嗜水气单胞菌对氟喹诺酮类药物的敏感性及耐药相关基因分析

为明确嗜水气单胞菌临床分离株对常用氟喹诺酮类药物的敏感性和耐药菌株中gyrA和parC基因的突变情况。试验采用自动化细菌药敏分析仪测定4种常用氟喹诺酮类药物对23株鱼源嗜水气单胞菌的最低抑菌浓度,并依据耐药数目的不同选取9株嗜水气单胞菌,PCR扩增其gyrA及parC基因的喹诺酮抗性决定区(QRDR),直接测序后进行多序列比对分析。结果显示:嗜水气单胞菌对诺氟沙星、氧氟沙星、恩诺沙星和环丙沙星的耐药率依次为8.7%、30.4%、73.9%和43.5%;序列分析发现gyrA基因编码的第83位氨基酸存在Ser→Ile、Ser→Val的突变,parC基因编码的第87位氨基酸同样存在Ser→Ile的突变。表明临床分离的嗜水气单胞菌对恩诺沙星耐药最为严重,氧氟沙星、环丙沙星次之,对诺氟沙星较为敏感;尽管绝大多数耐药菌株的药物靶位基因QRDR区域有突变发生,但是菌株的耐药性与药物靶位基因QRDR区域有无发生突变并不存在线性关联,提示我们药物靶位的变化并非是氟喹诺酮类耐药菌株唯一的抗性机制。     

耐氟喹诺酮类鸡源性沙门氏菌DNA旋转酶gyrA基因序列分析

取临床分离的对5种氟喹诺酮类药物(环丙沙星、氧氟沙星、恩诺沙星、单诺沙星和沙拉沙星)均耐药的9株鸡源性沙门氏菌耐药株,提取其染色体DNA。设计引物gyrAF和gyrAR扩增其DNA旋转酶gyrA基因的氟喹诺酮类耐药决定区(QRDR),对PCR扩增产物进行测序及序列分析。与质控菌株相比,9株临床分离耐药株中只有菌株38和60的gyrA基因发生单碱基突变,菌株38的gyrA基因第371位碱基发生C→T突变,菌株60的gyrA基因第350位碱基发生A→C突变,两处突变均位于QRDR内,其余菌株的核苷酸未发生任何突变。菌株38的碱基突变导致gyrA基因第121位氨基酸发生R→C取代,即Arg→Cys;菌株60的碱基突变导致gyrA基因第114位氨基酸发生M→L取代,即Met→Leu。上述结果提示,gyrA基因QRDR突变并非沙门氏菌耐药性产生的主要原因。     

水产动物源嗜水气单胞菌药物敏感性及QRDR基因突变分析

为了解临床分离的59株嗜水气单胞菌对喹诺酮类药物的耐药性及其靶基因gyrA和parC编码的喹诺酮类耐药决定区(QRDR)的突变情况。采用纸片琼脂扩散法测定15种抗菌药物对水产动物源嗜水气单胞菌的耐药情况,采用PCR法扩增gyrA和parC,并通过测序分析其靶基因突变情况。结果表明:24株(40.7%)嗜水气单胞菌对喹诺酮类药物耐药,其中对萘啶酸、诺氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星的耐药率依次为40.7%、16.9%、20.3%、8.5%。敏感菌株QRDR靶位点未发生突变,24株喹诺酮类耐药菌株中gyrA基因编码的第83位氨基酸均存在Ser→Ile突变;19株菌parC基因编码的第87位氨基酸也发生突变,其中18株为Ser→Ile突变,1株为Ser→Arg突变,有5株未检测到突变;ParC亚基氨基酸突变的菌株其GyrA亚基均同时发生氨基酸突变。表明临床分离的嗜水气单胞菌对喹诺酮类药物耐药程度不一,其中萘啶酸的耐药最为严重,诺氟沙星、氧氟沙星和环丙沙星敏感性较高。喹诺酮类耐药菌株GyrA亚基QRDR氨基酸突变,可能是引起萘啶酸耐药的主要原因。临床分离嗜水气单胞菌QRDR区域的突变具有随机性,但靶位点GyrA的Ser83→Ile以及ParC的Ser87→Ile是最主要的突变方式,另外喹诺酮类药物耐药性的产生可能还与其他耐药机制存在关联。     

养殖场分离的耐氟喹诺酮类药物的大肠杆菌基因突变研究

【目的】探讨从养殖场动物、环境和饲养员分离的大肠杆菌的gyrA 和parC 基因突变特征。【方法】用琼脂稀释法测定环丙沙星和恩诺沙星对菌株的最小抑菌浓度。PCR扩增gyrA 和parC 基因的喹诺酮耐药决定区，扩增的片段长度分别为525 bp和487 bp，PCR产物直接测序。【结果】在63株突变株中，在GyrA 亚基发生的氨基酸替代有Ser83→Leu（62株）和Asp87→Asn（52株）、Asp87→Tyr（2株）、Asp87→His（2株）；ParC 亚基的氨基酸替代有Ser80→Ile（47株）、Ser80→Arg（2株）和Glu84→Val（3株）、Glu84→Lys（4株）、Glu84→Gly（5株）、Glu84→Ala（1株）。环丙沙星对菌株的MIC小于0.125μg·ml-1时，GyrA和ParC亚基均没有任何变异；环丙沙星的MIC为0.125～0.25 μg·ml-1时，GyrA亚基出现单一氨基酸替代；环丙沙星的MIC为0.5～32μg·ml-1时，出现GyrA 83位和87位双替代或者GyrA83和ParC80位双替代；环丙沙星的MIC为4～128μg·ml-1，发生GyrA 双替代和ParC单替代；环丙沙星的MIC在16～128μg·ml-1，发生GyrA双替代和ParC 双替代。【结论】不同来源的耐氟喹诺酮类药物的大肠杆菌GyrA和ParC具有多种氨基酸替代类型，而且GyrA和ParC突变位点的数量与菌株对氟喹诺酮类耐药水平呈正相关。     

牛源无乳链球菌对喹诺酮耐药的基因特征

采用微量肉汤稀释法测定左氧氟沙星、诺氟沙星和环丙沙星3种喹诺酮类药物对110株奶牛隐性乳腺炎无乳链球菌(分离自中国10省区21个规模化奶牛养殖场)的最小抑菌浓度(MIC),通过PCR检测gyrA、gyrB、parC和parE基因的喹诺酮耐药决定区(QRDR),并分析其突变位点.结果表明：110株牛源无乳链球菌对左氧氟沙星、诺氟沙星和环丙沙星的耐药率分别为85.5%、98.2%、94.5%;左氧氟沙星耐药菌株对其他2种喹诺酮类药物耐药,且均发生了QRDR基因突变,氨基酸突变位点有GyrA的Ser81Leu、Glu85Lys, ParC的Ser79Phe、Asp83Tyr, ParE的Asp437Asn,其中,耐药菌基因最主要的突变类型是GyrA(Ser81Leu)+ParE(Asp437Asn),该突变类型对喹诺酮类药物呈中高度耐药;ParC的Ser79Phe或Asp83Tyr突变类型对喹诺酮类药物的敏感性下降,ParC的Ser79Phe突变与GyrA的Ser81Leu或Glu85Lys突变联合时,对喹诺酮类药物高度耐药.本研究结果对兽医临床上喹诺酮类药物的耐药控制及合理使用提供了一些依...     

牛源大肠杆菌对氟喹诺酮类药物的耐药性分析

【目的】了解牛源大肠杆菌对氟喹诺酮类药物的耐药特征,为临床合理用药提供理论依据。【方法】从不同牛场采集腹泻犊牛粪样分离鉴定大肠杆菌,采用微量肉汤稀释法测定大肠杆菌对环丙沙星、恩诺沙星和诺氟沙星3种氟喹诺酮类药物的最小抑菌浓度（MIC）,PCR检测质粒介导的喹诺酮类耐药（PMQR）基因（qnrA、qnrB、qnrD、qnrS、aac（6′）Ib和qepA基因）及喹诺酮耐药决定区（QRDR）突变（gyrA和parC基因）,并选择2株携带PMQR基因的大肠杆菌经恩诺沙星诱导后检测QRDR的gyrA和parC基因突变。【结果】分离鉴定得到75株大肠杆菌,其中60.00%的菌株对至少2种FQs耐药,40.00%的菌株对环丙沙星、恩诺沙星和诺氟沙星均耐药,且对恩诺沙星的耐药程度较为严重。75株大肠杆菌均未检测到qnrA、qnrD和qepA基因,但检测出qnrS、aac(6′)Ib亚型aac(6′)-Ib-cr和qnrB基因,61.33%的菌株至少携带1个PMQR基因,其中以qnrS和aac(6′)-Ib-cr最为常见。58.67%的大肠杆菌发生了QRDR突变,主要突变方式为GyrA:(Ser⁸³Leu＋Asp⁸⁷Asn)＋ParC:Ser⁸⁰Ile,发生突变且携带PMQR基因的大肠杆菌对环丙沙星、恩诺沙星和诺氟沙星均耐药。恩诺沙星诱导后,PMQR阳性菌的gyrA基因发生5处碱基突变,PMQR阴性菌无碱基突变。【结论】大肠杆菌耐氟喹诺酮类药物主要与QRDR突变密切相关,因此兽医临床上应合理使用氟喹诺酮类药物来减缓大肠杆菌的耐药性。     

鸭源大肠杆菌对氟喹诺酮类耐药机制的研究

目的:分析鸭源大肠杆菌对喹诺酮类药物耐药机制。方法:微量肉汤稀释法测定4种喹诺酮类药物对22株鸭源大肠杆菌分离菌及恩诺沙星诱导耐药菌的抗菌活性,并通过PCR和DNA测序检测DNA促旋酶和拓扑异构酶Ⅳ基因(gyrA、gyrB、parC、parE)突变情况。结果:22株分离菌及诱导菌均扩增出目的片段,有18株菌对喹诺酮类药物耐药,耐药率约为82%。基因测序及分析表明:在9个测序菌株中,分别有5、2、6和7株出现gyrA、gyrB、parC和parE碱基突变;其中,gyrA基因突变,gyrB与parC或parE基因同时突变与耐药表型一致,3株仅有parC或parE基因突变的菌株并不明显耐药。gyrA基因突变均为双突变(Ser104→Leu和Asp108→Asn)。结论:鸭大肠杆菌对喹诺酮类药物的耐药严重,其主要机制是喹诺酮类耐药决定区(QRDR)的基因突变,特别是多个位点同时突变导致高水平耐药。     

嗜水气单胞菌喹诺酮类药物抗性决定区基因片段的克隆与突变分析

将分离到的4株对环丙沙星，诺氟沙星和氧氟沙星等喹诺酮类药物耐药的嗜水气单胞菌、2株敏感菌，进行旋转酶基因A亚单位（gyrA)喹诺酮抗性决定区基因（QRDR）PCR扩增。引物序列A1:agagttcctatcttgattacg;a2:ctgtgatgtaggtcatcaact，在gyrA基因中的位置分别为53-73和620-640。PCR扩增后，将扩增产物克隆到pMD-18T载体，酶切鉴定后测序。用DNAstar软件分析比较其蛋白序列，发现4个氨基酸突变位点，分别是83位点的Ser-Ile（4株耐药菌），92位点的Leu-Met(4株耐药菌），174位点的Ile-Phe(3株耐药菌），202、203位点的Asn、Leu-Asp、Arg（3株耐药菌，另1株Leu未突变）。83位点的突变与大肠杆菌等一致，122位点具有保守的Try，耐药菌突变后的氨基酸残基分子量均比对应增大。4株耐药菌、2株敏感菌的喹诺酮抗性决定区基因片段序列巳登录GenBank，注册号AY039655，AY039656，AY138539，AY138540，AY138537，AY138538。     

耐恩诺沙星沙门菌gyrA和gyrB基因的分子特征分析

为了探究临床分离的沙门菌对恩诺沙星的耐药机制,通过微量肉汤稀释法测定18株临床分离的沙门菌对恩诺沙星的敏感性,然后选取其中对恩诺沙星耐药的菌株,利用PCR扩增其gyrA和gyrB基因,并将扩增产物进行序列测定,最后用DNAMAN软件将测序结果与NCBI上公布的沙门菌标准野生型菌株(LT2)的gyrA和gyrB基因序列进行比对分析。结果显示,18株临床分离的沙门菌中有4株为耐药菌株,耐药率22.2%。对4株耐药菌株的gyrA和gyrB基因比对分析发现,gyrB基因未见突变,而gyrA基因有3个氨基酸位点突变,分别是Ser83→Phe或Leu(突变率100%)、Asp87→Asn(突变率75%)、Asn200→Asp(突变率25%);其中恩诺沙星最小抑菌浓度(MIC)≥16.000μg/mL的3株菌均是在83、87位出现双突变,而恩诺沙星MIC为4.000μg/mL的1株菌则是在83、200位出现双突变。结果表明,沙门菌对恩诺沙星产生耐药性与gyrA基因的突变密切相关,gyrA基因喹诺酮耐药区(QRDR)的双突变可使沙门菌对恩诺沙星的耐药性增强,提示Asp87的突变可能增强了Ser83位点突变所介导的耐药性,但非QRDR区的Asn200不能发挥增强耐药性的作用。     

禽致病性大肠杆菌对氟喹诺酮类药物交叉耐药性研究

以广东省野外分离的 15 8株禽致病性大肠杆菌为样本 ,采用纸片扩散法敏感试验标准方法 ,测定氟喹诺酮类药物诺氟沙星、环丙沙星、左氟沙星、氧氟沙星、氟罗沙星、恩诺沙星在临床上的交叉耐药程度。结果显示 ,氟喹诺酮类药物之间存在不同程度的交叉耐药性 ,氟罗沙星对其他 5种试验药物的交叉耐药率为 96%～ 10 0 % ,而左氟沙星对其他药物的交叉耐药率最低 ,平均只有 42 .7% ;两种药物之间的交叉耐药率有的相同 ,但有的差异很大 ,说明交叉耐药性的产生可以是双向 ,也可以是单向或半单向 ,同时也揭示了氟喹诺酮类药物的抗菌机理并不完全相同     

水产动物源气单胞菌喹诺酮类耐药与PMQR基因、QRDR突变相关性分析

为了解PMQR基因、QRDR突变与气单胞菌喹诺酮类耐药相关性,以116株水产源气单胞菌为研究对象,采用PCR法检测PMQR基因(qnrA、qnrB、qnrS、qepA、aac(6′)-Ib-cr)并分析QRDR靶基因gyrA、parC突变情况,用微量二倍稀释法测定萘啶酸(NAL)、环丙沙星(CIP)、恩诺沙星(ENR)的最小抑菌浓度(MIC)值。结果表明:116株气单胞菌中,有18株(15.52%)菌株携带PMQR基因,其中8株(6.90%)携带qnrS2基因,9株(7.76%)携带aac(6′)-Ib-cr基因,1株同时携带qnrS2、aac(6′)-Ib-cr基因,未检测到qnrA,qnrB和qepA基因;56株(48.28%)菌株发生QRDR靶位点突变,主要突变方式为GyrA:Ser~(83)Ile和GyrA:Ser~(83)Ile+ParC:Ser~(87)Ile;对NAL、CIP及ENR耐药率分别为47.41%、12.07%及11.21%;7株仅携带qnrS2基因菌株未发生QRDR突变,对喹诺酮类药物敏感性略下降,NAL、CIP及ENR的MIC值分别小于4.00、0.50和1.00mg/L;10株携带aac(6′)-Ib-cr基因的菌株均发生QRDR突变并对NAL表现耐药,MIC值均128.00mg/L,其中8株对CIP和ENR表现耐药,MIC值均≥4.00mg/L;发生gyrA单突变或gyrA和parC双突变菌株均对NAL表现耐药,MIC值均≥64.00mg/L,CIP和ENR的MIC值有的4.00mg/L,有的≥4.00mg/L。综上,QRDR靶基因突变可影响水产动物源气单胞菌对萘啶酸的药物敏感性,而气单胞菌对氟喹诺酮类药物耐药可能与PMQR和QRDR协同作用有关。     

动物沙门氏菌对氟喹诺酮类药物的耐药性及GyrA基因的突变研究

用纸片扩散法和微量稀释法测定动物沙门氏菌(Salmonella)对氟喹诺酮类抗菌药物的耐药性,PCR扩增沙门氏菌GyrA基因的喹诺酮耐药决定区(Quinolone resistance determining regions,QRDR),扩增的片段长度为487bp,PCR产物直接测序,用DNAstar软件分析氨基酸序列.结果显示,盐酸环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、甲磺酸培氟沙星和烟酸诺氟沙星的最低抑菌浓度(MIC)范围分别为16～128μg·mL-1、32～128 μg·mL-1、32～256μg·mL-1、128～512 μg·mL-1和64～512 μg·mL-1.GyrA基因QRDR的突变位点均位于83和87位氨基酸位点,主要的变异方式为Ser83→Phe(12/15)和Asp87→Asn(10/15),其次为Asp87→Tyr(5/15)和Ser83→Gly(3/15).同时发现QRDR外的119位氨基酸也发生了变异(Ala119→Val),说明试验用菌株对氟喹诺酮类药物均表现为多重耐药,其GyrA基因QRDR的突变表现为多种形式.     

犬源大肠杆菌质粒介导的喹诺酮类药物耐药基因的检测及药物敏感性分析

采用PCR方法检测了102株犬源大肠杆菌中质粒介导的喹诺酮类药物耐药(plasmid-mediated quinolone resistance,PMQR)基因的分布,并采用微量肉汤稀释法测定了6种抗菌药物对犬源大肠杆菌的最小抑菌浓度(MIC)。在被检测的8种PMQR基因中,仅有oqx A、oqx B、qnr S这3种耐药基因被检测出,检出率分别为9.80%、11.76%和14.70%,其中同时含有2种耐药基因的菌株检出率为8.82%,同时含有3种耐药基因的菌株检出率为4.90%;犬源大肠杆菌对喹诺酮类药物已经具有较高的耐药性,其对恩诺沙星、环丙沙星和氧氟沙星的耐药率分别达到了71.57%、64.71%、48.04%。     

犬源大肠杆菌质粒介导的喹诺酮类药物耐药基因的检测及药物敏感性分析

采用PCR方法检测了102株犬源大肠杆菌中质粒介导的喹诺酮类药物耐药(plasmid-mediated quinolone resistance,PMQR)基因的分布,并采用微量肉汤稀释法测定了6种抗菌药物对犬源大肠杆菌的最小抑菌浓度(MIC)。在被检测的8种PMQR基因中,仅有oqx A、oqx B、qnr S这3种耐药基因被检测出,检出率分别为9.80%、11.76%和14.70%,其中同时含有2种耐药基因的菌株检出率为8.82%,同时含有3种耐药基因的菌株检出率为4.90%;犬源大肠杆菌对喹诺酮类药物已经具有较高的耐药性,其对恩诺沙星、环丙沙星和氧氟沙星的耐药率分别达到了71.57%、64.71%、48.04%。     

鸡源肠杆菌质粒介导喹诺酮类耐药基因检测

 【目的】对广东地区分离得到的鸡源肠杆菌进行质粒介导喹诺酮类耐药（PMQR）基因检测。【方法】采用纸片扩散法对84株鸡源肠杆菌临床分离株进行27种抗菌药物的敏感性测定。通过PCR检测质PMQR基因qnr、qepA和aac(6′)-Ib-cr。研究PMQR基因阳性菌株染色体gyrA、gyrB、parC、parE基因喹诺酮耐药决定突变区（QRDRs）的变异情况。【结果】84株鸡源肠杆菌对兽医临床常用的恩诺沙星、氟罗沙星、氨苄西林、复方新诺明、强力霉素以及利福平、链霉素、罗红霉素的耐药率很高,且为多重耐药;对氨苄西林/舒巴坦、氨曲南、多粘菌素E和头孢氨苄的敏感性高。在84株鸡源肠杆菌中检测到1株同时携带qnrB和aac(6′)-Ib-cr基因的肺炎克雷伯氏杆菌GDK05,整个qnrB基因的阅读框架与GenBankTM中的qnrB6一致,同时GDK05在gyrA基因的QRDR出现83位S→I变异,gyrB、parC、parE基因的QRDRs没有检测到变异。【结论】广东地区集约化养殖场鸡源肠杆菌对兽医临床常用抗菌药物耐药严重。本研究首次在兽医临床上检测到1株同时携带qnrB6和aac(6′)-Ib-cr基因的鸡源肺炎克雷伯氏菌。PMQR机制的出现预示着喹诺酮类耐药很可能会在兽医临床上更加快速而广泛地传播。     

猪源大肠埃希菌中质粒介导喹诺酮耐药（PMQR）基因的多样性研究

为研究陕西省关中猪源大肠埃希菌的耐药情况及质粒介导的喹诺酮耐药（PMQR）基因的流行性与多样性,于2017年4月-2018年11月从陕西关中地区数个养猪场分离获得470株大肠埃希菌,采用微量肉汤稀释法测定其对包括3 种氟喹诺酮类药物在内的6类抗菌药物的最小抑菌浓度（MIC）,PCR扩增检测其携带的PMQR基因,并分析PMQR基因阳性菌株gyrA和parC基因的质粒介导喹诺酮耐药决定区（QRDR）的突变情况。结果显示,陕西猪源大肠埃希菌对阿莫西林和土霉素的耐药率高达100%和98.51%,对阿米卡星、氟苯尼考、替米考星和头孢噻呋的耐药率分别为60.64%、52.98%、50.85%和44.47%,且  89.58%为多重耐药菌株。对3种氟喹诺酮类药物恩诺沙星、普多沙星和环丙沙星的耐药率分别为89.58%、  57.66%和56.80%。对美罗培南最为敏感,未发现耐药菌株,但有9株大肠埃希菌对美罗培南的敏感性为中介。对氟喹诺酮类药物耐药的菌株中,PMQR基因qnrS、 aac(6′)-Ib-cr、qnrB、qnrA、qnrD和 qepA的检出率分别为  36.52%、30.14%、17.38%、11.45%和2.49%,且55.30%的菌株携带1种PMQR基因,37.90%携带2种PMQR基因,6.40%携带3种PMQR基因,0.35%携带4种PMQR基因。在282株携带PMQR基因的菌株中,279株发生QRDR突变,其中以gyrA基因的Ser83Leu突变为主。132株PMQR基因阳性菌株parC基因发生Ser80Ile或Ser80Ile+Glu84Val突变。随着菌株所携带PMQR基因的增多,gyrA和parC基因的突变位点也相应增加,细菌的耐药水平也随之增加。     

体外诱导嗜水气单胞菌对喹诺酮类耐药及其耐药机制研究

【目的】探讨在亚抑菌浓度喹诺酮类药物培养后,嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila对喹诺酮类的药物敏感性变化及其耐药机制.【方法】以对喹诺酮类敏感的临床分离嗜水气单胞菌菌株和标准菌ATCC7966为研究对象,分别在含亚抑菌浓度萘啶酸(NAL)和环丙沙星(CIP)的培养基上逐步诱导培养.提取诱导菌的DNA,PCR扩增其gryA和parC基因,测序分析其喹诺酮类耐药决定区(QRDR)突变情况;测定诱导菌对诱导药物和11种非诱导药物的最小抑菌浓度(MIC)及添加外排泵抑制剂羰基氰化氯苯腙(CCCP)后的MIC,分析其敏感性变化与基因突变、外排作用的关系.【结果和结论】诱导后菌株对萘啶酸和环丙沙星的MIC分别提高了1 024和64 000倍,对非诱导药物也有不同程度提高;当萘啶酸和环丙沙星诱导浓度分别达到16和32μg/mL或以上后,诱导菌株gyrA基因编码的氨基酸分别发生Asp87→Tyr和Ser83→Arg的变化,但两者parC基因编码的氨基酸均没有发生突变;添加CCCP后,只有氟喹诺酮类药物的MIC值略有下降,提示嗜水气单胞菌对喹诺酮类耐药存在靶基因突变及主动外排作用等多种耐药机制.     

人工诱导猪链球菌氟喹诺酮耐药株的靶位突变分析

以4株临床分离的对环丙沙星和恩诺沙星敏感的猪链球菌2型菌株为研究对象,采用体外递增药物浓度的方法分别诱导了其对环丙沙星和恩诺沙星耐药的菌株,按CLSI推荐方法测定了环丙沙星和恩诺沙星对亲本敏感株和诱导耐药株的MIC,测定了亲本株和诱导耐药株的生长曲线,并采用PCR和基因测序的方法分析了诱导耐药株的DNA回旋酶(GyrA和GyrB)和拓扑异构酶Ⅳ(ParC和ParE)耐药决定区(QRDR)的基因突变和氨基酸序列变化.结果表明:浓度递增法成功诱导了猪链球菌对环丙沙星和恩诺沙星耐药性,其MIC分别由05 mg·L-1上升至128 mg·L-1;与敏感株比较,恩诺沙星与环丙沙星诱导的耐药菌在gyrA和gyrB,或parC和parE耐药决定区的氨基酸序列有突变,除了已报道的与氟喹诺酮耐药相关的ParC的Ser79Phe,GyrA的Ser81Arg,GyrB的Asp315Asn、Ser285Leu和Glu354Lys及ParE的Pro278Ser点突变外,在诱导菌中还出现了一些不曾报道的突变位点和氨基酸缺失,如GyrA的Gln118His和ParE的Asn297Tyr突变,GyrB的288～291位和ParC的62位氨基酸缺失.结果提示:逐步增加药物浓度可以诱导猪链球菌对氟喹诺酮类抗菌药耐药性,并导致主要靶位发生突变.     

寡核苷酸芯片检测兽医病原菌耐药性的研究

 利用寡核苷酸芯片（oligonucleotide array）对兽医临床常见病原菌耐药性检测进行了初步研究。设计1对兼并引物扩增3种病原菌（E. coli、S. aureus、M. gallisepticum）的gyrA基因片段，并用cy5-dCTP标记荧光。设计一系列检测病原菌对氟喹诺酮类药物耐药的寡核苷酸探针，将探针固定在APS-PDC法制作的Microarray上，用标记的PCR产物与之杂交，置于Scanarrray4000中扫描，利用ImaGene3.0软件对杂交图像进行分析。研究结果表明，设计的兼并引物能很好地扩增出3种病原菌的gyrA基因片段，与Microarray杂交后在相应的位点出现可检测的杂交信号，样本O78S（禽大肠杆菌）、SS（金黄色葡萄球菌）、S6-10（鸡毒支原体）的ratio比值均≥2，说明这3株是敏感株；样本EDr（犬大肠杆菌）、ECr（猫大肠杆菌）与a1探针（检测GyrA第83位氨基酸发生突变的探针）的ratio比值≤0.5，说明这两株是耐药突变株，均与样本的实际情况相吻合。说明利用Oligonucleotide array能快速准确地检测出GyrA亚基第83、87位发生突变的耐药菌株，是可行、有效、快捷的抗菌药耐药性的监测方法。本研究为进一步研制和开发兽医临床常见病原菌耐药性检测芯片打下初步基础。