滇龙胆香叶醇合酶基因的克隆与表达分析

对滇龙胆香叶醇合酶基因Gr GES进行克隆和表达分析,为研究其在香叶醇和龙胆苦苷生物合成中的作用奠定基础。根据滇龙胆转录组Gr GES序列,采用RT-PCR技术从滇龙胆叶片克隆该基因,获得Gr GES序列(Gen Bank登录号为KJ917168)。序列分析结果表明,Gr GES基因长1 767 bp,编码588氨基酸;Gr GES蛋白相对分子质量为67.84 ku,理论p I为5.56。该蛋白定位于叶绿体,包含叶绿体转运肽,为亲水不稳定蛋白,主要由α-螺旋(62.41%)和环(39.57%)构成。该蛋白具有其他GES蛋白的活性位点、萜类合酶N端结构域(IPR001906,81~273)和萜类合酶结构域(IPR005630,263~588)。Gr GES蛋白与长春花Cr GES蛋白亲缘关系最近。原核表达结果表明,Gr GES基因在大肠杆菌中表达的重组蛋白相对分子质量约为78.22 ku,与预期的大小一致。组织特异性表达分析结果表明,Gr GES基因主要在叶中表达。     

甜樱桃黄酮醇合酶基因的克隆及其表达分析

为了解黄酮醇合酶在甜樱桃类黄酮生物合成途径中的作用,根据其他物种已知的FLS cDNA保守序列设计简并引物,采用RT-PCR和RACE的技术,从甜樱桃(Prunus avium.L)嫩叶中扩增获得FLS cDNA全长,命名为PaFLS(GenBank登录号:JQ289290).该基因cDNA全长为1 077 bp,开放阅读框为1 014 bp,编码337个氨基酸,分子质量为38 ku,等电点pI为5.58.生物信息学分析表明PaFLS属于依赖2-酮戊二酸的双加氧酶家族(2OG-FeII_Oxy),该基因所编码的氨基酸序列与苹果、梨和草莓的同源性分别为99％、97％和77％.将该基因重组到表达载体pGEX4T-1中进行原核表达,电泳检测到一条约为65 ku的融合蛋白(含27 ku的GST标签).组织时空表达分析表明,PaFLS在甜樱桃的花中表达量最高,这可能和黄酮醇参与花粉萌发及利于授粉有关.     

葡萄白藜芦醇合酶基因cDNA克隆及原核表达

从贝达葡萄中提取总RNA,采用RT-PCR方法,克隆到了白藜芦醇合酶(resveratrol synthase,RS)基因的全长cDNA。将其与圆叶葡萄(Vitis rotundifolia)、华东葡萄(Vitis pseudoreticulata)、河南毛葡萄(Vitis ficifolia)、河岸葡萄(Vitis vulpine)、酿酒葡萄(Vitis virufera)、羊蹄甲(Bauhinia)、花生(Arachis hvpogaea)、虎杖(Polygonum cuspiaatum)、大黄(Rheum officinale)进行氨基酸同源性比对,结果表明:分离的RS基因与其他葡萄的RS基因编码的氨基酸同源性达到97%以上,与其他属的RS基因编码的氨基酸同源性达到64%以上。生物信息学分析表明,该蛋白分子量为43kD,等电点pI=6.2,包含392个氨基酸残基。将RS的全长cDNA插入到表达载体pET28a中构建重组表达质粒pET28a-RS,转化大肠杆菌BL21,SDS-PAGE电泳检测结果表明,以30℃、0.5mmol.L-1IPTG诱导4h时该基因表达效果最好,诱导产物为1个约43kD的蛋白,为...     

油菜乙酰羟基酸合酶基因BnAHAS1的克隆及其重组蛋白质的原核表达

利用RT-PCR技术从甘蓝型油菜宁油16号(Brassica napus L.)中克隆到乙酰羟基酸合酶基因BnAHAS1的cDNA序列,该序列含有1个1 968 bp的开放阅读框,编码蛋白质655个氨基酸,分子量约为7.1×104,预测等电点为6.16。将该基因克隆到原核表达载体pCold II中,经酶切和测序鉴定后,将正确的重组质粒pCold IIBnAHAS1导入大肠杆菌BL21(DE3)。在15℃下以终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导12 h后,获得预期大小的重组蛋白质His-BnAHAS1,并用Western blot确定此重组蛋白质为目的蛋白质。     

暗紫贝母鲨烯合酶基因的克隆及其组织表达分析

[目的]:克隆名贵药材暗紫贝母(Fritillaria unibracteata)鲨烯合酶(Squalene synthase,SQS)基因的全长ORF序列(FuSQS),并对其进行生物信息学分析和不同组织表达水平分析.[方法]利用PCR方法,克隆得到FuSQS,利用生物信息学方法预测FuSQS蛋白的基本理化性质、保守...     

一个新杉木纤维素合酶ClCesA基因的克隆与植物表达载体构建

为探索杉木木材形成的分子机制,以杉木嫩叶总RNA反转录的c DNA为模板,运用RT-PCR技术克隆出一个新杉木纤维素合酶基因ClCesA.该基因的开放阅读框(ORF)为2 955 bp,共编码984个氨基酸.通过TMHMM Server v.2.0和MEGA5.1软件预测ClCesA蛋白的跨膜结构和功能,发现该蛋白N端含有锌指结构,共有8个跨膜结构,平均跨膜区域18个氨基酸残基,并具有保守的DDDQXXLRW结构域.系统进化树分析结果表明,ClCesA可能与细胞次生壁形成有关.荧光定量PCR分析表明,ClCseA基因在杉木的不同器官(根、茎、叶)中均有表达,但在杉木根中的表达含量最高,茎中次之,叶中最低.随后,为后续该基因功能验证提供基础,将ClCesA克隆到含有GFP标签和潮霉素抗性的p GWB506载体,构建植物过表达载体p GWB506-35S-ClCesA-GFP.     

大豆乙醇酸氧化酶基因的克隆、表达和酶学活性分析

利用RT-PCR技术,从大豆叶片总RNA中扩增了乙醇酸氧化酶(GO)基因的cDNA序列,克隆到pMD19-T simple上,进行测序,然后将乙醇酸氧化酶的cDNA克隆至原核表达载体pRSET-A上,转化E.coli BL21,并对该基因在E.coli中的表达进行了研究。     

辣椒海藻糖-6-磷酸合酶基因CaTPS9的克隆及表达分析

【目的】明确辣椒中海藻糖-6-磷酸合酶(TPS)基因CaTPS9的表达特性和生物学功能,进一步了解TPS对辣椒生长中调控非生物胁迫的作用。【方法】以辣椒品种强丰101为试验材料,克隆CaTPS9基因,并对辣椒CaTPS9的理化性质、蛋白结构、顺式作用元件、系统进化树等进行分析;通过qRT-PCR分析CaTPS9基因在不同组织(商品果果肉、幼果果肉、成熟果果肉、商品果胎座、幼果胎座、成熟果胎座、叶、根、茎、花)和胁迫处理(低温和植物生长调节剂处理)中的表达模式。【结果】CaTPS9基因CDS序列全长2 604 bp,编码867个氨基酸。CaTPS9蛋白包含Glyco＿transf＿20和Trehalose＿PPase两个保守结构域,分子质量为97.60 kDa,不稳定指数为44.27,理论等电点为5.63,亚细胞定位预测CaTPS9蛋白位于细胞质中。生物信息学分析表明,CaTPS9蛋白属于亲水性蛋白,且不存在跨膜结构和信号肽序列,蛋白结构主要由α-螺旋和无规则卷曲组成。系统进化关系分析表明,CaTPS9与烟草(Nicotiana tabacum L.)、番茄(Solanum lycope...     

独行菜法尼基焦磷酸合酶基因的克隆与原核表达

从独行菜(Lepidium apetalum)中克隆强心苷合成途径的法尼基焦磷酸合酶(FPS)基因,并在大肠杆菌中表达,为进一步研究独行菜强心苷的合成途径提供参考。分析前期获得的独行菜幼苗转录组数据,选择其中注释为FPS且具有完整开放阅读框的序列,从独行菜叶片c DNA中通过PCR克隆该序列,并进行序列分析。结果表明,克隆得到独行菜FPS基因的cDNA序列,Gen Bank登录号KY366218,命名为La FPS。序列长度为1 332 bp,含有1 161 bp的开放阅读框,推测编码386个氨基酸。La FPS蛋白可能不含跨膜结构,定位于线粒体中,含有聚异戊二烯合成酶结构域。La FPS蛋白氨基酸序列与拟南芥(Arabidopsis thaliana)FPS1蛋白相似性高达92%,进化树分析结果表明,La FPS与同为十字花科的拟南芥FPS1、遏蓝菜(Noccaea caerulescens)FPS1、高山南芥(Arabis alpina)FPS亲缘关系最近。构建的载体p ET-32a-La FPS可在大肠杆菌中成功诱导表达。表明成功克隆了独行菜FPS基因,并建立了其原核表达体系。     

怀玉山三叶青黄酮醇合酶基因克隆和表达分析

【目的】对怀玉山三叶青黄酮醇合酶基因进行克隆和表达分析,为进一步揭示怀玉山三叶青黄酮醇合酶的生物学功能奠定基础。【方法】怀玉山三叶青黄酮醇合酶基因的核心片段通过其转录组数据库进行筛选,怀玉山三叶青黄酮醇合酶基因利用逆转录PCR进行克隆,序列分析采用生物信息学进行分析,器官表达采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）进行比较。【结果】怀玉山三叶青黄酮醇合酶基因cDNA总长度为987 bp,G+C含量为47.92%。怀玉山三叶青黄酮醇合酶由329个氨基酸组成,分子量37578.03 Da,理论等电点5.39,为亲水性蛋白;其二级结构中α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲的比例分别占27.66%、21.88%和50.46%。怀玉山三叶青黄酮醇合酶主要存在内质网中,在进化上与山甜菜（Nekemias grossedentata）、河岸葡萄（Vitis riparia）和葡萄（Vitis vinifera）的亲缘关系较近,尤其是与山甜菜（N.grossedentata）黄酮醇合酶在进化上具有最高的亲缘关系。qRT-PCR分析结果表明,怀玉山三叶青黄酮醇合酶基因的表达在2个栽培种中存在器官特异性表达,怀玉2号在根中的相对表达量最高,怀玉1号在茎中的相对表达量最高。【结论】怀玉山三叶青黄酮醇合酶具有典型黄酮醇合酶的结构特征,氨基酸序列及核酸序列与同源物种相似度高,在进化上高度保守,且怀玉山三叶青黄酮醇合酶基因的表达存在组织器官差异性。     

大鼠动粒蛋白rMis12基因的克隆和表达

利用抑制性消减杂交所获得的rMis12表达序列标签(EST),采用快速扩增cDNA末端(RACE)技术,从大鼠肝脏中克隆到rMis12基因.通过原核重组表达后制备多克隆抗体,并用基因芯片和Western blot方法分别检测rMis12 RNA和蛋白质水平上的表达变化.成功克隆到rMis12基因,其cDNA全长2 604 bp,编码206个氨基酸,生物信息学分析结果显示该基因存在2个保守的磷酸化位点,与小鼠rMis12基因进化关系最近.基因芯片和Western blot检测结果表明,rMis12在正常大鼠肝脏中表达水平持续较低,在2/3肝切除24 h过程中rMis12出现上调表达.     

蔗糖磷酸合成酶(SPS)基因克隆与表达研究进展

蔗糖是植物中重要的代谢产物,它直接或间接参与多种生理生化反应,研究其含量的变化规律对提高植物生物学产量和增强植物抗逆性具有重要的指导意义。蔗糖磷酸合成酶(SPS)是蔗糖代谢的关键酶之一,它催化蔗糖代谢中的限速反应,SPS基因在分子水平编码调控SPS。研究SPS基因克隆与表达规律是从分子水平揭示蔗糖代谢的基础。本文综述了近年来SPS基因克隆和表达研究进展,并展望了SPS基因的研究前景和应用前景。     

石柱参人参皂苷合成酶基因的克隆及表达量测定

以人参为对照组,采用HPLC法测定5 a生石柱参样品中6种人参皂苷(Rb_1、Rb_2、Rc、Re、Rg_1、Rg_2)的质量分数,采用实时荧光定量PCR技术对不同生长期人参皂苷合成酶基因(SS、 CYP82D47、 CYP716A42)的表达量进行比较,以探究石柱参人参皂苷质量分数较低的原因;并对石柱参 CYP82D47基因进行克隆、测序及生物信息学分析,获得石柱参系统发育树。结果表明:石柱参人参皂苷合成酶基因的表达量在根、茎、叶组织中具有高度相似性,却也具有高度组织差异性,比如SS基因在石柱参根、叶中表达活跃,在茎中表达量有限; CYP82D47基因在石柱参中的表达部位主要是茎、叶组织;而 CYP82D47基因在在根、茎、叶组织中表达较活跃,尤其是根、叶中;此外,人参皂苷合成酶基因 CYP82D47的表达量相对较低是造成石柱参人参皂苷质量分数较低的原因之一;由系统进化树可见,石柱参与竹节参、西洋参、三七及刺五加的亲缘关系较近,结果与物种进化程度相符合。     

水稻核黄素合酶基因的克隆、表达及多克隆抗体的制备

核黄素在生物体内发挥着重要的作用,核黄素合酶(RS)是核黄素合成过程中的一个关键酶。本研究克隆了水稻核黄素合酶基因(OsRS),并将其在Escherichia coli中高效表达。表达产物(包涵体),先用6 mol/L盐酸胍将其溶解,再用8 mol/L尿素透析,将获得的蛋白免疫家兔制备了多克隆抗体。并将抗体与原核表达的OsRS和提取的水稻叶组织总蛋白进行Western blot分析,确定所制备的多克隆抗体具有较好的免疫反应性,为深入解析水稻中核黄素合酶的催化活性和功能奠定了基础。     

甘蓝型油菜湿害相关基因BnLDH-1的克隆和表达分析

采用RACE技术从中双9号中克隆了甘蓝型油菜BnLDH-1基因全长cDNA序列和基因组序列。BnLDH-1基因的DNA序列为1 432 bp,包含1个内含子;cDNA序列全长1 319 bp,含有1个1 053 bp的ORF,其编码蛋白含350个氨基酸。经预测发现,BnLDH-1蛋白存在LDH-1保守结构域。qRT-PCR结果表明,湿害诱导BnLDH-1表达,但在不同耐湿性甘蓝型油菜品种中,BnLDH-1的诱导表达水平不同。相关分析表明,湿害胁迫后48 h的BnLDH-1表达量与12份测试的甘蓝型油菜材料的耐湿指数呈显著负相关,其相关系数为0.73。     

青蒿鲨烯合酶cDNA的克隆与序列分析(英文)

[目的]对青蒿鲨烯合酶进行cDNA克隆,并进行其序列分析。[方法]根据GenBank上已发表的鲨烯合酶cDNA基因序列设计1对特异性引物,提取青蒿细胞总RNA,运用RT-PCR扩增出鲨烯合酶基因。将其与pMD19-T载体连接,并通过DNAman、NCBI Blast、ExPASy ProtParam等工具,对克隆片段序列进行分析。[结果]SS基因全长1257bp,编码418个氨基酸;同源性分析表明,青蒿SS基因序列与人参、积雪草、金铁锁、大豆、辣椒、百脉根、远志、玉米、褐家鼠、小鼠以及人相应序列的同源性分别为77.21%、76.11%、75.66%、74.62%、73.83%、74.46%、73.03%、64.39%、52.22%、50.51%和50.12%;氨基酸同源性分别为79.43%、79.00%、75.84%、79.43%、77.27%、77.03%、66.03%、40.65%、40.19%和40.09%。由SS基因翻译出来的蛋白质分子量为47.8394KDa,理论等电点为8.57,无信号肽。疏水性分析表明,在400~417区域疏水性较强。跨膜区分析表明有3处跨膜区域,分别为170～186位的17个氨基酸、282～305位的24个氨基酸、387～407位的21个氨基酸。通过NCBI的BLAST程序分析指出,该基因编码的氨基酸序列含有Trans_IPPS_HH的保守区域,也具有与Mg2+结合有关的活性中心——富含天门冬氨酸的区域(DXXDD)。2级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主。[结论]青蒿鲨烯合酶cDNA的成功克隆,为进一步研究SS基因结构、基因表达与调控提供了重要依据。     

百合查尔酮合成酶(chs)基因的cDNA克隆与分析

根据报道的查尔酮合成酶基因的保守序列,设计了特异简并引物,以东方百合Sorbonne盛开的花瓣总RNA为模板,逆转录合成cDNA第一链,用特异引物对此双链cDNA进行PCR扩增,将扩增后的基因片段回收克隆后,送至上海博亚生物公司测序,目的序列长873bp,与已发表的百合中CHS基因的同源性达到91%,说明克隆的片段属于...     

葡萄查耳酮合酶基因克隆及其进化分析

利用RT-PCR技术从葡萄中克隆到两个查耳酮合酶(CHS)的c DNA开放阅读框(ORF)序列,分别命名为Vv CHS1和Vv CHS3。其中,Vv CHS1序列长1 182 bp,编码393个氨基酸;Vv CHS3序列长1 170 bp,编码389个氨基酸。对两个CHS基因编码的氨基酸序列的分析表明,二者均具有CHS基因家族的保守结构域。多序列比对和系统发生分析结果表明,两个CHS基因与其他高等植物CHS基因具有较高的相似性,然而Vv CHS1和Vv CHS3在结构和功能上出现歧化。     

梨内根-贝壳杉烯合酶基因克隆及表达分析

中矮1号(Pyrus communis)是中国农业科学院果树研究所选育的梨优良矮化砧木,为研究其矮化机理,应用同源克隆的方法从中矮1号叶片总RNA中克隆赤霉素合成过程中的关键酶——内根-贝壳杉烯合酶(KS)基因的cDNA全长序列,并对该基因在不同梨品种中的表达进行分析.结果表明:基于苹果基因组序列设计的特异引物从中矮1号的总RNA中扩增出了1个编码框全长为2214 bp的cDNA序列,其编码737个氨基酸残基,推断分子量为83.63 kD,等电点为5.37.其氨基酸序列与报道的其他植物KS氨基酸序列的相似性为53.61％～72.63％,其中,与板栗(AEF32083.1)的相似性最高,其氨基酸序列中包含植物KS基因所共有的YDTAWVAWVP和DDXXD保守结构域,因此,将分离到的基因命名为PcKS.早酥、锦香和中矮1号等不同梨品种的PcKS基因的cDNA序列仅有个别碱基差异,但编码的氨基酸序列完全一致,品种间不存在结构差异.RT-PCR表达分析结果表明,PcKS基因在早酥中的表达量低于同时期的锦香和中矮1号,与植株高度相反,初步表明该基因的表达有与梨植株生长势呈负相关的趋势.     

越橘查耳酮合酶基因的克隆及表达分析

为研究越橘花色素苷合成的分子机制,利用RT-PCR和RACE技术从越橘(Vaccinium spp.)果实中克隆了查耳酮合酶基因(CHS)的全长cDNA,命名为VcCHS,GenBank登录号为JN654702.VcCHS全长1438 bp,包含107 bp的5 ′非编码区、71 bp的3′非编码区和1个长度为1 260 bp编码419个氨基酸的开放阅读框.该基因编码的蛋白具有CHS家族普遍存在的功能活性位点:Cys(C)164、His(H)303、Asn(N)336和特征多肽序列(RLMMYQQGCFAGGTVLR).多重比对分析发现越橘VcCHS基因编码的氨基酸序列与葡萄(Vitis vinifera)CHS基因编码的氨基酸序列相似性达90.2％.系统进化分析表明,该序列与杜鹃花目的植物聚为一类.VcCHS基因在果实发育的整个过程均有不同程度的转录表达,花期和果实成熟期表达量较高,绿果期表达量最低.VcCHS相对表达量变化与花色素苷相对含量的变化趋势具有一致性,并均在果皮组织中达到最高.