睾丸酮丛毛单胞菌3α-HSD的研究进展

3α-HSD(3α-hydroxysteroid dehydrogenase)是睾丸酮丛毛单胞菌在以类固醇为唯一碳源时,产生的一种类固醇脱氢酶,也是降解类固醇的关键酶。本文对睾丸酮丛毛单胞菌3α-HSD基因的调控、酶蛋白结构与功能等生物学特点进行阐述,总结了3α-HSD蛋白的两种获得途径:天然提取和人工诱导表达途径。从技术可行性、实用性和成本控制等几个方面,分析比对二者的优势和不足。介绍和展望了睾丸酮丛毛单胞菌3α-HSD在血清总胆汁酸测定、转基因生物工程、环境或食品中类固醇类激素检测及环境修复等领域的研究现状和应用前景。     

TeiR融合蛋白分离及多克隆抗体的制备

提取睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)基因组DNA,PCR扩增teiR基因,将扩增产物克隆到pET28a中,经酶切验证后获得teiR基因表达载体pET28a-teiR.将重组质粒转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21,添加终浓度为1 mmol.L-1的IPTG进行诱导,提取细菌总蛋白进行蛋白的SDS-PAGE电泳.并根据融合蛋白特性,利用Ni-NTA Spin Column对TeiR融合蛋白进行分离纯化,经分离纯化后的重组蛋白在SDS-PAGE上呈现出单一条带.进一步以获得的TeiR融合蛋白为抗原,制备兔抗TeiR多克隆抗体,经ELISA测定该抗体的效价为1∶10000,该抗体与睾丸酮丛毛单胞菌天然TeiR蛋白反应良好,说明该抗体特异性良好.     

睾丸酮丛毛单胞菌LysR基因的克隆及对3α-HSD/CR表达的调节

采用分子克隆技术构建睾丸酮丛毛单胞菌LysR基因表达载体,并通过与PAX1共转化来分析LysR基因对3α-HSD/CR在E.coliHB101的表达调节。结果表明:酶切和DNA测序显示,所构建的表达质粒pKtac1-LysR含有编码LysR的基因序列且稳定性较好;共转化结果显示,加入重组质粒pKtac1-LysR的3α-HSD/CR的表达量显著高于加入pKtac1的3α-HSD/CR的表达量(P<0.01)。     

苦瓜核糖体失活蛋白MAP30的原核表达与抗体制备

苦瓜核糖体失活蛋白MAP30(Momordica charantia antiviral protein 30)是苦瓜中一种具有抗病毒、抗肿瘤、抗菌等多种生物活性的蛋白质.将舍有重组表达质粒pET-28(a)-MAP30的大肠杆菌BL21进行诱导表达获得了重组蛋白MAP30,对IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导浓度、诱导时间表达条件的分析表明,工程菌经0.2mmol·L~(-1) IPTG诱导6 h实现高效可溶性表达.利用镍离子鏊合亲和层析对重组蛋白纯化,当洗脱液中咪唑的浓度为100 mmol·L~(-1)时,目的蛋白被洗脱的效果最好.将纯化后的重组蛋白免疫家兔,获得了特异性的多克隆抗血清.     

早孕因子多克隆抗体的制备及应用

通过含有家兔早孕因子的重组质粒EPF-pET-32a(+)转化表达宿主菌Escherichia coli Rosetta,IPTG诱导,融合表达硫氧还原蛋白-兔早孕因子Trx-EPF.亲和层析纯化Trx-EPF,并在柱上进行肠激酶酶切,得到EPF蛋白并进行复性.EPF免疫波尔山羊,制备羊抗兔家兔早孕因子抗血清,硫酸铵沉淀纯化多克隆抗体,用于家兔早孕检测.Western-blot结果表明,羊抗兔家兔早孕因子多克隆抗体对家兔早孕的检出率达到100％.     

重组α-银环蛇毒素融合蛋白的诱导表达及表达条件的优化(英文)

[目的]获得有活性的重组α-银环蛇毒素(alpha-bungarotoxin,α-BGT)融合蛋白。[方法]将质粒pGEX-α-BGT转入BL21(DE3)、BL21(DE3)plysS等宿主菌中确定最佳工程菌,并对工程菌进行诱导表达,优化可溶性蛋白的诱导表达条件。[结果]确定JP-α-BGT为表达工程菌,并检测到融合蛋白的表达;可溶性蛋白的最佳诱导表达条件:37℃重培养2.5h后,于22℃以0.50mmol/L的IPTG诱导4h,此时其可溶性融合蛋白的表达量达18.42%。[结论]该研究为后续融合蛋白纯化及α-BGT的分离纯化奠定了坚实基础。     

斑点叉尾鮰hepcidin抗菌肽在大肠杆菌中的融合表达

通过RT-PCR从斑点叉尾鮰肝脏中克隆编码hepcidin原前体肽的基因"pIH"。与参考序列相比,显示两个氨基酸残基的变异。通过对编码hepcidin原前体肽的基因添加EcoR I和HindⅢ酶切位点,选择含"trxA"融合头的pET32a(+)作为表达质粒、E.coliBL21(DE3)作为工程菌,成功构建"pET32a-pIH"原核表达系统。阳性克隆经1 mmol.L-1IPTG诱导、在37℃培养12 h后,表达的"trxA-pIH"融合蛋白70%以上可溶。Tricine-SDS-PAGE分析表明,细胞经超声破碎后的上清通过固化金属离子亲和层析(IMAC)纯化后,可获得高纯度的目的蛋白。     

类法尼醇X受体α基因的原核表达及多克隆抗体制备

根据NCBI上公布的序列设计引物,从Hep G2细胞系中克隆了FXRα的开放阅读框(ORF),构建原核表达载体p ET-28a-FXRα,转化E.coli BL21(DE3),经1.0 mmol·L-1IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测,成功诱导FXRα蛋白;以镍柱亲和层析纯化获得FXRα蛋白,免疫家兔,制备多克隆抗体。Western Blot分析表明:制备的多克隆抗体能够特异识别重组蛋白,为深入研究此受体的功能及新药发现奠定了基础。     

蛋白激酶R的原核表达、纯化及多克隆抗体制备

【目的】构建蛋白激酶R的原核表达系统并制备其多克隆抗体.【方法】利用RT-PCR方法从人的A549细胞中扩增蛋白激酶R(PKR)基因,将其克隆到表达载体pGEX-6P-1中,经纯化后制备特展异性多克隆抗体.【结果】PKR基因经测序鉴定后转化宿主菌BL21(DE3)感受态细胞,经终浓度0.5mmol/L IPTG诱导表达GST-PKR融合蛋白,SDS-PAGE分析表明融合蛋白获得稳定表达.表达产物经Glutathione-sepharose 4B亲和层析初步纯化后,用凝血酶切除GST标签,而后经离子交换层析及分子筛在AKTA Explorer上进一步纯化,得到高纯度无标签的PKR蛋白.以纯化后的PKR蛋白为抗原免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,斑点杂交试验检测其效价达到1∶50 000以上,Western-blot和间接免疫荧光试验(IFA)表明制备的多抗与PKR蛋白的反应具有高度特异性.【结论】PKR蛋白在大肠杆菌中成功表达,且制备的多克隆抗体可用于PKR蛋白的检测,从而为研究PKR在病毒感染过程中的作用提供了重要的工具.     

鸡真核生物翻译起始因子2α的原核表达与多克隆抗体的制备

为了获得鸡源真核生物翻译起始因子2α(Eukaryotic translation initiation factor alpha two,eIF2α)的多克隆抗体,首先经RT-PCR扩增了eIF2α基因的完整编码序列,并成功构建了重组表达质粒pET-32a(+)-eIF2α。将其转化BL21(DE3)经IPTG诱导后,SDS-PAGE显示成功表达出分子量约51 ku的重组融合蛋白。该融合蛋白表达时的最佳诱导时间、诱导温度和IPTG浓度分别为10 h、45℃和1.5 mmoL/L。通过对该蛋白进行Ni~(2+)柱亲和层析纯化,得到了较高纯度的重组蛋白。将纯化后的eIF2α蛋白免疫新西兰黄兔,制备的多克隆抗体ELISA效价达1∶8 000,试验结果为后续eIF2α蛋白功能的研究提供了帮助。     

甜菜夜蛾几丁质脱乙酰酶基因(secda 5)的原核表达及多克隆抗体制备

[目的]几丁质脱乙酰酶(Chitin deacetylase,CDA,EC 3.5.1.41)是昆虫几丁质代谢中的一种关键酶,在昆虫生长、发育和代谢中具有重要作用.本研究旨在克隆甜菜夜蛾secda5基因,对其进行原核表达,同时制备其蛋白的多克隆抗体.[方法]以pMD19-T-secda5重组质粒为模板,通过PCR技术获得编码甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)中肠几丁质脱乙酰酶secda5全长基因,连接pET-28a载体并转化E.coli BL21 (DE3)构建工程菌.以不同IPTG浓度、培养温度对目的蛋白进行诱导表达.[结果]IPTG终浓度为0.50 mmol/L、37℃诱导培养4h时蛋白表达量最高.诱导表达获得的重组蛋白经纯化后制备多克隆抗体.[结论]此研究成功克隆了甜菜夜蛾secda 5基因,并进行了原核表达以及多克隆抗体的制备.     

川西高原黑唇鼠兔乳酸脱氢酶C基因的原核表达

[目的]研究黑唇鼠兔乳酸脱氢酶C（LDH-C）基因的原核表达及重组蛋白的纯化。[方法]采用RT-PCR方法克隆鼠兔LDH-C基因,并将其连接到表达载体pET-32a上,构建鼠兔LDH-C基因的大肠杆菌BL21（DE3）工程菌,通过IPTG诱导表达,表达产物用SDS-PAGE进行分析,使用亲和层析方法进行蛋白纯化。[结果]RT-PCR扩增出1条约1.0 kbp的条带,与预期结果相符;重组表达载体经PCR和双酶切鉴定,产生1个约1.0 kbp的目的片段,表明表达载体构建成功;表达产物经SDS-PAGE分析,得到了分子量略大于45.0kDa以包涵体形式存在的融合蛋白;通过镍亲和层析柱进行纯化,得到了较纯的融合蛋白。[结论]黑唇鼠兔LDH-C基因被成功克隆和表达。 更多还原     

斜带石斑鱼IgZ重链基因的表达纯化和抗体制备

为获得斜带石斑鱼IgZ重链基因的多克隆抗体,成功构建了斜带石斑鱼免疫球蛋白IgZ重链重组蛋白表达质粒pQE30/IgZ,将其转化到大肠杆菌表达菌株M15中,确定了最佳诱导表达条件:IPTG 0.2 mmol/L,诱导温度30℃,诱导时间6h.所获得的IgZ重链重组蛋白经Ni-NTA亲和层析后,纯度达到85％以上;以纯化的IgZ重链重组蛋白为抗原免疫新西兰兔,制备出相应的多克隆抗体,经ELISA测定抗血清效价约为1:320 000.     

狂犬病病毒核蛋白基因在大肠杆菌中稳定表达条件的优化及纯化

将狂犬病病毒SRV9株核蛋白基因按正确的读码框克隆至GST融合表达载体pGEX-4T-1中,转化至大肠杆菌Rosetta株,IPTG诱导表达。表达的融合蛋白经SDS-PAGE分析显示,相对分子量约为82 kD,与预期大小一致。Western-blot检测结果表明,融合蛋白能与多克隆阳性血清发生特异性反应。为获取大量ELISA包被用核蛋白,试验还借助SDS-PAGE方法对重组目的基因的表达条件进行了优化,比较了诱导温度、菌密度I、PTG浓度、诱导时间等参数对重组基因表达的影响,以确定最佳诱导表达条件。结果表明:27~32℃,OD5500.3~0.4,IPTG 0.06 mmol/L、诱导至OD550值不再增加时为最佳诱导表达条件。优化后经扫描分析显示,所表达融合蛋白占菌体总蛋白的20%以上。经包涵体纯化和亲和层析纯化,可获得纯度较高的GST融合蛋白。     

犬细小病毒VP2基因原核表达条件优化与蛋白纯化

为了提高犬细小病毒VP2基因在大肠杆菌E.coli BL21（DE3）中的表达量,通过改变诱导温度、诱导时间及诱导剂浓度等条件对表达量产生影响,以SDS-PAGE电泳分析证明VP2基因蛋白表达的最佳条件,并通过Glutathione Sepharose 4B亲和层析柱法纯化目的蛋白。结果表明,重组质粒E.coliBL21（DE3）在35℃,1.0 mmol/mL IPTG诱导6 h时条件下蛋白表达量最高。SDS-PAGE电泳检测的纯化目的蛋白约为90 kDa,与预计大小一致。VP2基因融合蛋白的优化表达和纯化为研究犬细小病毒亚单位疫苗奠定了基础。     

大肠杆菌6-磷酸甘露糖异构酶基因的克隆与表达

通过PCR克隆了大肠杆菌6-磷酸甘露糖异构酶基因manA,分别构建了含manA基因的原核和真核生物表达载体。在大肠杆菌中经IPTG诱导表达的GST-PMI融合蛋白,经亲和层析纯化和PreScission蛋白酶酶切,SDS-PAGE分析证实PMI蛋白为42 ku。对转manA基因的拟南芥进行PCR分析表明,manA基因已稳定整合到拟南芥基因组中。氯酚红显色反应证实,整合到拟南芥基因组中的manA基因能表达具有6-磷酸甘露糖异构酶活性的PMI蛋白。这些结果说明,克隆的manA基因可在细菌和高等植物中高效表达。     

植物乳杆菌亚油酸异构酶基因在大肠杆菌中的表达和功能鉴定

应用基因重组表达技术将一个推定的植物乳杆菌亚油酸异构酶基因(pli18)克隆到pET-30a载体的T7启动子的下游,构建pET30-pli原核表达载体。经IPTG诱导和低温培养20h后,在其宿主菌E.coliBL21(DE3)中成功表达了可溶性的PLI18重组蛋白。通过Ni-NTA亲和层析纯化和酶反应产物的气相色谱检测表明,PLI18重组蛋白具有亚油酸异构酶活性,从而证明pli18基因为1个新的亚油酸异构酶基因。为亚油酸异构酶的进一步研究及其在农产品加工中的应用打下了基础。     

H3N8亚型马流感病毒HA1基因原核表达载体的构建及表达

采用RT-PCR方法从马流感病毒中国分离株A/马/新疆/07(H3N8)中扩增的HA1基因片段,将其克隆到表达载体pET-28a(+)中,测序正确后转化入Rosetta(DE3)中进行IPTG诱导表达。结果表明,重组菌表达出约53ku,以沉淀性形式存在的重组蛋白,且在37℃,0.4mmol/L IPTG条件下诱导8h表达效果最好。表达产物经切胶纯化后得到纯度较高的目的蛋白。经Western-blot分析,表达的蛋白与抗马流感病毒阳性血清发生特异性反应,证实该蛋白具有良好的反应原性。     

缬氨酸转氨酶工程菌的构建及表达条件的优化

[目的]构建缬氨酸转氨酶基因(avtA)的大肠杆菌工程菌,并优化其表达条件。[方法]将avtA基因插入到载体pET32a中,构建表达质粒pET32a-avtA,通过纸层析检测酶活性,SDS-PAGE凝胶电泳检测目的蛋白,并通过考察培养基中蛋白胨浓度、IPTG诱导浓度和诱导时间来优化其表达条件。[结果]成功构建了缬氨酸转氨酶基因的大肠杆菌工程菌,其最佳表达条件为:培养基中蛋白胨浓度为12g/L,IPTG浓度为0.4 mmol/L,诱导时间为8 h。[结论]缬氨酸转氨酶工程菌具有良好的应用前景。     

新疆卡拉库尔羊TNF-α原核表达及多克隆抗体的制备

[目的]克隆卡拉库尔羊TNF-α基因,在大肠杆菌中表达、纯化,并对TNF-α蛋白的抗原性进行分析.[方法]采用PCR技术扩增TNF-α基因核酸片段,并克隆入pET-28b表达质粒,在大肠杆菌BL21(DE3)株中表达.用电洗脱法纯化目的蛋白,并用免疫印迹法分析纯化蛋白的抗原特异性.[结果]重组质粒在BI21 (DE3)菌株中经IPTG诱导表达一个相对分子质量约为49 KD的融合重组蛋白,原核表达质粒pET-28b-TNF-α表达的目的融合蛋白是以可溶的形式存在.用纯化的pET-28b-TNF-α免疫家兔,在免疫后的第45 d,Westem-blotting和琼脂糖扩散试验分析表明,表达的pET-28b-TNF-α能被家兔的阳性血清所识别.[结论]表达蛋白pET-28b-TNF-α具有较好的反应原性和免疫原性.