烟草谷氧还蛋白基因NbGRX1的克隆与表达特性分析

采用同源克隆及cDNA末端快速扩增法(RACE),从烟草中克隆到1个谷氧还蛋白基因(Grx),命名为NbGRX1.该基因全长1 021 bp,编码298个氨基酸,具有典型的Grx基因结构域.Real-time RT-PCR分析表明,该基因能在烟草的根、茎、叶中表达,并且受低温、干旱和高盐诱导.     

甜橙硫氧还蛋白基因CsTRXh1克隆与表达分析

【目的】通过甜橙硫氧还蛋白基因CsTRXh1克隆与表达分析,以期为解析甜橙硫氧还蛋白基因的功能及胁迫应答机制提供参考依据。【方法】基于甜橙基因组数据使用同源克隆法克隆甜橙硫氧还蛋白基因,利用生物信息学分析CsTRXh1蛋白与其他物种同源蛋白的相似性、系统进化和理化性质,使用qRT-PCR方法分析CsTRXh1基因在健康甜橙树和感染黄龙病甜橙树叶片中的表达模式,通过瞬时转化烟草叶片分析CsTRXh1蛋白在植物细胞中的亚细胞定位。【结果】获得1个甜橙硫氧还蛋白基因CsTRXh1,GenBank登录号为ON125405。蛋白质序列比对分析表明,CsTRXh1与其他植物来源的硫氧还蛋白具有较高的序列相似度,包含保守结构域Thioredoxin。聚类分析表明,CsTRXh1为h型硫氧还蛋白。表达分析结果表明,CsTRXh1基因在感染黄龙病甜橙叶片中上调表达。亚细胞定位分析表明,CsTRXh1定位于细胞质和细胞膜。【结论】CsTRXh1基因受黄龙病菌侵染诱导表达,推测CsTRXh1在黄龙病菌侵染柑橘过程中参与生理生化调控功能。     

蜡梅结瘤素基因CpNOD的克隆与表达分析

根据已构建的蜡梅cDNA文库中得到的片段,通过cDNA末端克隆得到了一个早期结瘤素基因,命名为Cp-NOD(GenBank登录号:JQ622290),该基因cDNA序列全长611个碱基,包含一个71bp 5-UTR区,一个333bp的开放阅读框ORF和一个207bp的3-UTR区,该基因由111个氨基酸组成,其中丙氨酸组分为多,占18.2%,序列比对分析表明,CpNOD具有典型的蛋白质家族ENOD93特征,属于ENOD93家族早期结瘤素蛋白.实时荧光定量PCR表达检测显示,CpNOD在蜡梅根、茎、花器中都有表达,其中以花中瓣表达最高;在花的不同阶段表达结果是从萌动期、花蕾期、盛开期到衰败期,表达量呈正相关,以衰败期表达量最高.转录表达分析结果推测,CpNOD在蜡梅的开花生理和氮元素响应方面起着积极作用.     

蜡梅金属硫蛋白基因的克隆与原核表达

金属硫蛋白(metallothionein,MT)是一类富含Cys,能够结合重金属的低分子量蛋白质,广泛分布于生物界。在构建好的蜡梅花cDNA文库并进行EST分析的基础上,通过随机克隆测序得到了1个蜡梅金属硫蛋白的cDNA,命名为CpMetallothionein(CpMT)。CpMTcDNA全长为1083bp,基因内部含有一长度为240bp的开放阅读框,可编码79个氨基酸残基。将CpMT插入原核表达载体pET-32a,并转化Origami2感受态细胞。诱导表达产物经SDS-PAGE结果显示,目的蛋白约为30kD。表达的融合蛋白以包涵体和可溶性蛋白2种形式存在,用His-Bind蛋白纯化回收试剂盒对其进行纯化回收,得到了高纯度蛋白,为今后研究奠定基础。     

火龙果类锌指蛋白基因片段的克隆及表达分析

锌指蛋白在原核生物与真核生物基因转录的调控中发挥着重要作用.根据火龙果抗逆cDNA 芯片中的一个 EST设计一对引物,采用RT-PCR克隆火龙果类锌指蛋白基因片段,生物信息学分析表明,该片段长334bp,编码 1中含有109个氨基酸残基的肽链,命名为HuZF.该基因序列与其它植物锌指蛋白基因核苷酸序列的同源性均在 70%以上,推测的氨基酸序列与其它植物锌指蛋白的氨基酸序列的同源性达60%以上.RT-PCR分析表明,高盐和 干旱胁迫下,火龙果茎中HuZF 的表达增强,低温胁迫时,HuZF 的表达先减弱后增强,初步推测该基因的表达与 火龙果低温、高盐、干旱等逆境胁迫响应相关.     

蜡梅α半乳糖苷酶基因的克隆和表达分析

从蜡梅中克隆α半乳糖苷酶基因,通过对其酶学性质及基因表达分析,为研究蜡梅的低温适应的分子机理提供参考。通过 PCR 扩增获得α半乳糖苷酶基金（CpGA L ）,构建了该基因的原核表达载体 pET28a‐CpGA L 并转化到大肠杆菌 BL21（DE3）中,诱导表达并分离纯化得到融合蛋白。利用 SYBR Green Ⅰ实时荧光定量 PCR 检测CpGA L 基因在腊梅不同发育时期的表达差异。     

葛仙米藻蓝素铁氧还蛋白还原酶基因Ns-PcyA的克隆、表达及其分子结构基础

为研究葛仙米藻蓝胆素的细胞内合成作用,采用聚合酶链式反应(PCR)、构建融合His标签重组载体和SDS-PAGE电泳等试验方法,克隆与表达葛仙米藻蓝素铁氧还蛋白还原酶基因Ns-PcyA,并对其蛋白高级结构进行模拟分析。结果显示,葛仙米藻蓝素铁氧还蛋白还原酶基因Ns-PcyA密码区全长744 bp,预测编码一含247个氨基酸的蛋白质肽链。Ns-PcyA与同属其他藻种中的同源蛋白氨基酸序列总相似性可达 95.66%,并且富含半胱氨酸(7个Cysteine残基)。以点型念珠藻(Nostoc punctiforme)为参照,葛仙米Ns-PcyA蛋白多肽链除C末端多两个氨基酸外,还出现8个位点氨基酸的显著替换;分子进化显示, Ns-PcyA很可能源于点型念珠藻的同源基因,而与发状念珠藻和普通念珠藻中PcyA基因形成明显分支。这表明PcyA基因的生物学功能在不同念珠藻中可能产生变异。构建Ns-PcyA基因的重组表达载体,并在大肠杆菌中成功表达分子量近29.0 ku的目的蛋白。高级结构模拟显示,Ns-PcyA单分子中主要包含α螺旋和β折叠片两类二级结构,α螺旋和β折叠片进一步形成类似三面夹心式高级结构。其外围两侧共分布5个较典型的α螺旋,而8个反向平行β折叠片夹于其中,形成一疏水内核。本研究结果为深入了解和开发葛仙米藻蓝胆素的细胞内合成作用奠定了试验基础。     

人朊蛋白基因的克隆与原核表达

以人血液中提取的总DNA为模板,克隆朊蛋白(prion protein,PrP)基因Prnp户的开放阅读框(ORF),与pMD -18T载体连接后转入E．coli JM109,用Blast软件比较重组质粒序列,结果表明获得的人Prnp的ORF与Genbank登录的相应核苷酸序列最高同源性为99．6％,推导的氨基酸序列同源性为99．8％,将编码人成熟PrP的基因定向克隆到 pET-30a(+)表达载体,将重组质粒pET-homPrP转化E．coli BL21(DE3),在37℃下用1．0 mmol／L IPTG诱导,重组融合蛋白获得高效表达,SDS-PAGE显示表达产物以包涵体形式存在,占菌体总蛋白的20％～25％．用Ni-NTA 树脂亲和层析纯化了表达产物．Western-blotting分析表明,融合蛋白被抗PrP的单克隆抗体特异识别．因此,在大肠杆菌中表达的人成熟PrP融合蛋白可以作为制备PrP抗体的免疫原．     

甘蓝脂质转运蛋白基因BoLTP的克隆与表达分析

[目的]克隆甘蓝脂质转运蛋白基因(BoLTP)的cDNA及DNA片段,为进一步研究其生物学功能奠定基础.[方法]根据NCBI数据库中脂质转运蛋白基因的信息,克隆甘蓝不同组织BoL TP基因,对其核酸序列及预测蛋白进行生物信息学分析;检测甘蓝多种组织中BoLTP的表达情况.[结果]克隆获得甘蓝BoL TP的cDNA序列为720 bp,无内含子,编码102个氨基酸.生物信息学分析发现,甘蓝BoLTP具有脂质转运蛋白家族共有特征,具有显著的疏水区,并存在信号肽结构域、AAI结构域.RT-PCR检测结果表明,BoL TP主要在甘蓝雄蕊中表达,在雌蕊、萼片、花瓣、花茎及叶片中均无表达.[结论]甘蓝BoLTP基因可能与甘蓝雄蕊中花粉的发育相关.     

水稻B-box锌指蛋白基因OsBBX26的 克隆及表达分析

[目的]克隆水稻B-box锌指蛋白基因(OsBBX26),并分析其在非生物胁迫下的表达模式,为探究水稻B-box蛋白的非生物胁迫响应机制提供理论依据.[方法]以水稻模式品种日本晴为材料,采用RT-PCR克隆OsBBX26基因,对其进行生物信息学分析,并通过构建pBA-OsBBX26-YFP植物表达载体进行亚细胞定位.同时,采用实时荧光定量PCR检测分析OsBBX26基因的组织特异性及非生物胁迫(干旱、ABA、低温和高盐)下的表达模式.[结果]克隆获得的OsBBX26基因(LOC_Os08g42440)cDNA全长序列为1467 bp,编码488个氨基酸,其编码蛋白分子量为51.86 kD,理论等电点(pI)为6.63,包含1个B-box锌指结构域和1个CCT结构域,其中B-box结构域位于第13~60位氨基酸,CCT结构域位于第435~478位氨基酸,该蛋白定位于细胞核中.OsBBX26基因位于8号染色体上,启动子区域除了含有TATA-Box和CAAT-Box等基本转录元件外,还含有与逆境相关的顺式作用元件,包括低温响应元件LTR、脱落酸响应元件ABRE、水杨酸响应元件TCA-element、厌氧响应元件ARE、茉莉酸甲酯响应元件CGTCA-motif和TGACG-motif,以及MYB转录因子结合位点.OsBBX26蛋白与粳稻B-box蛋白亲缘关系最近,其次与籼稻B-box蛋白亲缘关系较近,与其他植物B-box蛋白也存在较高的相似性,其中与小米、大麦、高粱、玉米和短柄草B-box蛋白的氨基酸序列相似性分别达72%、72%、71%、69%和68%.OsBBX26基因在幼叶中的表达量最高,其次是在成熟叶片中,在幼根、成熟根、茎和幼穗中的表达量均极低,表明该基因表达具有明显的组织表达特异性.干旱、高盐、ABA和低温胁迫处理下OsBBX26基因均上调表达,干旱、高盐和ABA胁迫处理12 h达峰值,但低温胁迫处理在24 h后才达峰值.[结论]OsBBX26基因受干旱、高盐、ABA和低温胁迫诱导均上调表达,推测其参与水稻植株响应多种非生物胁迫,在逆境响应中发挥重要调控作用.     

蜡梅水通道蛋白基因CpAQP1转录水平变化及其启动子克隆

利用荧光定量PCR技术对蜡梅花发育的不同组织、不同花期和不同胁迫下的水通道蛋白基因CpAQP1的表 达量进行分析.结果表明:CpAQP1在盛开期中瓣的表达量明显高于其他组织器官,在高温、高盐、ABA胁迫下表 达量变化明显,说明该基因具有组织表达差异性及能够对环境胁迫做出响应.同时利用hi-TAILPCR方法克隆获 得蜡梅水通道蛋白基因CpAQP1上游启动子1082bp,命名为CpAQP1pro(GenBank登录号为:JQ952563).该序列 具有典型的基本元件TATA-box、CAAT-box及与胁迫相关的元件和光应答元件.将克隆的启动子CpAQP1pro 替 换pBI121中的CaMV35s启动子,构建植物表达载体pBI121-CpAQP1pro,通过农杆菌转化烟草,稳定表达结果说 明该启动子具有驱动GUS报告基因表达的活性.     

枯草芽孢杆菌硫氧还蛋白还原酶的原核表达及活性分析

硫氧还蛋白还原酶(TrxR)是一种NADPH依赖的、含硒的黄素蛋白,在细胞增殖和分化、维持细胞内外氧化还原平衡中起重要作用。通过基因特异性引物从枯草芽孢杆菌BS04菌株中扩增TrxR编码基因,亚克隆至pET-28a(+)原核表达载体并转化大肠埃希菌BL21(DE3),经过IPTG诱导表达后采用Ni离子亲和层析进行重组蛋白纯化及活性分析。结果表明,枯草芽孢杆菌BS04菌株的TrxR基因全长1 011 bp,编码336个氨基酸,与已知枯草芽孢杆菌TrxR氨基酸同源性达99%。SDS-PAGE电泳和Western-blotting分析发现,重组蛋白分子量约37 ku,与预期相符。DTNB还原法测定TrxR活性及酶动力学常数结果表明,其对DTNB具有较高的还原活性,其K_m和K_cat值分别为3.06 mmol·L^-1和324.71 min^-1。该研究结果为进一步了解TrxR的功能提供了参考依据。     

蜡梅α-半乳糖苷酶基因的克隆和表达分析

从蜡梅中克隆α-半乳糖苷酶基因,通过对其酶学性质及基因表达分析,为研究蜡梅的低温适应的分子机理提供参考.通过PCR扩增获得α-半乳糖苷酶基金(CpGAL),构建了该基因的原核表达载体pET28a-CpGAL并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,诱导表达并分离纯化得到融合蛋白.利用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测CpGAL基因在腊梅不同发育时期的表达差异.     

柽柳硫氧还蛋白过氧化物酶(ThPrx1)基因转入酵母的抗逆能力分析

从柽柳(Tamarix hispida)中克隆到了一个硫氧还蛋白过氧化物酶(Peroxiredoxin,Prx)家族基因(ThPrx1).为了研究ThPrxl的抗逆功能,将ThPrx1基因构建到酵母表达载体pYES2中,转化到酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中,获得重组酵母,并用转空pYES...     

大豆铁结合蛋白基因cDNA的克隆、序列分析和表达载体的构建

根据已报道的植物铁结合蛋白基因的保守序列设计引物，用RT－PCR方法，成功地从大豆总RNA中扩增出一大小为0.771kb的cDNA片断。将该片段克隆到pUCm-T载体上，测序和序列的同源怀分析表明该片断与Proudhon等（1996）报道的大豆铁结合蛋白基因的氨基酸序列同源性达95％。利用pUCm-T和pBI121载体上共同的XbaI和SacI双酶切位点，构建了克隆片段的植物表达载体pSFKna。该载体含CaMV35S启动子、NOS终止子和NPT－Ⅱ基因，在遗传转化中可用基因枪导入受体，并通过卡那霉素抗性筛选转化子。     

蜡梅异戊烯基焦磷酸异构酶基因CpIPI的克隆及表达分析

从蜡梅花cDNA文库中克隆得到1个蜡梅异戊烯基焦磷酸异构酶基因,命名为CpIPI.CpIPI基因的cDNA全长为1 297bp,其中最大ORF框长为879bp,编码292个氨基酸残基.CpIPI蛋白质的相对分子量为33.4kDa,理论等电点为6.86.生物信息学分析表明,蜡梅CpIPI蛋白属于典型的IPI蛋白,CpIPI基因是调控蜡梅萜类物质合成的关键基因.荧光定量分析结果表明,CpIPI基因在蜡梅的根中不表达,但是在茎、叶和花中都有表达,且在外瓣中的表达量最高.CpIPI基因在蜡梅不同花期的表达量具有不规律差异性.由此推测,蜡梅CpIPI基因可能参与与花器官形成发育相关的萜类物质的合成.     

斑节对虾钙网蛋白基因cDNA克隆和表达分析

采用cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNAends,RACE)获得了1 672 bp的斑节对虾钙网蛋白(Penaeusmonodon calreticulin,PmCRT)基因cDNA序列。该序列包含37 bp的5’非编码区(UTR)和414 bp的3’非编码区(UTR)以及1 221 bp的开放阅读框(ORF),可编码406个氨基酸。预测的分子量约为46.8ku,理论等电点为4.13。序列比对分析表明PmCRT与中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)的相似性和同源性最高,分别为100%和98.8%。实时荧光定量PCR对组织表达检测的结果可知,PmCRT的mRNA在卵巢、肝胰腺、肌肉、脑、心脏、胃、眼柄和肠均有表达,卵巢的表达量最高,肌肉次之;对卵巢发育6期变化检测可知,PmCRT的mRNA在Ⅲ期卵巢表达量最高,Ⅰ期的表达量最低。以期为进一步研究该基因在斑节对虾卵巢发育中的作用提供基础数据。研究亮点:目前对斑节对虾卵巢发育的分子调控机理还知之甚少,有大量卵巢发育相关基因还不为人所知。本文研究了钙网蛋白在斑节对虾卵巢发育各期的表达谱,为阐明斑节对虾卵巢发育分子调控机理提供基础数据。     

二色补血草硫氧还蛋白过氧化物酶基因LbTPx的克隆及其表达

从二色补血草(Limonium bicolor)cDNA文库中分离出一个新的硫氧还蛋白过氧化物酶基因(LbTPx)全长cDNA序列.基因全长1016 bp,其中:5'非翻译区146 bp,3'非翻译区69 bp,开放读码框(ORF)801 bp,共编 码266个氨基酸;编码蛋白的分子质量为47.99× 10-24...     

蜡梅花香基因SAMT的cDNA克隆及在大肠杆菌中的表达

[目的]研究蜡梅花香基因SAMT cDNA的克隆及表达。[方法]以蜡梅花瓣总RNA为模板进行RT-PCR,扩增得到与预期大小相同的PCR产物带,回收RT-PCR产物,将其与PMD18-T载体进行T-A克隆连接并导入大肠杆菌DH5α,经菌落PCR和双酶切鉴定,筛选带有目的基因的重组质粒并进行测序。[结果]测序证实成功克隆得到蜡梅花香基因SAMT cDNA的ORF片段,其长度为1 196 bp,编码380个氨基酸残基,与已报导的蜡梅SAMT(ABU88887)的同源性为99.2%。将SAMT基因亚克隆到原核表达载体PGEX4T-1中获得重组菌种命名为PGSAMT,用0.01 mol/L的IPTG进行诱导表达,经SDS-PAGE分析,SAMT的融合表达蛋白分子量约为66 kDa,与预期的26 kDa的GST带和42.3 kDa的蜡梅SAMT基因编码蛋白构成的融合蛋白大小接近。[结论]该研究成功克隆并表达蜡梅花香基因SAMT。     

平邑甜茶金属硫蛋白基因MhMT2的克隆和表达分析

【目的】克隆平邑甜茶金属硫蛋白（metallothionein,MT）基因,探讨该基因对逆境的响应机理,为苹果抗逆分子育种提供依据。【方法】采用电子克隆和RT-PCR技术从平邑甜茶叶片中克隆MhMT2基因,利用生物信息学方法对获得的cDNA序列及推测氨基酸序列进行分析,通过定量PCR技术研究在胁迫条件和激素处理下该基因在叶片中的表达模式。【结果】平邑甜茶MhMT2基因cDNA全长534 bp,具有1个243 bp的完整开放阅读框,编码含80个氨基酸的多肽,其分子量为7.87 kD。同源性比对显示,MhMT2编码的氨基酸序列与其它植物的MT2蛋白有很高的相似性,其中与小金海棠的同源性最高,达到96.4%。MhMT2编码的多肽包含14个Cys残基,其N端富含Cys的结构域具有C-C、C-X-C和C-X-X-C基序,而C端仅有C-X-C基序。聚类分析显示,该基因属于植物MT2基因家族。定量PCR分析表明,MhMT2基因在叶中表达量最高,其次是根,在茎中表达量最低。在ABA、H2O2、机械损伤及NaCl处理下,该基因在叶片中的表达都上调,其中以H2O2最明显。【结论】对MhMT2基因在ABA、H2O2、机械损伤及盐胁迫下的表达模式分析,预示该基因表达水平在植物抗逆反应中起着重要作用。