番鸭细小病毒弱毒株VP2基因的分子克隆与序列测定

将番鸭细小病毒（MDPV）强毒Q株经番鸭胚连续传代，获得致弱株MDPV－26，根据已发表的MDPV的全基因序列，设计了1对引物LHMP7／LHMP8，同时在这2条引物中分别加入2种限制性核酸内切酶Sac Ⅱ和KpnⅠ的酶切位点，应用PCR技术扩增了MDPV0－26株的VP2基因片段，将扩增后的基因片段重组到pMD18-T质粒载体上，并对插入片段进行序列测定，测序结果表明，弱毒株MDPV－26与强毒株MDPV－Q的VP2基因序列相同率达99．7％，与国外分离株的同源性为98．3％，说明强，弱毒株的VP2基因序列变化不大。     

金荞麦查尔酮合成酶基因CHS的克隆及序列分析

采用同源克隆的方法获得金荞麦查尔酮合成酶基因(CHS)的保守片段554bp,进一步采用染色体步移法(genome-walking)和RT-PCR技术克隆到CHS基因的全长DNA序列和cDNA开放阅读框(ORF)序列。序列分析结果表明,金荞麦CHS基因DNA全长1650bp,含一个462bp的内含子;其cDNA编码区全长1188bp,编码395个氨基酸,命名为FdCHS,NCBI登录号为GU169470。该氨基酸序列与同为蓼科的掌叶大黄、虎杖CHS的氨基酸序列同源率分别达到94%和93%,且含有CHS活性位点和底物结合口袋位点等保守位点。     

金荞麦查尔酮合成酶基因CHS的克隆及序列分析

采用同源克隆的方法获得金荞麦查尔酮合成酶基因(CHS)的保守片段554 bp,进一步采用染色体步移法(genome-walking)和RT-PCR技术克隆到CHS基因的全长DNA序列和cDNA开放阅读框(ORF)序列.序列分析结果表明,金荞麦CHS基因DNA全长1 650 bp,含一个462 bp的内含子;其cDNA编码区全长1 188 bp,编码395个氨基酸,命名为FdCHS,NCBI登录号为GU169470.该氨基酸序列与同为蓼科的掌叶大黄、虎杖CHS的氨基酸序列同源率分别达到94%和93%,且含有CHS活性位点和底物结合口袋位点等保守位点.     

北京鸭Ⅰ型干扰素基因分子克隆与序列分析

为了进行北京鸭重组干扰素（IFN）类生物制剂的研究,根据现有鸭Ⅰ型IFN基因设计了引物对,用PCR克隆了我国标准品种北京鸭INF基因,定名为BDIFN－α开放框架（ORF）由576个核苷酸构成,编码191个氨基酸。BDIFN－α与鸭Ⅰ型IFN基因核苷酸同同源性为99．8％,在390位存在点变异,但在氨基酸水平完全一致。BDIFN－α氨基酸与鸡Ⅰ型IFN同源性在50．5％－51％,与狗、猪等哺乳类Ⅰ型和Ⅱ型IFN比较同源性低于39％,结果揭示了BDIFN－α为鸭类干扰素基因进化的一分枝。     

猪白细胞介素-10的分子克隆与序列测定

从LPS活化的猪外周血单个核细胞（PBMC）提取总RNA，用RT-PCR方法扩增出猪白细胞介素-10（IL-10）的编码基因，将其连接到pUC18质粒上，然后进行BamHI和HindⅢ双酶切鉴定筛选阳性克隆，序列分析结果表明该基因开放阅读框由528个核苷酸组成，推测产生的编码产物由175个氨基酸组成。猪IL-10基因与人、大鼠和小鼠基因序列的同源性分别为84%、79%和795，与国外报道的猪IL-10基因序列完全一致，试验成功克隆到了猪IL-10基因。     

鸡IL-18基因的克隆与序列测定

根据Genbank发表的鸡IL-18基因序列,设计一对引物,提取鸡脾细胞总RNA,经RT-PCR扩增和扩增产物的克隆、测序,获得了中国江西土鸡IL-18基因片段,其大小为597bp,与Schneider报道的鸡IL-18基因序列完全一致,为进一步研究鸡IL-18的基因表达、生物学活性和应用奠定了基础。     

植物乳杆菌α-半乳糖苷酶基因（melA）的克隆与序列分析

试验以L.plantarum1.557的基因组DNA为模板,通过PCR技术扩增α-半乳糖苷酶基因（melA）基因,PCR产物经纯化回收后克隆至pMD18-T载体中,转化E.coli DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆,提取质粒进行SacⅠ和Sph Ⅰ酶切及PCR扩增鉴定,并对melA基因片段进行序列测定。结果表明,测得的melA基因序列全长2240 bp,含有酶切位点、启动子、SD序列及编码738个氨基酸的开放阅读框,理论分子质量为84 ku;4种核苷酸中GC含量为47.45%、AT含量为52.55%;序列中有3个碱基发生了变化,均为无义突变,未导致其推导的氨基酸的改变;序列测定结果与GenBank中登录的序列进行比较,核苷酸和氨基酸序列的同源性除与AY873840相比分别为96.6%和92.2%外,其余均大于99%。试验成功克隆了melA基因,为进一步构建重组表达载体奠定了基础。     

大肠杆菌铜锌超氧化物歧化酶基因的克隆与序列测定

试验以E.coliMG1655的基因组DNA为模板,通过PCR技术扩增sodC基因,PCR产物经纯化回收后克隆至pMD18-T载体中,转化E.coliDH5α感受态细胞,筛选阳性克隆,提取质粒进行SacI和KpnI酶切及PCR扩增鉴定,并对sodC基因片段进行序列测定。试验成功克隆了sodC基因,获得的基因与报道的sodC基因序列同源性达到99.6%,为进一步构建重组表达载体奠定了基础。     

SD大鼠EGF基因cDNA序列的分子克隆

参考大鼠EGF基因序列,用PCR方法对SD大鼠EGF基因cDNA序列进行了克隆,获得了SD大鼠EGF基因的3 522bp的cDNA序列（GenBank登录号：JX149564）,其中CDS长度为3 186bp,编码了1 061个氨基酸。SD大鼠与国外报道的大鼠、小鼠、原鸡、猕猴、人等5个物种的EGF基因cDNA序列的同源性分别为97.6%、83.4%、59.7%、76.4%、73.5%,其编码蛋白的氨基酸序列同源性分别为99.2%、80.1%、52.6%、69.7%、69.4%。这一结果表明了EGF基因在进化过程中具有一定的保守性,但不同物种之间也具有特异性。通过比较SD大鼠EGF基因与GenBank数据库中发布的EGF基因的cDNA序列,本试验发现了22个SNP位点,其中9个没有改变氨基酸残基的性质,这一研究结果为EGF基因的SNPs数据库提供了新的信息。     

SD大鼠EGFR基因cDNA序列的分子克隆

参考大鼠EGFR基因序列,用RT-PCR方法对SD大鼠EGFR基因cDNA序列进行克隆,获得了SD大鼠EGFR基因的全长4127bp的cDNA序列（GenBank登录号HM801042）,其中CDS长度为3627bp,编码1209个氨基酸。SD大鼠与国外报道的大鼠、小鼠、牛、猴、人等5个物种的EGFR基因cDNA序列的同源性分别为99．5％、92．9％、78．4％、83．4％、80．2％,其编码蛋白的氨基酸序列同源性分别为99．6％、95．9％、86．6％、89．0％、90．5％。这一结果表明了EGFR基N在进化过程中具有较高的保守性。通过比较SD大鼠EGFR基因与GenBank数据库中发布的EGFR基因的cDNA序列,本试验发现了10个SNP位点,其中5个没有改变氨基酸残基的性质,这一研究结果为EGFR基因的SNPs数据库提供了新的信息。     

降钙素基因在乳酸杆菌中的克隆

根据鲑鱼降钙素基因的序列,合成了鲑降钙素基因。首先将该基因连接到以ThyA基因为选择压力的非抗性表达载体pW425t中,转化ThyA基因缺陷的大肠杆菌X51。用SacI和KpnI双酶切法和PCR法筛选出阳性重组质粒,然后采用电穿孔法将阳性重组质粒pWCT转化到ThyA基因缺陷的乳酸杆菌中。用PCR法筛选阳性重组质粒,并进行序列测定。结果表明,目的基因所编码的氨基酸序列与天然鲑降钙素的氨基酸序列完全一致。我们得到了含降钙素基因的重组乳酸杆菌。     

鸡传染性支气管炎病毒沈阳分离株生物学特性及其免疫原S1基因的克隆与序列分析

本研究对分离自沈阳地区的一株传染性支气管炎病毒（ＳＹ毒株）进行了生物学特性的研究,同时成功地对其免疫原Ｓ１基因进行了ＲＴ－ＰＣＲ扩增、克隆与序列分析。 通过电镜观察、动物回归试验、血凝特性研究等试验验证分离自沈阳地区的ＳＹ毒株确实为一株传染性支气管炎病毒。气管环组织培养交叉中和试验结果表明,分离株ＳＹ株不同于参考毒株澳大利亚Ｔ、Ｈ５２、Ｍ４１,且不同于国内其它流行株ＨＤ、ＨＢ、ＸＢ、ＤＢ等,是一个新的变异株。 利用ＩＢＶ Ｓ１基因特异性寡聚核苷酸引物,经ＲＴ－ＰＣＲ扩增ＳＹ毒株的Ｓ１基因,得到预期的约１．７Ｋｂ片段;并将扩增所得ｃＤＮＡ插入克隆质粒ｐＵＣ１９的ＥｃｏＲⅠ／ＢａｍＨⅠ位点,在大肠杆菌ＤＨ５ａ中实现目的基因的克隆。经限制性核酸内切酶分析及ＰＣＲ鉴定,证实为阳性重组质粒,利用末端双脱氧链终止法对其测序,得到Ｓ１基因全长１６４０ｂｐ,包括整个开放阅读框。通过序列分析软件ＤＮＡＳＩＳ、ＰＲＯＳＩＳ、ＭＥＧＡ等软件对Ｓ１基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行分析,结果表明：分离株ＳＹ与７株参考株和国内流行株ＨＤ株相比,无论是核苷酸序列同源百分率还是氨基酸序列同源百分离都较低,均未达到８０％,这就提示我们ＳＹ毒     

新城疫病毒F48E9株F基因主要功能区的核苷酸序列分析

本试验首先以ＮＤＶＦ４８Ｅ９株的基因组ＲＮＡ为模板,逆转录合成Ｆ基因ｃＤＮＡ第一链,再通过ＰＣＲ技术扩增Ｆ基因的ｃＤＮＡ,然后将其克隆到质粒ｐＵＣ１９中,经分子量比较、酶切分析、ＰＣＲ等方法证明,我们已经获得了ＮＤＶＦ４８Ｅ９株Ｆ基因的阳性克隆。经初步序列分析,ＦＡ段核苷酸序列与参考株（Ｄ２６／７６）序列同源性为８９％,ＦＢ段同源性为９１％。二者的氨基酸序列表明,Ｆ４８Ｅ９株Ｆ蛋白裂解位点与其它强毒株裂解位点氨基酸组成相同,即１１２ＲＲＱＲＲ１１６Ｆ１１７。这两段序列中包含的三个Ｃｙｓ残基和三个潜在的糖基化位点都相当保守。     

鹅细小病毒主要结构蛋白VP3基因的克隆与序列分析

将GPV H2分离株接种于13日龄非免疫鸭胚，收集接毒后3－7日死亡鸭胚的尿囊液。纯化病毒，通过PCR技术，从病毒基因组DNA中扩增出病毒衣壳蛋白VP3完整基因片段，经酶切鉴定后直接与pMD 18-T质粒载体连接，转化感受态大肠杆菌TG1。提取重组质粒经PCR鉴定和酶切鉴定后，对插入片段进行序列测定及分析。结果表明；鹅细小病毒H1分离株VP3基因全长1605bp,编码534个氨基酸，与国外已发表的鹅细小病毒B株核苷酸序列同源性为98．5％，氨基酸序列同源性为98．3％，表明这二个毒株亲缘关系相近。     

鹅副粘病毒F蛋白基因的克隆和序列分析

鹅副粘病毒分离株ＹＧ９７经１０日龄鸡胚增殖后纯化,提取病毒的基因组ＲＮＡ,采用ＲＴ－ＰＣＲ一次性扩增出与预期设计的１．７ｋｂ大小相符的特异性条带。将扩增产物提纯后克隆入ｐＣＥＭ＾Ｒ载体,经转化、筛选及酶切鉴定后,初步获得了含鹅副粘病毒Ｆ基因的阳性克隆。将所获得的阳性重组质粒进一步进行了序列鉴定。序列分析表明扩增的Ｆ基因片段的长度为１６９５ｂｐ,共编码５３３个氨基酸,Ｆ蛋白裂解位点的氨基酸顺序为＾１１２Ｒ－Ｒ－Ｑ－Ｋ－Ｐ－Ｆ＾１１７,与ＮＤＶ强毒株特征相符,同时也与鹅副粘病毒分离株致病性实验结果相符,同源性分析表明,与国内标准强毒株Ｆ４８Ｅ９的核苷酸同源性为８６％,与国内外其它毒株的核苷酸同源性在８２％～８９％之间,表明该毒株相对于经典的ＮＤＶ在Ｆ片段上发生了较大的变异。     

鸡传染性支气管炎病毒国内分离株核蛋白基因的克隆与序列分析

本研究参考已发表的鸡传染性支气管炎病毒核蛋白基因序列，设计了一对核蛋白基因的特异性引物NP5、6，经RT-PCR扩增得到了IBV国内分离株DB株、XJ株、DC株、HD株的1199bp的核蛋白基因片段，并进行了克隆和序列测定。将4个国内分离株核蛋白基因的序列与国外发表的参考毒株的核蛋白基因序列进行了比较和分析，结果显示这4个毒株与澳大利亚群的参考毒株亲缘关系最为密切，核苷酸序列同源性86%-91%。其中DC株发生了较大程度的变异。国内分离株核蛋白基因核苷酸的变异引起了蛋白质二级结构的部分改变。     

猪瘟病毒云南毒株E2基因片段序列测定及分析

用RT－nPCR方法，选择猪瘟病毒2000年云南部分地方流行毒株E2基因主要保护性抗原决定簇编码区片段进行扩增和cDNA序列分析，并与中国标准强毒石门株进行比较。结果显示，云南地方毒株之间核苷酸及氨基酸序列同源性均大于90％；但与中国标准强毒石门株差异较大，其核苷酸及氨基酸同源性均小于80％。     

家蚕蛋白激酶C受体基因( Bmrack )的克隆及序列分析

蛋白激酶C受体蛋白(RACK)除作为细胞内蛋白激酶C的受体之外,还作为细胞内重要的支架蛋白调节细胞功能。应用生物信息学方法对家蚕RACK蛋白的编码基因Bmrack进行电子克隆,获得了1224 bp的重组序列,基因编码区长960 bp,编码319个氨基酸,蛋白分子质量为36.04 kD,等电点为8.07。从家蚕幼虫脂肪体基因组DNA中PCR克隆了Bmrack基因,序列总长为2 122 bp,含有4个内含子和5个外显子,通过家蚕WGS比对,结果与其中5条序列的一致性为99%,且修复了其中8个缺口。聚类分析表明RACK蛋白的氨基酸序列在鳞翅目昆虫中非常保守。     

禽脑脊髓炎病毒河南株VPO基因的克隆与序列分析

为进一步认识AEV的基因结构及功能,为基因工程苗的研制,以及分子流行病学研究提供理论基础,本研究根据已发表的AEV序列设计一对引物,利用反转录———聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,在体外从AEVHN株感染的SPF鸡胚病变组织中扩增出VPO基因,经纯化后将VPO基因克隆到质粒pGEM-T-Easy上,构建成含有VPO基因的重组质粒pGEM-T-VPO,然后通过转化感受态大肠杆菌,经蓝白斑筛选,挑出阳性克隆,提取质粒做PCR和酶切鉴定。进一步序列分析表明,该基因长726bp,编码242个氨基酸,与AEVBZ株和HB株的核苷酸和氨基酸同源性分别为:99.2%、98.3%和94.8%、95.4%,同源性较高,说明VPO基因较为保守。     

传染性支气管炎病毒山东分离株S1基因的克隆及序列比较分析

参照Genbank中传染性支气管炎病毒（IBC）M41纤突蛋白S1的基因序列，设计一对引物，对山东地区IBV分离株RNA进行反转录－聚合酶链反应（RT－PCR），成功扩增出约1634bp S1基因片段，将扩增出的S1基因分别克隆到T Easy质粒载体中，获得重组质粒，提取质粒DNA，利用Eco.RI酶切证实了重组质粒的特异性，并进行序列测序，克隆出的序列已被Gene Bank收录，序列号为：AY043313。将得到的序旬与标准株M41进行核酸序列和氨基酸同源性比较分析，与M41的核式酸同源率995。利用Omigo2.0软件对克隆出的山东IBV进行了理论酶切位点分析，在BstYI、AluI和BgⅢ位点与M41不同，结合血清学和分子生物学实验结果推测：山东A分离株可能是M41的变异株。