EIAV反式激活蛋白(TAT)基因的分子克隆与序列测定

以马传染性贫血病毒 (EIAV)疫苗毒感染驴巨噬细胞培养物 ,在病毒繁殖期提取细胞总 RNA,反转录后使用特异引物扩增病毒基因组拼接产物。将扩增产物克隆、测序并与基因组全序列比较 ,确定了编码 EIAV反式激活蛋白(TAT)的转录产物及阅读框架 ,发现至少有 2种拼接产物编码 TAT。比较 2种阅读框架 ,以保守序列作为模板扩增得到完整的编码 EIAV反式激活蛋白的基因。     

编码EIAV核输出因子蛋白Rev的cDNA克隆和序列测定

ＥＩＡＶ在繁殖过程中涉及到多种转录因子的调节,其中Ｒｅｖ蛋白是病毒编码的转录后调节因子,决定了病毒复制由早期到晚期的过渡。Ｒｅｖ是非结构蛋白,由病毒基因组全长转录产物经多次拼接而成。本研究使用ＥＩＡＶ疫苗毒感染驴巨噬细胞培养物,在病毒繁殖早期提取细胞总ＲＮＡ,反转录后使用中国ＥＩＡＶ毒株特异引物扩增病毒基因组拼接产物。将扩增产物克隆后经过核苷酸序列分析,和与基因组全序列的比较,确定了编码Ｒｅｖ蛋白的病毒基因组转录产物的编码序列和拼接位点。     

编码EIAV核输出因子蛋白Rev的cDNA克隆和序列测定

EIAV在繁殖过程中涉及到多种转录因子的调节，其中Rev蛋白是病毒编码的转录后调节因子，决定了病毒复制由早期到晚期的过渡，Rev是非结构蛋白，由病毒基因组全长转录产物经多次拼接而成。本研究使用EIAV疫苗毒感染驴巨噬细胞培养物，在病毒增殖早期提取总RNA，反转录后使用EIAV特异引物扩增病毒基因组拼接产物，将扩增产物克隆后经过核苷酸序列分析，通过与基因组全序列的比较，确定了编码Rev蛋白的病毒基因组转录产物的编码序列和拼接位点。     

猪IL-2和IL-6 cDNA的克隆及序列测定

白细胞介素２（ＩＬ－２）是一种由Ｔ淋巴细胞分泌的,在机体免疫应答中起关键作用的细胞因子,其主要生理功能是促进Ｔ淋巴细胞的增殖。ＩＬ－６可由多种不同类型的淋巴细胞和非淋巴细胞产生,诱导Ｂ细胞增殖分化产生抗体,并对Ｔ细胞的增殖生长起辅助信号的作用。目前,...     

马传贫驴白细胞疫苗株反式激活蛋白基因的克隆与表达

马传染性贫血病毒(Equine infectious anemia virus,EIAV)属于逆转录病毒科慢病毒属,由该病毒引起的马传染性贫血(简称马传贫或EIA)是马属动物的一种非常重要的传染     

猪源鹦鹉热衣原体外膜主蛋白编码基因的克隆和序列测定

运用PCR技术扩增3株猪源鹦鹉热衣原体的外膜主蛋白（MOMP）编码基因，将扩增产物连接到pMD 18-T载体克隆，经酶切鉴定，PCR鉴定并分析其序列，3菌株的MOMP核苷酸序列的同源性为98．4％－99．0％，氨基酸序列的同源性为97．5％－98．1％，他们之间的差异很小，属于同一血清型，与国外发表的GPIC株及Mn株的MOMP比较，核苷酸序列的同源性分别为79．5％－80．4％和70．9％－71．3％，氨基酸序列的同源 分别为84．2％－84．7％和80．2％－80．5％，同时发现3菌株与GPIC株具有相似的基因可变区，而与Mn株的差异较大。     

梅花鹿Ghrelin cDNA的克隆及序列分析

为了扩增梅花鹿Ghrelin基因的cDNA序列,根据已发表的驯鹿生长素Ghrelin基因的cDNA序列设计并合成1对特异性引物,以梅花鹿皱胃组织中提取的总RNA为模板,通过反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)进行cDNA扩增,获得了300 bp片段,重组到pBlueselect T载体,经限制性内切酶谱分析和DNA序列分析,确认PCR产物为Ghrelin cDNA。     

牛BMP4基因部分cDNA的克隆和序列分析

参考人和老鼠BMP4基因序列信息,选取保守基因序列设计上下游引物,扩增牛的BMP4基因部分cDNA序列。将该片段重组到栽体中,筛选阳性克隆,提取质粒DNA,并进行序列测定,首次获得了牛BMP4基因的部分外显子序列。序列分析比较发现,牛与羊、人、小鼠、大鼠等动物的BMP4基因序列同源性分别为99％、93％、93％、91％。该研究结果反映了BMP4基因在进化过程中是高度保守的。     

羊驼酪氨酸酶基因部分cDNA序列的克隆及序列分析

从3～4龄青年公羊驼背部皮肤中提取总RNA作为模板,采用RT-PCR技术扩增出TYR基因的部分Cdna序列,将其克隆进Pgem-T easy vector中,经限制酶酶切鉴定后进行测序,将测序结果与小鼠、人、猩猩等其它物种的TYR核苷酸序列进行比对,发现本研究获得部分序列为羊驼酪氨酸酶基因第三外显子,该序列比较保守.     

马传染性贫血病毒的研究进展

慢病毒跟其他逆转录病毒一样,可以将前病毒基因组持久地整合到感染细胞的染色体上,并且在感染的细胞和子代细胞中表达病毒基因,可以作为将目的外源基因引入细胞的载体.慢病毒不但能够感染分裂状态的细胞,而且还具有感染非分裂细胞的能力,因而,慢病毒载体备受关注.以HIV-1为基础的慢病毒基因转移载体是目前研究最为透彻的慢病毒载体.尽管已经在增加HIV载体的生物安全性和减少产生具备复制能力的病毒方面作了很多改进,但若应用于人类临床试验,仍然存在较大的安全隐患.因此,开发非灵长类慢病毒基因转移载体系统已成为当前研究的热点之一.     

马传贫驴白细胞弱毒疫苗株基质蛋白基因的克隆与表达

从感染驴白细胞的马传贫驴白细胞弱毒疫苗株前病毒DNA中克隆了编码基质蛋白（p15)的基因，并在大肠杆菌中进行了表达，所表达的蛋白是一种可溶性的融合蛋白，其氨基端带有6个组氨酸的标签，因此可以用固定化金属离子亲和层析法在非变性条件下进行纯化，在间接ELISA和免疫印迹试验中，重组的基质蛋白可与马传贫阳性血清样品发生反应，而与健康马血清无任何反应，这表明该重组蛋白具有良好的抗原性和特异性，可用于马传贫弱毒疫苗株在体内外复制及在接种马体人免疫应答的研究中。     

马传染性贫血病毒弱毒株LTR的克隆及序列分析

从马传染性贫血病毒（ＥＩＡＶ）弱毒株感染的驴胎皮肤（ＦＤＤ）细胞中提取前病毒ＤＮＡ,以其为模板,通过ＰＣＲ扩增出ＥＩＡＶ弱毒株的ＬＴＲ,并将其克隆到载体质粒ｐＵＣ１９中。经酶切分析,ＰＣＲ及Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交筛选、鉴定,获得含有ＥＩＡＶ弱毒株ＬＴＲ片段的重组质粒ｐＬＴＲ。对该质粒的序列分析发现,在中国ＥＩＡＶ弱毒株ＬＴＲ的Ｕ３区含有４个与细胞转录因子结合的位点,其中有３个ＰＵ．１位点和１个ＡＰ－１位点,Ｕ３区还存在１个ＴＡＴＡＴＡＡ启动子序列;Ｒ区长为８１ｂｐ,含有１个帽位点ＧＧ和１个Ｐｏｌｙ（Ａ）信号序列ＡＡＴＡＡＡ;在帽位点下游是１个病毒Ｔａｔ蛋白结合位点,即ＴＡＲ位点;Ｕ５区长为３９ｂｐ。中国ＥＩＡＶ弱毒株ＬＴＲ序列与国外发表的其他毒株序列相比,在ＬＴＲ的一些调控部位有变异发生,中国ＥＩＡＶ弱毒株与美国ＥＩＡＶ原型株（Ｗｙｏｍｉｎｇ株）ＬＴＲ区核苷酸序列有１８．７２％的差异。     

马传贫病毒白细胞弱毒疫苗毒株反转录酶基因克隆及序列？…

本从商品化马传贫弱毒疫苗培养物提纯马传贫疫苗病毒粒子并抽提病毒ＲＮＡ后,采用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增并首次克隆了马传贫驴强毒反转录酶基因。经核苷酸序列测定得出反转录酶工一长１６６８ｂｐ,编码５５６个氨基酸。通过与已发表其它马传贫病毒反转录酶基因序列比较,发现在氨基酸和核苷酸水平差异率分别为１４．０％和１６．６％。变异氨基酸随机分布于整个基因上,无明显规律。在反转录病毒高度保守的酶基因上发现这样大的差异     

马传染性贫血病病毒核心蛋白基因的克隆和表达

根据美国马传染性贫血病病毒（EIAV）Wyoming株基因序列,设计扩增EIAVgag和p26基因的引物,用PCR法能忠实的分别扩增出全长gag和p26基因。经用杆状病毒表达系统对所获gag和p26基因进行克隆和重组,获得了高效稳定表达Gag和p26蛋白的重组杆状病毒（rBVs）。含有gag和p26基因的重组杆状病毒感染昆虫Sf21细胞,经无血清昆虫细胞培养基增殖和纯化,每升培养物能获得2mgCag或12mgp26蛋白。     

马传染性贫血病病毒弱毒疫苗株感染性分子克隆的构建

采用ＰＣＲ方法分三段扩增出马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒疫苗株（ＥＬＡＶ　 ＤＬＡ）的前病毒ＤＮＡ,这三个片段覆盖马传染性贫血病毒的全部基因组,ＰＣＲ产物经克隆后顺次连接,获得一个含有ＥＬＡＶ全基因（８．０Ｋｂ）的重组质粒,将其命名为ｐ８．０。将此８．０Ｋｂ ＥＩＡＶ全基因再亚克隆到含有一完整 ＥＩＡＶ ＤＬＡ株长末端重复序列的质粒中,获得一含有 ＥＩＡＶ驴白细胞弱毒前病毒全基因的重组质粒,将其命名为ｐ８．２,经核苷酸序列分析,证明ｐ８．２含有ＥＩＡＶ前病毒的全基因。用ｐ８．２转染驴白细胞,将其作为种毒进行传代,于感染该克隆毒的细胞培养上清中检测出了反转录酶,说明在驴白细胞中由ｐ８．２衍生出了ＥＩＡ病毒。驴白细胞经该克隆毒感染后,第４天出现病变,经透射电镜可观察到典型的马传染性贫血病毒粒子,进一步证明ｐ８．２具有感染性,我们获得了马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒疫苗株的感染性分子克隆,为进一步在分子水平上阐明我国ＥＩＡＶ疫苗株的减毒机理和免疫保护机制奠定了基础。