鸡白介素18与鸡γ干扰素基因融合表达载体构建

为了研究新型细胞因子制剂,构建鸡白细胞介素18和鸡干扰素γ的基因融合表达载体。无菌提取鸡脾细胞的总RNA,以其为模板经过RT-PCR的方法分别扩增出Ch IL-18和Ch IFN-γ基因片段,并连接到p MDTM18-T克隆载体上,构建重组质粒p MDTM18-T-Ch IL-18和p MDTM18-T-Ch IFN-γ。以重组质粒p MDTM18-T-Ch IL-18和p MDTM18-T-Ch IFN-γ为模板,利用多肽氨基酸接头和overlap技术,获得Ch IL-18-Ch IFN-γ融合基因并连接到克隆载体p MDTM18-T上,经PCR、酶切及测序鉴定正确后连接到p ET32a原核表达载体中。构建Ch IL-18-Ch IFN-γ原核表达载体。为下一步研究二者之间的作用关系及抗病毒功能奠定了基础。     

鸡IL-18和IFN-γ协同抗病毒机制分析

禽病毒性疾病如禽传染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease,IBD)一直困扰着养禽业的健康、快速发展。在其他抗病毒感染的药物效果不理想时,有必要应用细胞因子制剂来改善机体免疫并提高抗病毒能力。已证明,鸡白细胞介素18(Chicken interleukin-18,Ch IL-18)和鸡干扰素γ(Chicken interferon,Ch IFN-γ)对多种病毒感染具有抑制作用。为了研究新型细胞因子制剂,该实验分析了鸡白细胞介素18(Chicken interleu-kin-18,Ch IL-18)和鸡干扰素γ(Chicken interferon,Ch IFN-γ)以及二者混合后的抗病毒机制。Ch IL-18和Ch IFN-γ蛋白注射雏鸡后7d内,应用试剂盒检测雏鸡体内血清中细胞因子的变化情况。利用鸡外周血单核细胞分析Ch IL-18和Ch IFN-γ对细胞内NO、几种Toll样受体(Toll-like receptors,TLR)及下游信号通路的影响。实验结果表明,混合组蛋白可刺激雏鸡血清中产生高水平IL-6,IL-12,及IL-17。混合组蛋白可以诱导巨噬细胞中NO的分泌水平显著升高,TLR 2、TLR 3、TLR 4和MHC-II的表达量升高,MAPK和NFκB信号通路被激活。综上结果表明,Ch IL-18和Ch IFN-γ以及二者协同可诱导机体对病毒感染产生有效的防御作用,为新型细胞因子制剂的研究提供参考。     

免疫增强剂提高H9亚型禽流感灭活疫苗在SPF鸡体中细胞因子的免疫应答

为探讨免疫增强剂(VA5)提高SPF鸡免疫功能的机理,将SPF鸡分别免疫H9亚型禽流感灭活疫苗、含VA5的H9灭活疫苗、含IL-4和/或IFN-γ真核质粒的H9亚型禽流感灭活疫苗,另设空白对照。检测免疫鸡外周血CD4~+、CD8~+T淋巴细胞亚群数目及IL-4和IFN-γ细胞因子含量的变化及血清抗体效价。结果显示,在14日龄、17日龄和21日龄和28日龄,免疫IL-4和H9、IL-4与IFN-γ和H9以及VA5佐剂与H9组的CD4~+淋巴细胞亚群上升快且比例高于其他组,免疫IFN-γ和H9、IL-4与IFN-γ和H9以及VA5增强剂与H9组的CD8~+淋巴细胞亚群上升快且比例高于其他组,IL-4的上升趋势与CD4~+细胞类似,IFN-γ的上升趋势与CD8~+类似。免疫含VA5的禽流感(H9亚型)灭活苗组在免疫后第2周、3周和4周血清HI效价达到7lg2以上,高于其他各免疫组。说明,与直接添加IL-4和IFN-γ的细胞因子质粒组相比,VA5免疫增强剂能够促进SPF鸡外周血淋巴细胞增值,提高CD4~+、CD8~+T淋巴细胞的比例,并诱导IL-4和IFN-γ细胞因子分泌。     

哮喘及肺炎患儿血浆白细胞介素-18、白细胞介素-16、 白细胞介素-4及γ-干扰素水平的相关性及临床意义

目的 探讨哮喘及肺炎患儿血浆白细胞介素(IL)-18、IL-16、IL-4及γ-干扰素(IFN-γ)水平的相关性及临床意义。方法 研究对象为哮喘患儿(哮喘组)33例,肺炎患儿(肺炎组)38例,健康小儿40例(对照组),采用酶联免疫吸附实验(ELISA)测定研究对象血浆IL-18、IL-16、IL-4及IFN-γ水平,并比较各指标的相关性。结果 哮喘患儿急性发作期和非发作期血浆IL-16、IL-4水平与对照组比较,差异有统计学意义(F=15.687、18.359,P<0.05),血浆IL-18和IFN-γ水平,在急性发作期、非发作期与对照组相比,差异无统计学意义(F=3.025、4.367,P>0.05)。肺炎患儿急性期和恢复期血浆IL-18、IL-16水平与对照组相比,差异有统计学意义(F=24.386、31.256,P<0.05),血浆IL-4和IFN-γ水平,在急性期、恢复期与对照组相比,差异无统计学意义(F=5.328、5.587,P>0.05)。哮喘患儿血浆中IL-18与IL-4、IFN-γ之间,IL-16与IL-18、IL-4、IFN-γ之间显著正相关(P<0.05);IL-4与IFN-γ之间存在显著负相关(P<0.05)。肺炎患儿血浆中IL-18与IL-16、IL-4、IFN-γ之间,IL-16与IFN-γ之间显著正相关(P<0.05)。结论 IL-18、IL-16、IL-4、IFN-γ参与了小儿哮喘和肺炎的免疫反应过程。     

IL-18对小鼠Th1和Th2细胞免疫应答作用的研究进展

IL-18在IL-12的协同下能诱导T、B、NK细胞产生大量的IFN-γ,促进Th1细胞产生IFN-γ、IL-12、GM-CSF及上调IL-2Rα的表达;IL-18在没有IL-12的协同下,能诱导T细胞、NK细胞、嗜碱性细胞和肥大细胞产生IL-13和(或者)IL-L等Th2相关细胞因子,促进Th2细胞的分化。所以IL-12和IL-4等主要细胞因子对IL-18Ra的这种正负调节决定了IL-18在免疫反应中的不同作用。因此,IL-18能增强Th1和Th2引起的免疫应答。本文就IL-18对小鼠Th1和Th2细胞免疫应答作用的研究进展作一综述。     

芦荟多糖提高鸡免疫功能的研究

[目的]研究芦荟多糖对鸡免疫功能的作用。[方法]采用环磷酰胺复制雏鸡免疫抑制模型,通过多项免疫学指标检测,探讨芦荟多糖对正常、免疫抑制及新城疫疫苗免疫雏鸡免疫功能的影响。[结果]芦荟多糖可以增加健康雏鸡的增重,促进免疫器官胸腺、脾脏和法氏囊的发育,特别是胸腺的发育,对正常雏鸡血清IFN-γ和血清IL-2具有一定的诱生能力;芦荟多糖对于环磷酰胺引起的雏鸡免疫抑制试验显示,可以明显增加免疫抑制雏鸡的增重,能促进血清IL-2和IFN-γ的诱生,提高机体的抵抗力,特别是在高剂量对IL-2的诱生作用上差异显著（P〈0.05）;芦荟多糖能够提高ND抗体水平。[结论]芦荟多糖可以改善正常雏鸡的免疫状态、增重和细胞因子诱生水平。     

卡介菌多糖核酸对IBDV感染鸡的免疫活性研究

为了评价卡介菌多糖核酸(BCG-PSN)在畜禽病毒性疾病中的作用及其诱导机体免疫的能力,建立了人工感染传染性法氏囊病(IBD)动物模型,通过检测免疫器官指数、IBDV抗体、外周淋巴细胞亚群、诱导干扰素和白介素水平等特异性和非特异性免疫指标,评估不同剂量BCG-PSN对IBDV感染鸡免疫功能的影响。结果显示:免疫器官脾脏指数和胸腺指数在注射BCG-PSN的初期出现上升趋势,而在注射BCG-PSN后期(15d)受试鸡外周血液CD4+/CD8+值显著提升;各BCG-PSN注射组的IBDV抗体滴度在试验初期明显提高;从注射开始,BCG-PSN就显示出其对IFN-γ、IFN-α和IL-2的显著提升效果。上述结果说明:BCG-PSN既能调节IBDV感染鸡的细胞免疫功能,又能调节机体的体液免疫功能,激活组织细胞释放包括IFN-γ、IFN-α和IL-2等多种细胞因子,以0.3mg·kg-1的注射剂量可获得良好的免疫效果。     

4种多糖对鸡淋巴细胞中IL-4、IFN-γ mRNA表达的影响

为了研究中药多糖增强免疫的作用和分子机理,用Primer Premier软件设计了1对白介素-04（IL-4）引物,1对干扰素-γ（IFN-γ）引物。从多糖辅助ConA刺激的鸡外周血淋巴细胞中提取总RNA,用RT—PCR技术扩增出目的基因片段,并对其进行了酶切鉴定和测序。用荧光定量PCR方法测定黄芪多糖（APS）、板蓝根多糖（IRPS）、山药多糖（CYPS）、牛膝多糖（ARPS）4种多糖对鸡外周血T淋巴细胞IL-4、IFN-γ的mRNA表达的影响。结果表明,合适剂量的APS、IRPS、ARPS和CYPS均能提高淋巴细胞IL-4、IFN-γ的mRNA表达水平,并且APS、IRPS的效果优于ARPS、CYPS,这可能是多糖增强机体免疫的分子机制之一。     

肺炎支原体肺炎患儿血清IL-4、IL-18及IFN-γ检测及意义

目的：探讨小儿肺炎支原体肺炎（Mycoplasmal pneumonia．MPP）血清IL-4、IL-18及IFN-γ的变化及其临床意义。方法：住院确诊的MPP患儿24例及正常对照组儿童21例。用ELISA测定MPP急性期、恢复期、正常对照组血清IL-4、IL-18及IFM-γ。结果：MPP患儿血清IL-4、IL—18含量急性期明显高于恢复期和正常对照组．差异有非常显著意义（P〈0．01）；恢复期和正常对照组比较．无统计学意义（P〉0．05）；重症组明显高于轻症组（P〈o．05）；血清IFN-γ含量急性期轻度高于恢复期和正常对照组，但无统计学意义；血清IL-4／IFN-γ比值急性期高于恢复期和正常对照组，差异有显著意义；MPP患儿急性期血清IL-4含量重症组E日显高于轻症组。急性期IFN-γ含量重症组稍高于轻症组，但无统计学意义；恢复期IFN-γ、IL-4、IL-4／IFN-γ重症组和轻症组比较无统计学意义；MPP忠儿血清IL-4，IL-8呈显著正相关（P〈0．001）。结论：MPP患儿存在TH1／TH2失衡。TH2反应占优势，IL-4及IFN-γ参与MPP患儿的免疫状态改变，在MPP发病机制中起一定作用。IL-18在肺炎支原体肺炎患儿血清中明显增高．且与IL-4呈正相关，IL-18可能在促进IL-4的分泌中起到一定的作用。     

弓形虫代谢分泌抗原对仔猪IL-2、IL-4、IFN-γ和TNF-α表达水平的影响

通过免疫后攻毒的方法研究了弓形虫代谢分泌抗原(E/SA)免疫后对不同免疫组仔猪机体白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-4(IL-4)、干扰素-γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量的影响.结果表明:免疫后各免疫组仔猪的IL-2、IL-4、IFN-γ含量均不同程度的升高;其中E/SA组IL-2、IL-4和IFN-γ的水平显著升高,与对照组差异显著(P0.05),其含量分别由免疫前的105.05、105.33、67.50pg.mL-1升高到免疫后的194.03、342.50、296.50pg.mL-1;TNF-α水平变化不显著.试验证实弓形虫代谢分泌抗原疫苗能够促进仔猪IL-2、IL-4、IFN-γ的分泌,并引起宿主抗弓形虫感染的免疫应答.     

罗曼鸡白细胞介素18基因的克隆、表达及生物学活性检测

应用RT-PCR技术从罗曼鸡脾淋巴细胞RNA中扩增鸡白细胞介素18(ChIL-18)全基因,并克隆和测序。结果表明,获得了ChIL-18全序列,其大小为597 bp。将其成熟蛋白基因(510 bp)亚克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG的诱导下表达融合蛋白(GST-ChIL-18)。SDS-PAGE可检测到分子质量为约46 kDa的融合蛋白,Western blot证实该融合蛋白可与鼠抗鸡IL-18单克隆抗体发生特异性反应。用MTT法测定表明,重组蛋白能明显促进鸡T细胞转化的活性。     

鸡IL-2全基因和去信号肽基因的原核表达

根据已发表的鸡白介素-2(ChIL-2)cDNA编码基因序列设计3条引物,利用RT-PCR技术从经诱导的卢氏鸡胚脾淋巴细胞中扩增出429 bp的ChIL-2全长基因cDNA和363 bp去除信号肽的ChIL-2基因cDNA.将ChIL-2全长和去信号肽的基因cDNA分别克隆到原核表达载体pET28a(+),构建原核重组表达质粒pET28a-IL-2和pET28a-△SIL-2,并分别转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,SDS-PAGE检测,在22 ku和18 ku处有2条清晰的蛋白带,相同条件下pET28a-△SIL-2表达量较高.RNAstructure软件分析表明,pET28a-IL-2的mRNA5′端序列形成了复杂且较为稳定的二级结构,不利于翻译的起始,证明信号肽序列的存在对ChIL-2基因在原核细胞中的表达有一定的影响.     

鸡IL-18基因的克隆表达及对新城疫疫苗诱导的HI抗体变化的研究

通过RT-PCR方法从新城疫Ⅰ系疫苗诱导的11日龄鸡胚脾脏细胞中扩增出鸡白细胞介素18(Chicken interleukin-18,ChIL-18)成熟蛋白基因的cDNA,并将其克隆到pMD18-T载体上。DNA序列测定表明,克隆得到ChIL-18全基因,其编码区大小为597bp,编码198个氨基酸多肽。将该基因片段克隆到原核表达载体pProEXTMHTb构建重组质粒pProEXTMHTb-ChIL-18转化大肠杆菌DH5α中,并用IPTG诱导。重组菌菌体裂解物SDS-PAGE可检测到相对分子量为28.6ku的重组蛋白。观察ChIL-18蛋白对新城疫疫苗诱导的HI抗体动态变化。结果表明,同时接种ChIL-18蛋白和活疫苗的免疫鸡在接种后,所产生的HI抗体效价高于PBS和活疫苗免疫组,并且,HI抗体效价在15d及热应激24h时表现差异显著(P<0.05)。表明ChIL-18蛋白对新城疫疫苗诱导的HI抗体有增强作用。     

鸡IL-2全基因和去信号肽基因的酵母表达研究

根据已发表的鸡白介素-2（ChIL-2）cDNA编码基因序列设计三条引物,利用RT-PCR技术从经诱导的卢氏鸡胚脾淋巴细胞中扩增出429bp的ChIL-2全长基因cDNA和363bp去除信号肽的ChIL-2基因cDNA。分别克隆到酵母表达载体pPICZαA中,并分别转化巴斯德毕赤酵母X-33中,经甲醇诱导,SDS-PAGE检测,在28kD和24kD处有两条清晰的蛋白带,相同条件下pPICZαA-△SIL-2表达量较高。RNAstructure软件分析表明,pPICZαA-IL-2的序列形成了较为稳定的二级结构,不利于翻译,证明信号肽序列的存在对ChIL-2基因在酵母细胞中的表达有一定的影响。     

鸡白细胞介素-18真核表达载体构建与ILTV弱毒疫苗联合免疫

为了探索鸡IL-18在传染性喉气管炎病毒(ILTV)弱毒疫苗中的免疫佐剂作用,将鸡IL-18(ChIL-18)克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1/ChIL-18(简称pIL-18)。用pIL-18、ILTV弱毒疫苗及其两者联合分别免疫21日龄SPF雏鸡,免疫后每周抽取外周血及外周抗凝血,应用ELISA和流式细胞仪分别检测免疫鸡的体液免疫及细胞免疫水平。免疫后第4周用100 ELD50ILTV强毒进行攻击。结果pIL-18与ILTV弱毒疫苗联合免疫组的淋巴细胞亚群CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+明显高于ILTV弱毒疫苗免疫组(P<0.01),ILTV强毒攻毒后发病鸡数量少,并且发病症状较轻。     

鸡α干扰素/白细胞介素2基因的融合表达及活性研究

【目的】研究高效广谱鸡基因工程重组复合抗病毒制剂以对鸡的病毒性疾病进行防治。【方法】采用重叠延伸PCR(splicing by overlap extension-PCR,SOE-PCR)方法通过一基因柔性接头将鸡α干扰素(chicken interferon alpha,ChIFN-α)与鸡白细胞介素2(chicken interleukin-2,ChIL-2)基因构建成ChIFN-α-linker-ChIL-2嵌合基因并克隆入pGEM-T Easy载体,将嵌合基因亚克隆入pQE-30表达载体中进行原核表达。通过尿素变性、低浓度蛋白复性液复性、PBS溶液透析等步骤对表达的重组融合蛋白(rChIFN-α-linker-ChIL-2)进行纯化。采用细胞病变抑制法检测rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在细胞上抑制水泡性口炎病毒(VSV)和传染性法氏囊病毒(IBDV)增殖活性。采用ChIL-2ELISA试验方法检测rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白与抗ChIL-2单抗发生特异性免疫反应的活性。分别测定rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在SPF鸡胚上对新城疫病毒(NDV)和禽流感H9N2亚型病毒(AIV H9N2)的抑制活性以测定其在鸡胚内抗病毒活性。分别测定rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在鸡体内对NDV活疫苗和灭活疫苗的免疫增强作用以测定其在鸡体内的活性。【结果】成功构建并克隆了ChIFN-α-linker-ChIL-2嵌合基因。嵌合基因在大肠杆菌中表达的rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白分子量大小约35.9kD,蛋白经纯化后纯度在96%以上。rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在CEF细胞上具有明显抗病毒活性,其抗VSV和IBDV活性明显高于单一rChIFN-α的抗病毒活性;rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白可以和抗ChIL-2单抗发生特异性免疫反应。IFN-α活性单位为200IU的rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在SPF鸡胚内可明显降低NDV和AIV H9N2所引起的鸡胚死亡和胚体出血,并能显著延长鸡胚存活时间,但过高剂量的rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白抑制鸡胚死亡和出血能力有所下降。合适剂量的rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在鸡体内具有显著的抗病毒活性和免疫增强活性。【结论】rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在鸡体内外均具有ChIFN-α和ChIL-2蛋白的双重生物学活性,这为进一步研究以rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白为主要成分的基因工程抗病毒制剂在鸡体内抗病毒活性研究奠定了基础。     

固始鸡白细胞介素2基因的克隆、表达及其表达蛋白活性的检测

参照GenBank上已发表的鸡白细胞介素2序列设计引物,运用RT-PCR技术,从经ConA诱导的 20～35日龄固始鸡脾细胞总RNA中扩增出目的片段,IL-2基因,将其插入到pGEM-T载体上,构建了克隆质粒 pGEM-T-chIL-2。测序结果表明,本试验克隆的固始鸡白细胞介素2基因与GenBank上已发表的序列相比,存在2 个核苷酸变异。重新设计表达引物,以克隆质粒pGEM-T—chIL一2为模板PCR扩增表达片段,对表达片段进行 Hind Ⅲ和BamH Ⅰ双酶切,连接到作同样双酶切的pET28a表达载体上,鉴定后转化大肠杆菌BL21并进行IPTG 诱导表达,然后对表达产物进行SDS-PAGE电泳鉴定,结果表明,表达蛋白主要以包涵体的形式存在,表达蛋白分子质量约为18 ku;目的蛋白表达量占总量的18％。体外活性检测表明,重组蛋白具有促进淋巴细胞增殖的活性。     

IBDV VP2/4/3、ChIL-18共表达载体的构建及在Vero细胞上的表达

为提高传染性法氏囊病病毒(IBDV)多聚蛋白(VP2/4/3)DNA疫苗的免疫效果,应用重叠延伸剪切技术(splicing by overlapping extension)将IBDV VP2/4/3基因与鸡白细胞介素18(ChIL-18)基因分别经3次PCR获得融合基因片段VP2/4/3-ChIL-18和ChIL-18-VP2/4/3,将融合基因片段定向插入真核表达载体pCI中,获得重组质粒pCI-VP2/4/3-ChIL-18和pCI-ChIL-18-VP2/4/3;应用PCR法,在本实验室已成功构建的重组真核表达载体pCI-VP2/4/3和pCI-ChIL-18的基础上,构建VP2/4/3基因和ChIL-18基因的共表达载体co-pCI-VP2/4/3-ChIL-18。在脂质体介导下将上述重组真核表达载体转染Vero细胞,间接免疫荧光证实重组质粒能正常表达目的蛋白,表达的蛋白具有免疫反应性。这为进一步研究ChIL-18的分子免疫佐剂作用及研制高效、价廉的IBDV DNA疫苗提供了实验依据。     

白细胞介素18和鸡白细胞介素18

白细胞介素 18是一种新发现的细胞因子 ,主要由单核巨噬细胞系统的细胞分泌。目前在分子水平上已经证明 ,人、哺乳动物和某些鸟类中都有 IL- 18存在。IL- 18在结构上属于 IL- 1家族 ,在功能上它与 IL- 12相似 ,且二者有协同效应。 IL- 18具有多种生物学功能 ,它不仅可以增强 Th1型免疫反应 ,而且在 Th2型免疫反应中也发挥一定的作用。人类医学研究证明 IL- 18在抗微生物感染、抗肿瘤免疫中具有应用潜力。在集约化畜禽养殖业中 ,包括白细胞介素 18在内的细胞因子作为天然的免疫调节剂 ,目前已被公认为是一种可以替代传统疗法的新型治疗剂。鸡 IL- 18基因是最近才被发现的 ,由于它具有与人和哺乳动物相似的生物学功能 ,因而鸡 IL- 18在比较免疫学研究和禽病治疗中具有重要意义。     

岭南黄鸡肌生长抑制素基因成熟肽的克隆及酵母表达质粒的构建

根据Genebank上登录的鸡的myostatin基因cDNA全长序列以及成熟肽序列设计一对引物,并分别在两引物前设计两个酶切位点EcoRⅠ和KpnⅠ,克隆岭南黄鸡肌肉生长抑制激素的成熟肽蛋白编码基因,然后将特异性片段连接到pMD18-T载体,经酶切、PCR鉴定后,构建了岭南黄鸡真核单纯表达载体pPICZαA-MSTN-m,经测序鉴定,结果表明所克隆的myosta-tin成熟肽基因与Genebank上发表的鸡（AF019621）、猪（AY208121）和家鹅（AF440862）的MSTN-m核酸序列同源性分别可达到99%、92%、86%,但翻译后的成熟蛋白氨基酸序列与鸡、猪和家鹅的同源性可以分别达到100%、99.1%及99.1%。