应用抑制性差减杂交技术分离椪柑枯水相关基因

【目的】探索椪柑枯水分子机理,寻找柑橘枯水应答基因,为柑橘枯水防治奠定基础。【方法】利用抑制性差减杂交技术以椪柑正常果肉cDNA作为Driver,以枯水果肉cDNA作为Tester构建正向差减文库。【结果】挑选了300个有效克隆进行测序分析,260个测序成功。经BLASTx比对分析,197条表达序列标签（ESTs）找到了分属于52个基因的同源序列;63条ESTs同源性较低或没有同源性。对文库中编码β-微管蛋白、衰老相关蛋白、细胞色素c、半胱氨酸蛋白酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶、转运蛋白、天冬氨酸蛋白酶前体、WRKY转录因子21的基因进行实时定量RT-PCR验证,结果显示这8个基因均明显上调表达。这些差异性表达基因主要涉及衰老、抗逆防御、几丁质和细胞壁代谢、蛋白降解等过程。【结论】通过构建椪柑果肉枯水正向文库,得到一些与枯水相关的基因,这些基因反映了果实对枯水的调控情况,可作为今后防治枯水病害的候选基因。     

恶疫霉侵染的草莓SSH文库的构建及分析

为了解草莓与恶疫霉[Phytophthora cactorum (Lebert & Cohn)J.Schr(o)t]互作的分子机制,以感病草莓品种FDP8 21为材料,以接种恶疫霉的草莓冠部为处理、未接种健康生长的草莓冠部为对照,利用抑制性差减杂交技术构建恶疫霉侵染诱导的草莓差异表达的cDNA差减文库.PCR鉴定随机挑...     

应用抑制性差减杂交技术筛选锦橙CTV应答基因

【目的】探讨易感柑橘衰退病病毒（Citrus tristeza virus,CTV）品种锦橙CTV应答分子机理,筛选和分析CTV应答基因。【方法】以嫁接CTV强毒株TRL514的锦橙阳性材料叶片为试验方（Tester）,用嫁接无毒枝条的CTV阴性锦橙叶片为驱动方（Driver）,构建CTV侵染的锦橙的正向差减文库。【结果】随机挑选850个阳性克隆测序,其中742条测序成功,去除载体片段和接头序列后得到有效EST 692条。将所有EST序列对应到柑橘的预测基因组转录物,共涉及137个柑橘基因。应用BLAST2GO对这些特异性表达的基因进行功能归类和KEGG分析。结果表明,受CTV侵染的影响,锦橙能量代谢相关基因上调明显,与光合器官碳固定、氮代谢、淀粉和蔗糖代谢等途径相关的EST出现频率较高。另外,与抗逆防御以及苯基丙氨酸合成、类苯基丙烷代谢、类胡萝卜素合成等与植物防御素类物质合成密切相关的代谢途径相关基因较多。【结论】由于CTV的侵染,CTV易感品种锦橙基础代谢改变明显,须通过增强能量代谢和提高自身防御能力来维持自身生长和发育。     

利用SSH技术鉴定黄瓜胚胎发育相关基因

【目的】寻找黄瓜胚胎发育早期和胚胎发育晚期优势表达基因,研究其胚胎发育的分子机制。【方法】利用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术构建胚胎发育早期和晚期差异表达cDNA文库。【结果】经反向Northernblot杂交检测,共得到97个阳性克隆。利用分子生物学软件对测序后的序列进行质量检测和聚类、拼接,共得到93个UniESTs,其中包括86个singletons和7个contigs。将上述EST序列在GenBank上进行BLAST比对,有83个EST片段找到了与之匹配的同源序列,有10个EST片段未找到同源序列,推测可能是新基因。【结论】其中很多EST与拟南芥、水稻或玉米蛋白质数据库中的热激蛋白具有很高的同源性。将以上序列应用GeneOntology进行功能分类,发现在胚胎发育早期细胞防御和代谢过程占主要位置;在胚胎发育晚期细胞防御和抗渗透胁迫功能是非常重要的。     

不育温度下油菜温敏雄性不育系SSH文库的构建

 以温敏雄性不育系K121S在可育温度（10℃）下和不育温度（26℃）下三核期花蕾为材料,以可育温度下的cDNA为驱动子,通过抑制性差减杂交技术构建了不育温度下抑制性差减杂交（SSH）文库,其插入片段长度分布在200~1 000 bp左右,并随机挑选97个阳性菌落测序,得到20个表达序列标签（EST）,包括与ATP合酶β亚基、Rubp羧化酶小亚基同源的EST等,为进一步获得育性转换相关基因和揭示K121S的育性转换分子机理奠定了基础。     

抑制性差减杂交技术(SSH)及其应用研究进展

抑制性差减杂交技术是一种差异性基因克隆的新技术,它对研究细胞生殖、发育、分化、衰老及死亡等生命过程中有关基因的差异表达及相关基因的分子克隆提供了有力的技术工具。简要概述了抑制性差减杂交技术的基本原理、优越性、缺陷及其在相关基因克隆方面的应用研究进展。     

草鱼肠道组织抑制性消减表达序列标签的初步分析

以致病性嗜水气单胞菌(Aeramonas hydrophila)人工感染的草鱼肠道组织为材料,采用抑制性消减杂交技术,构建了草鱼肠道组织消减cDNA文库,对文库克隆的序列测定和初步生物信息学分析,共获得147个草鱼肠道表达序列标签(EST).序列同源性搜索结果表明,97个EST代表了46个已知基因,其余50个EST为未知序列.与细胞防御相关的EST有43个,分属13个基因.     

青稞抗黄矮病抑制差减文库的构建及差异表达基因的分离

本研究应用抑制差减杂交方法构建了感染黄矮病毒早期,高抗病和高感病青稞种质的差减cDNA文库,共获得了143个带有插入片断的克隆。以构建的抗黄矮病抑制羞减文库的62个片段为基础,对抗病青稞品种52号和感病青稞品种品引5号在感染黄矮病后24h的差异表达基因进行了杂交筛选,获得了9个差异表达的基因片段。对这些片段进行序列分析和同源对比,获得了5个抗性相关基因片段。片段U3,U24在感染后24h的抗性品系中表达增强,同时在EST序列比对中没有发现同源序列,可能为新的抗性相关基因。片段U58,U62为分别在抗性和感性品种中高表达的叶绿体相关基因。片段U23为多胺代谢通路相关基因。通过对这些基因片段的分析,对青稞感染黄矮病早期抗性的机制进行了初步的探索。     

抗禽流感病毒免疫相关基因的筛选与鉴定

 【目的】研究抗禽流感病毒免疫的分子机制,发现新的抗禽流感病毒免疫相关基因,为抗禽流感转基因育种的研究奠定基础。【方法】随机选取40只30日龄AA白羽肉鸡,其中20只鸡注射禽流感H5亚型禽流感灭活疫苗,另20只未注射疫苗鸡作为对照,在注射后第9天取脾脏保存在液氮中。应用mRNA差异显示技术,结合反向northern dot blot鉴定技术,来筛选注射疫苗组和未注射疫苗组的差异表达基因。【结果】筛选出13条差异表达EST,其中未注射疫苗组4条,注射组9条表达量增高。应用BLAST工具将EST对核酸数据库nr和dbEST中所有序列进行了同源性分析。DD3、DD4、DD6、DD9、DD11、DD12与已有核酸数据库中的基因克隆或EST具有较高相似性,为已知的EST,但功能未知。DD10、DD13与鸡核糖体蛋白L7a基因具有很高的相似性。DD1、DD2、DD5、DD8为新的EST,提交到GenBank,分别获得登录号为EB714185、EB714186、EB714187、EB714188。【结论】本研究筛选出的鸡核糖体蛋白L7a基因和其它EST对应的未知功能基因可以作为抗禽流感病毒研究中的候选基因,其具体的功能有待今后进一步研究。     

砀山酥梨萼片发育的SSH文库构建及EST序列分析

为了寻找梨幼果期萼片发育中差异表达基因,为梨幼果萼片脱落分子机制研究提供依据,以砀山酥梨萼片脱落开始期幼果为材料,利用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术构建砀山酥梨幼果期宿萼果与脱萼果差异表达cDNA文库。随机挑取200个阳性克隆,经菌液PCR检测及测序后得到185个EST序列片段,其中小于100 bp、大于300 bp以及介于两者之间的EST片段分别占3%、96%和1%。将这些片段在NCBI上进行BLAST比对,得到调节因子(regulator)、蛋白质(protein)和相关酶类(related enzyme)3类代谢途径相关物质,分别占21%、63%和16%。其中,在Gene Ontology网站上比对到3-异丙基苹果酸脱氢酶(3-isopropylmalate dehydrogenase)和N-酰基-L-氨基酸氨基水解酶(N-acyl-L-amino acid amidohydrolae)2种酶,推测可能是砀山酥梨幼果期萼片发育代谢途径中的重要的相关酶。     

砀山酥梨萼片发育的SSH文库构建及EST序列分析

为了寻找梨幼果期萼片发育中差异表达基因,为梨幼果萼片脱落分子机制研究提供依据,以砀山酥梨萼片脱落开始期幼果为材料,利用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术构建砀山酥梨幼果期宿萼果与脱萼果差异表达cDNA文库。随机挑取200个阳性克隆,经菌液PCR检测及测序后得到185个EST序列片段,其中小于100 bp、大于300 bp以及介于两者之间的EST片段分别占3%、96%和1%。将这些片段在NCBI上进行BLAST比对,得到调节因子(regulator)、蛋白质(protein)和相关酶类(related enzyme)3类代谢途径相关物质,分别占21%、63%和16%。其中,在Gene Ontology网站上比对到3-异丙基苹果酸脱氢酶(3-isopropylmalate dehydrogenase)和N-酰基-L-氨基酸氨基水解酶(N-acyl-L-amino acid amidohydrolae)2种酶,推测可能是砀山酥梨幼果期萼片发育代谢途径中的重要的相关酶。     

鸡卵巢组织SSH cDNA文库构建及差异表达基因筛选与初步鉴定

为分离与鸡产蛋性能密切相关的重要基因或调控因子,利用抑制性消减杂交技术,以高产蛋鸡品种海兰褐商品代蛋鸡和产蛋量相对较低的地方鸡品种大骨鸡20周龄时的卵巢组织为试验材料,构建消减cDNA文库。文库的插入片段集中在500bp左右,挑取720个克隆进行PCR筛选,获得657个阳性克隆,经过点杂交筛选后选择了536个阳性克隆,...     

应用抑制性差减杂交技术构建副猪嗜血杆菌基因组差减文库

为构建副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)有毒力菌株SW124(血清4型)和无毒力菌株H465(血清11型)间的差异表达基因文库,采用抑制性差减杂交技术(Suppression subtractive hybridization,SSH)分析SW124和H465菌株细菌基因组的表达差异,并进行两轮差减杂交和两次PCR扩增,将第2次PCR产物与pMD19-T载体相连,转化大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞并进行文库扩增和蓝白斑筛选,RT-PCR鉴定差异表达文库。结果共获得327个阳性克隆,筛选100个克隆制备质粒进行PCR检测,均扩增出100～2 000 bp大小的片段。差异DNA差减文库的构建为进一步筛选、克隆HPS特异的未知新基因、建立分子鉴别新体系奠定了基础。     

软腐病菌诱导的大白菜抑制差减杂交文库构建及分析

利用抑制差减杂交技术构建了软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora subsp.carotovora)侵染诱导的结球白菜叶片cDNA文库。文库质量检测表明,差减杂交效率较高,质量较好。随机挑取单克隆进行单向测序,获得1 107条长度大于100 bp、质量较好的ESTs序列。利用DNAstar5.0对上述ESTs进行聚类,共获取753个非冗余EST,包括有564个为单拷贝序列(Singletons)和189个重叠群(Contigs)。所获得的编码功能已知的EST有508个,将这些EST进行功能分类,可以看出所代表的基因参与植物体内的各种代谢反应,其中参与初级代谢和能量代谢的最多(33.3%),其次是参与抗病/防卫反应(12.6%)、再次为参与信号传导(11.4%)和蛋白质合成与加工(9.4%),参与细胞的结构与生长发育、物质运输、转录调控等过程的基因相对较少。RT-PCR分析结果表明,MAPK、SA、ROS等信号通路参与软腐病菌诱导的大白菜抗病防卫反应。     

梅花鹿生茸区骨膜细胞基因片段测序分析

在已经构建的梅花鹿生茸区骨膜细胞cDNA表达文库的基础上对文库中的噬菌斑进行随机挑取筛选,对筛选出来的噬菌斑进行质粒亚克隆、鉴定及表达序列标签序列测定和生物信息学分析。通过随机筛选及生物信息学分析的方法发现,在梅花鹿生茸区骨膜细胞中有特殊意义的基因或者基因片段。随机挑选表达频率比较高的11个基因片段中有6个基因片段具有重要意义,对这6个基因片段进行了生物信息学分析,为进一步的鹿茸生物学研究打下了基础。     

叶锈菌诱导的小麦叶片抑制差减杂交文库构建及其分析

 【目的】研究叶锈菌诱导小麦叶片的基因表达情况,从分子水平阐明小麦的抗病机制。【方法】以小麦抗叶锈病近等基因系TcLr41为材料,利用抑制差减杂交技术,构建叶锈菌诱导的小麦叶片cDNA文库,随机挑取文库中的阳性克隆测序,并对测序结果进行功能注释和分类。【结果】成功构建了叶锈菌诱导的小麦叶片抑制差减杂交文库,共获得3 456个阳性克隆。挑取165个阳性克隆进行测序,获得160条高质量EST。对EST序列进行聚类后,共获得107条非重复序列（Unigene）,与GenBank进行BLASTx和BLASTn同源比对,其中70条非重复序列与已知基因同源性很高,占全部非重复序列的65.4%。已知功能的EST涉及植物的能量代谢、信号转导、转录调控及抗病防卫等多方面。【结论】通过对功能已知的基因分析,推测促分裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase）、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（serine/threonine protein kinase）、GTP结合蛋白（GTP-binding protein）、钙网蛋白（calreticulin）、过氧化氢酶（catalase）、谷胱甘肽-S-转移酶（glutathione-S-transferase）、多聚泛素基因（polyubiquitin）、锌指蛋白（zinc-finger protein）、肉桂醇脱氢酶（cinnamyl alcohol dehydrogenase）、转脂蛋白（lipid transfer protein）、类甜蛋白（thaumatin-like）、几丁质酶（chitinase）等可能参与了小麦与叶锈菌的非亲和互作过程。     

短枝型苹果SSH文库构建及相关基因表达分析

【目的】寻找苹果短枝型枝条形成相关基因,为进一步探索苹果短枝型芽变形成机理及选育新的短枝型苹果品种奠定基础。【方法】利用抑制性差减杂交技术构建正反向苹果短枝型芽变枝条和正常型枝条差异表达cDNA文库,利用荧光定量RT-PCR验证文库中克隆的插入片段。【结果】从两个文库中共获得291个有效阳性克隆,插入片段大小主要分布在300—600 bp之间。利用GenBank的BLAST比对分析,其中126个表达序列标签（EST）找到了与之匹配的同源序列。获得的cDNA片段功能涉及代谢、转录、胁迫响应、转运、光合和信号转导;有165个EST片段未找到同源序列。对文库中EST序列进行实时荧光定量RT-PCR验证,结果显示这些EST序列在短枝型芽变枝条与正常型枝条之间差异性表达。【结论】通过构建短枝型苹果正反向文库,得到一些与短枝型苹果枝条节间长度相关联的基因,这些基因可能对短枝型苹果枝条的伸长具有一定作用。     

金鱼头瘤形成相关基因差减文库的构建与分析

采用差减抑制杂交技术(SSH)以1龄红狮头金鱼(Carassius auratus)的头瘤组织为检测子(Tester),40日龄红狮头金鱼幼鱼的头顶上皮组织为驱动子(Driver),构建金鱼头瘤相关基因的差减cDNA文库。以鲫管家基因α-tubilin为参照检测差减效率,结果表明该文库差减效率达210倍,效率较高。随机挑选阳性克隆进行接头特异引物的PCR检测,结果表明插入片段均在0.1~2.0kb之间。利用斑点杂交对PCR检测结果为单一条带的阳性克隆进行筛选并测序,获得高差异性的有效序列93条。通过生物信息学方法对文库序列进行比对、分类和注释,发现若干结缔形成基因和原癌/抑癌基因等与金鱼头瘤形成相关的功能基因,表明cDNA文库构建成功。     

表达序列标签(EST)及其在抗孢囊线虫大豆研究中的应用

表达序列标签(expressed sequence tags,EST)是一种快捷、高效地揭示基因组信息的方法.本文对EST概念、技术原理及其在基因组研究中的应用和进展等方面内容进行了综述,并对EST在大豆基因组研究和抗孢囊线虫大豆研究中的应用进展作一介绍.