该菌的遗传转化条件进行优化.作者分别以基因整合型质粒pSET152和基因破坏型质pKC1139为出发质粒,ET12567(PUZ8002,pSET152/pKC1139)为供体,Men-myco-93-63孢子和菌丝体为受体,选取MS、PDA、TSB琼脂培养基、燕麦培养基为不同的培养基进行接合转移试验.结果表明MS培养基为接合转移的最适培养基,经验证,已成功地将质粒pSET152/pKC1139转入到了Men-myco-93-63中.以孢子为受体时,孢子预萌发条件为50℃热激10 min,37℃温育2.5 h,转化效率是10-7～10-6.以菌丝体为受体时,转化效率是10-7～10-6,但菌丝培养过程中容易出现污染.另外,抗生素的覆盖时间对接合转移效率的影响较明显,16～18 h覆盖效果最好.     

玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63产抗生素发酵培养基的优化

以玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63为发酵菌株,采用Plackett-Burman试验设计、最陡爬坡试验、中心复合试验设计和响应面分析法,以抗生素产量为响应值,对其发酵培养基进行优化。首先,采用Plackett-Burman设计筛选出具有正显著效应的花生饼粉和玉米浆。其次,通过最陡爬坡试验逼近最大响应区域。最后,采用中心复合试验对这2个因素进行优化。最终确定发酵的最适培养基含量配方为葡萄糖2%,可溶性淀粉1%,花生饼粉4.96%,玉米浆2.66%,氯化钠0.4%,碳酸钙0.3%,磷酸二氢钾0.02%。优化后发酵培养基抗生素产量为2 030.6 mg/L,比优化前的771.9 mg/L提高了1.63倍。     

生防菌株Men-myco-93-63发酵培养基优化条件的研究

研究了碳源、氮源和无机盐对玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63发酵的影响,并用正交的方法优化了发酵培养基配方。最适碳源为葡萄糖和淀粉组合;最适氮源为花生饼粉和玉米浆组合;试验的8种无机盐中KH2PO4、CaCO3、NaCl为可提高发酵单位的3种无机盐。正交试验优化后确定的发酵培养基的配方为葡萄糖2.4%,淀粉0.8%,花生饼粉1.5%,玉米浆0.8%,KH2PO40.02%,NaCl 0.4%,CaCO30.3%,为大规模发酵生产奠定了基础。     

Construction of a Fosmid genomic library of Streptomyces roseoflavus Men-myco-93-63

To clone the antibiotic biosynthesis gene cluster of Streptomyces roseoflavus Men-myco-93-63, we constructed a Fosmid genomic library. The genomic DNA of the strain Men-myco-93-63 was isolated by the modified CTAB procedure, and the size of most genomic DNA fragments was larger than 150 kb. Then, a Fosmid genomic library containing more than 6000 clones was constructed. The average size of the inserted DNA in recombinant plasmids was 38.1 kb, and the probability of harboring any gene in the genome of the strain Men-myco-93-63 was 99.99%. The library coverage was at least a 10-fold genome equivalent. Therefore, the constructed Fosmid library meets the requirements as a standard genomic library     

生防链霉菌Men-myco-93-63nsdBmgh基因的克隆及序列分析

为了获得生防链霉菌Men-myco-93-63中nsdB基因,根据天蓝色链霉菌A3(2)负调控基因nsdB序列设计引物,扩增Men-myco-93-63基因组DNA,获得1 121 bp的片段,经NPA-PCR对其两端进行延伸,拼接后得到2 073 bp的全长序列,命名为nsd Bmgh.经Southern杂交验证,该...     

拮抗链霉菌Men-myco-93-63及其发酵液对棉花黄萎病菌生长的影响

本研究采用抑菌圈法和菌落生长法测定桔抗链霉菌 Ｍ ｅｎ－ｍｙｃｏ－ ９３－ ６３（５２３）及其发酵液对棉花黄萎病菌（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａｅ）Ｔ－９和河北省强致病力菌株Ｖ－ｈ菌体生长的影响。结果表明：链霉菌Ｍｅｎ－ｍｙｃｏ－９３－６３及其发酵液对棉花黄萎病菌菌体具有强烈的抑制作用,明显降低了棉花黄萎菌的生长量。同时发现,拮抗链霉菌及其发酵液对不同致病菌株表现不同的抑菌效果;Ｍｅｎ－ｍｙｃｏ－９３－６３发酵稀释液可使Ｖ．ｄａｈｌｉａｅ出现融菌现象。