亮氨酸或组氨酸通过哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路影响奶牛乳腺上皮细胞中酪蛋白的合成

本试验以永生化奶牛乳腺上皮细胞系为模型,单一添加不同浓度的亮氨酸或组氨酸,检测酪蛋白和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路相关基因的表达,旨在探讨亮氨酸和组氨酸通过mTOR信号通路影响酪蛋白合成的机制。以厄尔平衡溶液代替培养基,并设其为阴性对照,单一添加不同浓度的亮氨酸或组氨酸,分别采用噻唑蓝(MTT)比色法检测永生化奶牛乳腺上皮细胞12和24h的增殖;运用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测4个酪蛋白编码基因和8个mTOR信号通路相关基因mRNA表达量。结果表明:分别添加不同浓度亮氨酸或组氨酸12和24h,细胞增殖趋势一致;与阴性对照组相比,分别添加0.15~5.40mmol/L亮氨酸或0.15~9.60mmol/L组氨酸,永生化奶牛乳腺上皮细胞的数量均增加。与阴性对照组相比,当分别添加0.45~10.80mmol/L亮氨酸6h时,αs1-酪蛋白(CSN1S1)、αs2-酪蛋白(CSN1S2)和κ-酪蛋白(CSN3)基因表达均显著上调(P0.05)。当添加0.15~4.80mmol/L组氨酸6h时,CSN1S1、β-酪蛋白(CSN2)和CSN3基因表达均显著上调(P0.05)。在试验组中,当亮氨酸浓度为1.35mmol/L时,mTOR信号通路相关基因mTOR、mTOR调控蛋白(raptor)、mTOR复合物1中的绑定蛋白(GβL)、信号下游因子真核翻译起始因子4E结合蛋白1(4EBP1)和真核细胞翻译延伸因子2(eEF2)基因表达量最高。而核糖体S6蛋白激酶(S6K1)基因的表达量随着亮氨酸浓度的增加而减少。当添加组氨酸时,下游信号因子4EBP1、eEF2、真核翻译起始因子4E(EIF4E)和核糖体蛋白S6(rps6)基因的表达量随着组氨酸浓度的增加而增加,mTOR基因的表达量随着组氨酸浓度的增加而减少。在试验组中,GβL的表达量在组氨酸的浓度达到4.80mmol/L时最高;S6K1基因表达量在组氨酸的浓度达到1.20mmol/L时最高。综上所述,在乳腺上皮细胞中,亮氨酸和组氨酸能通过mTOR信号通路促进酪蛋白合成相关基因的表达。     

奶牛乳腺中4F2hc基因的表达模式及亮氨酸对其表达的调控研究

为了研究4F2hc在奶牛乳腺中的表达模式及调控方式,进一步明确氨基酸在奶牛乳腺上皮细胞中的跨膜转运过程,本研究采用Western blotting和实时荧光定量PCR技术检测了4F2hc在泌乳期和干奶期奶牛乳腺组织中的表达变化;在体外培养的泌乳期奶牛乳腺上皮细胞中添加亮氨酸,采用Western blotting和实时荧光定量PCR技术检测其对奶牛乳腺上皮细胞中4F2hc表达的影响;采用雷帕霉素抑制剂抑制mTOR信号通路,使用Western blotting方法检测mTOR信号抑制后奶牛乳腺上皮细胞中4F2hc表达以及乳蛋白合成的变化。结果显示,在泌乳期的奶牛乳腺组织中4F2hc的mRNA和蛋白表达水平均显著或极显著高于干奶期(P0.05,P0.01);在体外培养的奶牛乳腺上皮细胞中添加亮氨酸可以极显著提高乳腺上皮细胞中4F2hc的mRNA和蛋白质表达水平(P0.01);亮氨酸刺激可以激活细胞内的mTOR信号通路(P0.05),而雷帕霉素处理则可以显著抑制mTOR信号分子的磷酸化并极显著抑制亮氨酸诱导的4F2hc的表达(P0.05,P0.01),进而极显著抑制β-Casein的合成(P0.01)。以上研究结果表明,4F2hc基因的表达与奶牛乳腺的泌乳活性之间呈正相关,亮氨酸可以通过激活mTOR信号通路来调节4F2hc基因的表达,进而影响乳蛋白的合成。     

奶牛乳腺中4F2hc基因的表达模式及亮氨酸对其表达的调控研究

为了研究4F2hc在奶牛乳腺中的表达模式及调控方式，进一步明确氨基酸在奶牛乳腺上皮细胞中的跨膜转运过程，本研究采用Western blotting和实时荧光定量PCR技术检测了4F2hc在泌乳期和干奶期奶牛乳腺组织中的表达变化；在体外培养的泌乳期奶牛乳腺上皮细胞中添加亮氨酸，采用Western blotting和实时荧光定量PCR技术检测其对奶牛乳腺上皮细胞中4F2hc表达的影响；采用雷帕霉素抑制剂抑制mTOR信号通路，使用Western blotting方法检测mTOR信号抑制后奶牛乳腺上皮细胞中4F2hc表达以及乳蛋白合成的变化。结果显示，在泌乳期的奶牛乳腺组织中4F2hc的mRNA和蛋白表达水平均显著或极显著高于干奶期（P<0.05，P<0.01）；在体外培养的奶牛乳腺上皮细胞中添加亮氨酸可以极显著提高乳腺上皮细胞中4F2hc的mRNA和蛋白质表达水平（P<0.01）；亮氨酸刺激可以激活细胞内的mTOR信号通路（P<0.05），而雷帕霉素处理则可以显著抑制mTOR信号分子的磷酸化并极显著抑制亮氨酸诱导的4F2hc的表达（P<0.05，P<0.01），进而极显著抑制β-Casein的合成（P<0.01）。以上研究结果表明，4F2hc基因的表达与奶牛乳腺的泌乳活性之间呈正相关，亮氨酸可以通过激活mTOR信号通路来调节4F2hc基因的表达，进而影响乳蛋白的合成。     

漏芦乙醇提取物对奶牛乳腺上皮细胞泌乳信号通路的影响

为了探讨漏芦乙醇提取物对奶牛乳腺上皮细胞泌乳信号通路的影响,试验以体外培养的奶牛乳腺上皮细胞为模型,先利用CASY细胞活力分析仪检测漏芦乙醇提取物(质量浓度分别为25,50,100,200,400μg/mL)作用于奶牛乳腺上皮细胞后乳腺上皮细胞的活力和增殖能力,选择添加对细胞生长增殖不受抑制即对细胞无毒性的漏芦乙醇提取物浓度来研究其对奶牛乳腺上皮细胞泌乳信号通路信号分子表达的影响。采用确定浓度的漏芦乙醇提取物处理细胞,然后用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测奶牛乳腺上皮细胞泌乳信号通路关键信号分子信号转导与转录激活因子5(STAT5)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、胆固醇调节元件结合蛋白1(SREBP1)、过氧化物酶增殖体激活受体γ(PPARγ)、丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶1(AKT1)和葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)基因的mRNA表达水平,以及采用Western-blot技术检测奶牛乳腺上皮细胞泌乳信号通路关键信号分子的蛋白质表达水平。结果表明:较高剂量(200,400μg/mL)的漏芦乙醇提取物显著抑制了奶牛乳腺上皮细胞活力及增殖能力(P0.05),因此选择25,50,100μg/mL的漏芦乙醇提取物来研究其对乳腺上皮细胞泌乳信号通路信号分子表达的影响;25,50,100μg/mL的漏芦乙醇提取物可显著提高细胞泌乳信号通路信号分子STAT5、mTOR、SREBP1、AKT1、GLUT1基因的mRNA表达水平(P0.05)及p-STAT5、p-mTOR、SREBP1、p-AKT1、GLUT1蛋白质表达水平(P0.05),但对PPARγ基因的mRNA表达及蛋白质的表达无显著影响(P0.05)。说明漏芦乙醇提取物能通过调节泌乳信号通路关键信号分子的表达,进而促进奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白、乳脂和乳糖的合成。     

胰岛素对奶牛乳腺上皮细胞酪蛋白合成调节机理的研究

本文旨在通过在培养液中添加不同浓度胰岛素(INS),研究其对奶牛乳腺上皮细胞中αs1-酪蛋白(CSN1S1)基因、雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路及Janus激酶-信号传导和转录活化因子(JAK-STAT)信号通路相关基因表达的影响。试验选用中国荷斯坦奶牛的乳腺上皮细胞进行体外培养,在无血清无激素的培养基中分别添加0(对照)、2.5、25.0、250.0、5 000.0ng/mL INS,利用实时荧光定量PCR方法检测CSN1S1基因、mTOR和JAK-STAT信号通路中相关基因表达量。结果表明:与0ng/mL组相比,添加不同浓度的INS后均能提高CSN1S1、短型催乳素受体(S-PRLR)及mTOR信号通路中上游蛋白激酶B(PKB)、mTOR和下游真核翻译起始因子4E结合蛋白1(4E-BP1)基因表达量,并且能够增加JAK-STAT信号通路中Janus激酶2(JAK2)和信号转导和转录激活因子5A(STAT5 A)基因表达量,当INS浓度为25.0ng/mL时各正向调节基因表达量最高。此结果提示,添加外源INS能提高奶牛乳腺上皮细胞CSN1S1基因表达量,其作用机理:一是添加INS后能够促进激素受体基因的表达,进而促进转录的启动;二是促进乳蛋白合成的mTOR和JAK-STAT信号通路中各正向调节基因的表达,进而使CSN1S1等乳蛋白合成基因能高水平表达,为进一步通过翻译水平增加乳蛋白的合成奠定了物质基础。     

生长激素和胰岛素样生长因子Ⅰ对奶牛乳蛋白合成关键激酶及调节因子mRNA表达量的影响

本试验旨在探讨生长激素(GH)和胰岛素样生长因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)对体外培养的奶牛乳腺上皮细胞内调控乳蛋白合成的关键激酶及调节因子mRNA表达量的影响。试验对纯化后的荷斯坦奶牛乳腺上皮细胞进行4种处理,对照组采用无血清生长培养基,试验组在对照组的基础上分别添加GH(100 ng/mL)、IGF-Ⅰ(100 ng/mL)和GH(100 ng/mL)+IGF-Ⅰ(100 ng/mL)。培养24 h后,采用实时定量PCR(RT-qPCR)法测定κ-酪蛋白基因以及调控乳蛋白合成的关键激酶及调节因子的mRNA表达量,并测定生长激素受体(GHR)和胰岛素样生长因子Ⅰ受体(IGF-ⅠR)mRNA表达量。结果表明:体外培养的奶牛乳腺上皮细胞可以表达GHR和IGF-ⅠRmRNA,各试验组均能显著提高κ-酪蛋白(CSN3)mRNA表达量(P<0.05),但未发现GH和IGF-Ⅰ复合存在累积效应;与对照组相比,GH组有提高E74-样转录因子5(ELF5)mRNA表达量的趋势(P<0.10),而IGF-Ⅰ组显著提高了哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和核糖体蛋白S6激酶1(rpS6K1)mRNA表达量(P<0.05),GH+IGF-Ⅰ组未呈现加强作用。结果提示,GH和IGF-Ⅰ可能单独通过影响调控乳蛋白合成的关键激酶及调节因子mRNA表达来调节κ-酪蛋白的合成。     

亮氨酸水平对奶牛乳腺上皮细胞增殖及κ-酪蛋白合成相关基因表达的影响

本试验旨在研究添加不同水平亮氨酸对乳腺上皮细胞体外增殖及κ-酪蛋白(CSN3)合成相关基因表达的影响。选用中国荷斯坦奶牛乳腺上皮细胞进行体外培养,以不含有亮氨酸的培养基为对照组(0×组),试验组培养基分别添加0.112 5(0.25×组)、0.225 0(0.5×组)、0.450 0(1×组)、0.900 0(2×组)、1.800 0(4×组)、3.600 0(8×组)、7.200 0(16×组)、14.400 0 mmol/L(32×组)的亮氨酸。试验采用噻唑蓝(MTT)比色法检测奶牛乳腺上皮细胞增殖;运用实时定量PCR检测CSN3合成相关基因相对表达量。结果表明:亮氨酸能够提高乳腺上皮细胞的相对增殖率。24和48 h时,除0.25×组外,其余各组与对照组相比细胞均差异均显著(P0.05);72 h时,各组与对照组相比差异均显著(P0.05);其中2×组的促增殖作用都达到最强。亮氨酸能够促进哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(m TOR)、核糖体蛋白S6激酶1(S6K1)、蛋白质酪氨酸激酶2(JAK2)、转录激活因子5(STAT5)和CSN3基因的表达,抑制真核细胞翻译启动因子4E结合蛋白1(4EBP1)基因的表达,其中2×组对m TOR、S6K1、JAK2、STAT5和CSN3基因的上调表达最强,而对4EBP1基因的下调表达最强。总之,添加亮氨酸能够促进奶牛乳腺上皮细胞增殖和CSN3合成相关基因(除4EBP1)表达,亮氨酸水平为0.900 0 mmol/L时,其促进作用均达到最大。     

亮氨酸对猪乳腺上皮细胞营养转运的影响及调控机制

本试验采用猪乳腺上皮细胞作为体外模型探讨亮氨酸对乳成分合成的影响及其分子机制。分别用0（对照组）、1、5和10 mmol/L的亮氨酸处理猪乳腺上皮细胞24和48 h后,检测细胞活力,分析乳蛋白、氨基酸转运载体、葡萄糖转运载体及脂肪酸转运载体的基因表达情况,并进一步检测哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路中关键蛋白mTOR和核糖体蛋白S6激酶1(S6K1)的表达和磷酸化情况以期探索体外亮氨酸调控乳成分合成的机制。结果显示：不同浓度亮氨酸处理48 h后细胞活力均较对照组显著提高（P <0.05）,且以亮氨酸浓度为1 mmol/L时细胞活力最高。与对照组相比,1 mmol/L组的αs2-酪蛋白（CSN1S2）和κ-酪蛋白（CSN3）mRNA相对表达量显著提高（P<0.05）,5 mmol/L组的CSN1S2 mRNA相对表达量显著提高（P<0.05）。与对照组相比,氨基酸转运体溶质载体家族1成员4(SLC1A4)、溶质载体家族7成员11(SLC7A11)、溶质载体家族7成员5(LAT1)、溶质载体家族7成员7(SLC7A7)和脂肪酸转运蛋白1(FATP1)的mRNA相...     

不同浓度胰岛素样生长因子-Ⅰ对体外培养奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白和脂肪合成相关基因表达的影响

应用Real-time PCR方法检测不同浓度(0、1、10和100 ng/mL)胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)处理后的体外培养奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白和脂肪合成相关基因mRNA的相对表达量。结果表明,添加不同浓度IGF-Ⅰ对体外培养的奶牛乳腺上皮细胞IGF-Ⅰ受体基因(IGFIR)、IGF-Ⅰ结合蛋白-3基因(IGFBP3)、α-s1-酪蛋白基因(CSN1S1)和κ-酪蛋白基因(CSN3)mRNA的相对表达丰度均无显著影响(P>0.05)。随着IGF-Ⅰ添加浓度的增加,β-酪蛋白基因(CSN2)、乙酰辅酶A羧化酶基因(ACACA)、脂肪酸合成酶基因(FASN)和脂肪酸结合蛋白-3基因(FABP3)mRNA的相对表达丰度显著上调(P<0.05)。提示,IGF-Ⅰ作为一种重要细胞因子参与调节乳腺上皮细胞乳蛋白和乳脂肪相关基因mRNA的表达。     

不同氨基酸模式对奶牛乳腺上皮细胞酪蛋白合成的影响

本试验旨在验证氨基酸模式的不同是否会影响奶牛乳腺上皮细胞酪蛋白的合成。采用完全随机试验设计设置4个组,分别为低蛋白质饲粮条件下血液氨基酸模式组(LPBP)、全乳蛋白氨基酸模式组(MP)、80%酪蛋白+20%乳清蛋白氨基酸模式组(CLP)、酪蛋白氨基酸模式组(CP),每组3个重复,并重复试验3次。分别用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和酶联免疫吸附法(ELISA)检测乳蛋白合成基因αs1-酪蛋白(CSN1S1)和κ-酪蛋白(CSN3)mRNA表达量及αs-酪蛋白合成量。结果表明:氨基酸模式能够显著影响CSN1S1和CSN3基因mRNA表达量(P<0.05)。MP组CSN1S1和CSN3基因mRNA表达量分别显著和极显著高于LPBP组(P<0.05和P<0.01);相对于LPBP组,MP组CSN1S1和CSN3基因mRNA表达量分别上调了1.70和2.12倍。MP组αs-酪蛋白合成量显著高于CLP、CP组(P<0.05),极显著高于LPBP组(P<0.01)。由此可见,氨基酸模式的不同能够影响奶牛乳腺上皮细胞酪蛋白的合成,全乳蛋白氨基酸模式可能是一种较为理想的氨基酸模式。     

精氨酸对奶牛乳腺上皮细胞酪蛋白合成的影响

本研究以奶牛乳腺上皮细胞（BMECs）为模型,研究添加不同浓度精氨酸对BMECs酪蛋白合成的影响。采用单因素完全随机试验设计,以0.70 mmol/L精氨酸（DMEM培养基中精氨酸的浓度）为对照组,试验组精氨酸的浓度分别为1.40、2.80、5.60和11.20 mmol/L,每组6个重复。采用MTT法检测BMECs的增殖率;利用酶联免疫吸附法（ELISA）试剂盒检测BMECs中精氨酸代谢关键酶活性;通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术检测BMECs中精氨酸代谢关键酶、酪蛋白以及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路基因的相对表达量;运用蛋白质免疫印迹（Western Blot）技术检测酪蛋白表达量及mTOR信号通路蛋白磷酸化水平。结果表明：1）当精氨酸的浓度为2.80 mmol/L时,BMECs的增殖率显著高于对照组和其他精氨酸组（P<0.05）;当精氨酸的浓度为2.80和5.60 mmol/L时,BMECs中鸟氨酸脱羧酶活性显著高于对照组和其他精氨酸组（P<0.05）。2) 2.80 mmol/L精氨酸组BMECs中αs1-酪蛋白、к-酪蛋白、蛋白激酶B、m...     

金黄色葡萄球菌对奶牛乳腺上皮细胞Wnt/β-catenin信号通路和相关修复因子的影响

采用金黄色葡萄球菌侵袭原代奶牛乳腺上皮细胞,观察该病原菌对乳腺上皮细胞Wnt/β-catenin信号通路关键蛋白和相关修复因子EGFR、TGF-β3和VEGF基因mRNA表达的影响。金黄色葡萄球菌以MOI=1∶1的比例接种奶牛乳腺上皮细胞,分别作用0,15,30,45,60,120,240 min,采用Western blot法检测乳腺上皮细胞β-catenin、Cyclin D1及c-Myc蛋白表达水平;免疫荧光法检测β-catenin的表达及核易位;荧光定量PCR检测EGFR、TGF-β3和VEGF基因mRNA表达。结果显示,β-catenin蛋白在45,60,120 min表达量升高,与0 min相比差异显著(P<0.05);Cyclin D1蛋白在45,60,120和240 min表达量升高,差异显著或极显著(P<0.05或P<0.01);c-Myc蛋白在15,30,60,120,240 min表达量升高,差异极显著(P<0.01)。修复相关因子EGFR、TGF-β3和VEGF基因mRNA的表达量在30 min均出现极显著升高(P<0.01),且VEGF基因mRNA在45,60,120和240 min均呈现极显著升高(P<0.01),EGFR基因mRNA表达量在30,45和60 min时表达量极显著升高(P<0.01)。结果表明,金黄色葡萄球菌侵袭奶牛乳腺上皮细胞后,诱导Wnt/β-catenin信号通路的转导和修复因子EGFR、TGF-β3和VEGF基因转录,该信号通路和修复因子可能参与金黄色葡萄球菌导致的炎症和细胞损伤的修复过程。     

牛乳腺上皮细胞SNAT2对氨基酸调节乳合成的影响

试验旨在研究氨基酸转运体钠离子依赖的中性氨基酸转运蛋白（the sodium-dependent neutral amino acid transporter 2,SNAT2）在牛乳腺上皮细胞（bovine mammary epithelial cell,BMEC）中对氨基酸调节乳合成的影响。利用组织块法成功培养原代BMEC,添加不同氨基酸（蛋氨酸（Met）、赖氨酸（Lys）和亮氨酸（Leu）刺激BMEC后,通过实时荧光定量PCR、Western blotting技术和甘油三酯试剂盒检测SNAT2、酪蛋白（β-casein）基因的表达量和BMEC培养液上清甘油三酯的分泌量;将N-flag-SNAT2真核表达载体及SNAT2 siRNA分别转入细胞中进行SNAT2基因的过表达和敲低试验;通过Western blotting和甘油三酯试剂盒分别检测SNAT2、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（the mammalian target of rapamycin,mTOR）、β-casein蛋白表达量和BMEC培养液上清的甘油三酯含量。结果显示,3种氨基酸（Met、Lys、Leu）均能显著促进BMEC分泌乳蛋白和乳脂,并激活mTOR信号途径,其中Met、Lys还能够显著上调SNAT2基因表达;SNAT2能够正向调节BMEC乳蛋白和乳脂肪的合成,并激活mTOR信号通路,说明氨基酸激活mTOR信号通路是通过SNAT2基因介导完成的,进而调节了BMEC乳蛋白和乳脂肪合成。     

牛乳腺上皮细胞SNAT2对氨基酸调节乳合成的影响

试验旨在研究氨基酸转运体钠离子依赖的中性氨基酸转运蛋白(the sodium-dependent neutral amino acid transporter 2,SNAT2)在牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cell,BMEC)中对氨基酸调节乳合成的影响。利用组织块法成功培养原代BMEC,添加不同氨基酸(蛋氨酸(Met)、赖氨酸(Lys)和亮氨酸(Leu)刺激BMEC后,通过实时荧光定量PCR、Western blotting技术和甘油三酯试剂盒检测SNAT2、酪蛋白(β-casein)基因的表达量和BMEC培养液上清甘油三酯的分泌量;将N-flag-SNAT2真核表达载体及SNAT2siRNA分别转入细胞中进行SNAT2基因的过表达和敲低试验;通过Western blotting和甘油三酯试剂盒分别检测SNAT2、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(the mammalian target of rapamycin,mTOR)、β-casein蛋白表达量和BMEC培养液上清的甘油三酯含量。结果显示,3种氨基酸(Met、Lys、Leu)均能显著促进BMEC分泌乳蛋白和乳脂,并激活mTOR信号途径,其中Met、Lys还能够显著上调SNAT2基因表达;SNAT2能够正向调节BMEC乳蛋白和乳脂肪的合成,并激活mTOR信号通路,说明氨基酸激活mTOR信号通路是通过SNAT2基因介导完成的,进而调节了BMEC乳蛋白和乳脂肪合成。     

组氨酸对体外培养奶牛乳腺上皮细胞β-酪蛋白及酪氨酸激酶2-信号转导与转录激活子5/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路相关磷酸化蛋白表达的影响

本试验旨在研究不同浓度的组氨酸对体外培养奶牛乳腺上皮细胞β-酪蛋白及酪氨酸激酶2(JAK2)-信号转导与转录激活子5(STAT5)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(m TOR)信号通路相关磷酸化蛋白表达的影响。将原代奶牛乳腺上皮细胞进行体外培养,分为对照组和7个试验组,采用无必需氨基酸的培养基,对照组不添加组氨酸,试验组是在对照组基础上分别添加0.15、0.60、1.20、2.40、4.80、9.60、19.20 mmol/L的组氨酸。采用噻唑蓝比色法检测原代奶牛乳腺上皮细胞12 h增殖情况;运用蛋白质免疫印迹检测β-酪蛋白和8个信号通路相关磷酸化蛋白表达。结果表明:1)当组氨酸浓度为0.15~9.60 mmol/L时,与对照组相比,奶牛乳腺上皮细胞数量均增加。2)β-酪蛋白表达量随组氨酸浓度的增加出现先升高后降低的趋势,但试验组均极显著高于对照组(P0.01)。3)与对照组相比,组氨酸的添加可极显著促进各信号通路相关磷酸化蛋白的表达(P0.01);试验组中,随着组氨酸浓度的升高,磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白[P-m TOR(Ser2481)]和磷酸化真核细胞翻译延伸因子2[P-e EF2(Thr56)]蛋白的表达量下降,而磷酸化核糖体S6蛋白激酶1[P-S6K1(Thr389)]的蛋白表达增加;当组氨酸浓度为2.40 mmol/L时,磷酸化酪氨酸激酶2[P-JAK2(Tyr1007/1008)]、磷酸化真核细胞始动因子4E结合蛋白1[P-4EBP1(Thr37)]和磷酸化真核细胞起始因子2α[P-e IF2α(Ser51)]蛋白的表达量最高,磷酸化信号转导与转录激活子5[P-STAT5(Tyr694)]、磷酸化m TOR调控蛋白[P-raptor(Ser863)]和m TOR复合物1中的绑定蛋白(GβL)蛋白在组氨酸浓度为9.60 mmol/L时表达量最高。综合可知,组氨酸的添加可通过促进JAK2-STAT5信号通路中P-JAK2(Tyr1007/1008)和PSTAT5(Tyr694)蛋白的表达来进而调控β-酪蛋白表达。最适浓度(0.15~9.60 mmol/L)范围内的组氨酸还可通过m TORC1的P-raptor(Ser863)蛋白作用于下游靶点P-4EBP1(Thr37)来促进β-酪蛋白表达,最终调控乳蛋白合成。     

与脐带间充质干细胞共培养对奶牛乳腺上皮细胞乳脂合成及关键基因表达的影响

探究与脐带间充质干细胞共培养对奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)乳脂合成及关键基因表达的影响。将脐带间充质干细胞和乳腺上皮细胞利用Transwell小室双层共培养,BMECs单纯培养为对照组,IGF-ⅠR抑制剂AG1024处理细胞,检测上清IGF-Ⅰ、甘油三酯(TAG)含量变化,再用磷脂酰肌醇-3-羟激酶(PI3K)信号阻断剂LY294002孵育细胞,RT-qPCR检测乙酰辅酶A羧化酶(ACACA)、脂肪酸合成酶(FASN)和固醇调节元件结合蛋白(sterol regulatory element.binding proteins,SREBP1)基因的相对表达丰度。结果显示,共培养后BMECs的IGF-I含量极显著升高(P0.01),TAG含量显著升高(P0.05);加入AG1024后,IGF-I明显受到抑制(P0.01),显著降低了各组TAG含量及各基因的表达丰度(P0.05);LY294002抑制了PI3K(P0.01)、AKT、mTOR(P0.05)mRNA的表达,显著降低了TAG含量及ACACA、FASN、SREBP1mRNA的表达(P0.05);共同处理后极显著降低了TAG合成量及各基因相对表达丰度(P0.01)。结果表明,脐带间充质干细胞能够通过IGF-Ⅰ介导PI3K/Akt/mTOR信号通路上调BMECs乳脂合成关键基因的表达丰度,促进TAG的合成。     

大肠杆菌对奶牛子宫内膜上皮细胞NF-κB信号通路的影响

本试验旨在探究大肠杆菌对奶牛子宫内膜上皮细胞NF-κB信号通路的影响。选取10~6CFU/mL大肠杆菌处理奶牛子宫内膜上皮细胞,检测NF-κB通路关键蛋白表达的变化。结果发现,大肠杆菌(10~6CFU/mL)刺激一定时间可显著提高p-P65蛋白和p-IκB-α蛋白表达量,促进NF-κB信号通路的激活,引起奶牛子宫内膜炎性反应或免疫应答。     

催乳素通过酪氨酸激酶2/信号传导及转录激活蛋白5信号通路促进奶牛乳腺上皮细胞乳铁蛋白合成和分泌

本试验旨在研究催乳素（PRL）对奶牛乳腺上皮细胞（BMECs）中酪氨酸激酶2/信号传导及转录激活蛋白5(JAK2/STAT5)信号通路介导的乳铁蛋白（LF）合成和分泌的影响。添加不同浓度的PRL[0（对照）、10、100、1 000 ng/mL]处理BMECs 24 h,分析PRL对LF含量和LF、催乳素受体（PRLR）以及JAK2/STAT5信号通路基因表达量和相关蛋白表达的影响。为了验证STAT5在PRL促进BMECs LF合成和分泌的关键作用,添加STAT5抑制剂匹莫齐特（Pimozide）[未添加Pimozide（对照）、10μmol/L Pimozide、100 ng/mL PRL、10μmol/L Pimozide+100 ng/mL PRL]处理BMECs 24 h,测定PRL和Pimozide对LF含量和LF、JAK2/STAT5信号通路基因表达量和相关蛋白表达以及相对荧光强度的影响。结果表明：1）与对照组相比,10、100、1 000 ng/mL PRL能够显著或极显著提高BMECs上清液中的LF含量（P<0.05或P<0.01）;Pimozide组能够极...     

蛋氨酸三肽对奶牛乳腺上皮细胞酪蛋白和小肽转运载体基因表达量的影响

本试验旨在研究蛋氨酸三肽(Met-Met-Met)对奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)酪蛋白和小肽转运载体基因表达量的影响。采用酶消化法培养的第3代奶牛乳腺上皮细胞为模型,各处理在培养基中分别添加0(对照)、40、50、60、70和80μg/mL的蛋氨酸三肽,每个处理5个重复,每个重复1个培养孔,分别培养细胞24、48和72h,检测奶牛乳腺上皮细胞的相对增殖率,整体试验重复2次,确定最佳培养时间;各处理在培养基中分别添加0(对照)、40、50、60、70和80μg/mL的蛋氨酸三肽,每个处理3个重复,每个重复1个培养孔,以最佳培养时间培养,用实时定量PCR法检测酪蛋白基因的表达量,确定适宜蛋氨酸三肽浓度,整体试验重复3次;以最佳培养时间和适宜蛋氨酸三肽浓度培养细胞,以未添加蛋氨酸三肽的培养基为对照,每个处理3个重复,每个重复1个培养孔,测定小肽转运载体基因的表达量,整体试验重复3次。结果表明:在培养基中添加蛋氨酸三肽培养奶牛乳腺上皮细胞24h时,相对增殖率最高;培养基中加入60μg/mL的蛋氨酸三肽培养细胞24h,αs1-酪蛋白和β-酪蛋白的基因表达量最高,同时发现奶牛乳腺上皮细胞中小肽转运载体1和小肽转运载体2基因表达量显著高于对照处理(P0.05)。综上所述,培养基中添加60μg/mL的蛋氨酸三肽能够提高奶牛乳腺上皮细胞酪蛋白和肽转运载体基因的表达量。