应用复合RT-PCR同时检测烟草环斑病毒和番茄环斑病毒

将烟草环斑病毒(Tobacco ringspot virus)和番茄环斑病毒(Tom ato ringspot virus)的CP基因及RNA2基因序列引物,合成特异性RT-PCR检测引物,对烟草环斑病毒和番茄环斑病毒的感病植物组织进行了PCR扩增反应,结果显示,感染了烟草环斑病毒和番茄环斑病毒的植物组织的PCR产物均出现600 bp和470 bp特异性扩增条带,而其他病毒均未出现扩增条带,证明这两对引物具有烟草环斑病毒和番茄环斑病毒的鉴定特异性。将提取的烟草环斑病毒和番茄环斑病毒总RNA做梯度稀释,测定该检测体系的敏感度,结果显示,此体系最低可检出烟草环斑病毒和番茄环斑病毒提取的RNA模板浓度为234 pg/μl和264 pg/μl。表明,复合RT-PCR是一种可同时检测烟草环斑病毒和番茄环斑病毒的快速检测方法。     

RT-PCR检测齿兰环斑病毒技术的建立

根据已报道的齿兰环斑病毒(ORSV)外壳蛋白(CP)基因序列,进行同源性比较,设计了一对各为20bp的引物.通过优化试验条件,建立了稳定的RT-PCR检测ORSV体系,其检测灵敏度可达0.01ng·mL-1.将此方法与ELISA进行比较,结果表明,RT-PCR检测灵敏度比ELISA高1000倍.应用这两种方法同时检测了138瓶兰花组培苗样品,其中RT-PCR检测出32瓶兰花组培苗感染病毒,而ELISA只能检测其中的18瓶.     

烟草环斑病毒RT-PCR检测体系的优化

烟草环斑病毒(Tobacco ringspot virus,TRSV)是豇豆花叶病毒科(Comoviridae)线虫传多面体病毒属(Nepovirus)的代表种,是我国公布的二类进境检疫有害生物.建立特异性强、灵敏性高的检测体系是有效控制TRSV传播的技术保障.本研究在分析引物的特异性、优化退火温度及dNTPs、引物、...     

一步法RT-PCR检测烟草环斑病毒试剂盒的研制与应用

根据烟草环斑病毒基因组序列设计特异性引物,利用RT-PCR技术研制成一步法检测该病毒的试剂盒,并建立了操作程序。对试剂盒扩增到的预期产物进行测序验证,产物序列与目的序列间的同源性为97.8%,表明该试剂盒的准确性较高。试验结果还表明,该试剂盒在常温、4℃和-20℃下可分别保存2d、7d和60d;灵敏度是DAS-ELISA的100倍;质量控制试验结果一致,具有较高的重复性。     

RT-PCR方法检测烟草环斑病毒的研究

 根据烟草环斑病毒（TRSV）外壳蛋白基因非编序列设计的引物P1,P2,用感病及健康组织总RNA为模板,进行cDNA 合成和PCR试验,感病组织中扩增出了600 bp的目的片段,而健康组织中无此扩增带。摸索各项实验条件,建立了RT-PCR检测烟草环斑病毒（TRSV）的方法。     

桃树李坏死环斑病毒的RT-PCR检测方法研究

以桃树叶片为材料提取总RNA,根据PNRSV外壳蛋白基因设计引物,进行RT和PCR扩增,获得良好结果,对目的片段经过克隆测序,与NCBI中报道的PNRSV外壳蛋白基因序列同源性最高达98%。在建立的RT-PCR技术基础上,对RT-PCR体系中的主要影响因子进行了优化研究。     

烟草环斑病毒的RT-PCR和IC-RT-PCR检测方法研究

根据TRSV CP基因的保守序列设计引物,RT-PCR和IC-RT-PCR能从TRSV的2个分离物中分别扩增到与预期大小相同的DNA条带,序列测定和分析表明所扩增序列为TRSV CP基因的部分序列,在系统关系树上与TRSV的其他分离物形成一簇,表明所建立的RT-PCR和IC-RT-PCR检测方法是可靠的。     

番茄环斑病毒的普通RT-PCR和巢式PCR检测方法

根据番茄环斑病毒（ToRSV）外壳蛋白（CP）基因的保守序列设计了2对引物（引物对Ⅰ和Ⅱ）,利用RT—PCR分别扩增出预期大小的800bp和580bp的条带,其中引物对Ⅱ扩增效率较高、特异性较好。以引物对Ⅰ和Ⅱ进行2轮PCR扩增,建立了巢式PCR检测方法,其灵敏度比普通RT-PCR提高100～200倍。序列测定和分析表明所测定的序列为ToRSVCP基因的部分序列,在系统关系树上与ToRSV的其他分离物形成一簇,亲缘关系很近。     

李属坏死环斑病毒（PNRSV）RT-LAMP检测方法的建立

针对李属坏死环斑病毒（PNRSV）外壳蛋白（CP）基因保守序列,设计了1套特异性识别CP基因中6个不同区段的环介导等温扩增（LAMP）引物。通过对反应条件的优化,建立了适用于PNRSV的RT-LAMP检测技术,对优化后的方法进行特异性、灵敏度评价。结果显示,此方法能够特异性的检测出PNRSV,对马铃薯X病毒（PVX）、马铃薯Y病毒（PVY）、黄瓜花叶病毒（CMV）、蚕豆萎蔫病毒（BBWV）的检测均为阴性,灵敏度高于RT-PCR 10倍。     

应用分子生物学方法快速检测烟草环斑病毒

根据烟草环斑病毒(tobacco ringspot virus)CP基因序列,设计并合成了特异性RT-PCR扩增引物,对烟草环斑病毒和非烟草环斑病毒的感病植物组织样本进行了PCR扩增反应。结果,烟草环斑病毒的感病植物组织样本的PCR产物均出现1 760 bp的特异性扩增条带,而非感病植株组织样本均未出现扩增条带,证明该合成引物具有烟草环斑病毒鉴定特异性。将提取的烟草环斑病毒总RNA做梯度稀释,测定该检测体系的敏感度,结果可检出烟草环斑病毒RNA模板最低浓度为234 pg/μl。研究表明,分子生物学测定具有特异性强、灵敏度高、快速准确的特点,可应用于烟草环斑病毒检疫的快速检测。     

PNRSV RT-PCR检测体系的建立与应用

以指示植物GF305和田间果树为试材,建立并优化了特异性强、灵敏度高、成本低的李属坏死环斑病毒(PNRSV)RT-PCR检测体系,使用该优化体系对樱桃树、桃树和杏树中携带PNRSV的情况进行了调查。结果表明,被检材料的李属坏死环斑病毒(PNRSV)感染率均较高,但程度不同。     

猪血凝性脑脊髓炎病毒RT-PCR方法的建立及初步应用

为了建立快速检测猪血凝性脑脊髓炎病毒(HEV)的RT-PCR方法,根据GenBank中HEV的HE基因和S基因设计了1对引物,在优化RT-PCR反应条件的基础上,成功的扩增出323bp的特异性条带。检测与HEV亲缘性较高的牛冠状病毒及猪的伪狂犬病毒均为阴性,最低可以检测到10个TCID50/100μl的病毒,说明该方法的有较好的特异性和敏感性。用此RT-PCR方法对感染HEV的小鼠和猪进行检测,结果能从发病动物的多种组织中检测到病原,其中以脑组织的检出率最高。因此,临床疑似病例检测时以脑组织为最佳检测样本。     

应用RT-PCR技术快速检测鉴定猪瘟病毒

根据所有已报道的猪瘟病毒株（HCV）和牛病毒性腹泻病毒株（BVDV）的序列设计了3条引物Pa,Pb,Pc。应用RT-PCR技术，引物对Pa/Pb从猪瘟HCLV株，猪瘟Thiveral株，3株猪瘟野毒株都扩增出了预期185bp的片断，Pa/Pc从BVDVOregonC24V株中也扩增出了240bp的片断，而Pa/Pb与牛睾九原代细胞，PK-15细胞，BVDVOregonC24V株均无反应，Pa/Pc也不与所试验的5株猪瘟毒株反应。采用多重PCR可以从同时含有HCV和BVDV核酸的样品中扩增出各自的特异性条带。针对猪瘟兔化弱毒疫苗株（HCLV）的特异性插入序列。设计了引物Pr,Pra,Prb，可以从HCLV细胞毒或用HCLV人工感染的兔脾组织毒中扩增出预期200bp的片断，而Pr,Pra,Prb与猪瘟Thiveral株和3株猪瘟野毒株均不反应，通过含毒量梯度试验，得出了RT-PCR可检测猪瘟病毒量的下限为200RID或200TCID50。     

牛病毒性腹泻/黏膜病RT-PCR 3种体系的试验研究

根据牛病毒性腹泻/黏膜病病毒5′端非结构蛋白基因序列,设计合成1对特异性引物,建立检测牛病毒性腹泻/黏膜病病毒244 bp片段的RT-PCR 3种体系。该3种体系对牛病毒性腹泻/黏膜病病毒NADL、Oregon C24V和长春184毒株各标准毒株的检测结果均为阳性。对标准毒株的细胞毒进行检测,其敏感度达0.1 TCID50;而对牛传染性鼻气管炎病毒、猪瘟病毒、牛轮状病毒和牛冠状病毒的细胞培养物进行检测,结果均为阴性。证明3种体系方法特异性强,敏感性高。初步结果表明所建立的RT-PCR技术3种体系可用于牛病毒性腹泻/黏膜病的检测及流行病学调查。     

改良RNA提取法及樱桃PDV和PNRSV的RT-PCR检测

介绍了一种从木本植物组织中获得高质量RNA的快速、简单和高效的核酸提取方法。该方法是基于核酸的二氧化硅捕获,避免了使用苯酚、氯仿等有机溶剂。利用该方法从樱桃组织中提取的总RNA用RT-PCR技术检测PDV,PNRSV均获得成功。从感病植株的一年生枝的叶片、韧皮部及芽组织中扩增出了预期的目的片段,即172和449bp,而健康组织中无此扩增带。该法提取的总RNA用于RT-PCR技术检测,其敏感性至少与商业出售的QiagenRNeasy提取试剂盒相当,但简单经济。     

RT- PCR检测鸡传染性支气管炎病毒方法的建立

根据Genbank中鸡传染性支气管炎病毒(IBV)核蛋白(NP)基因序列,设计了1对引物,通过鸡胚繁殖IBV,纯化鸡胚尿囊液中的IBV,提取病毒RNA,建立了检测传染性支气管炎病毒的RT-PCR方法。对IBV各毒株(M41,H52,H120,Aust-T以及野毒株等)检测,结果均为阳性,而对鸡的其他病毒性疾病病毒(IBDV,AIV,NDV)进行检测,结果均为阴性。初步结果表明所建立的RT-PCR技术可用于鸡传染性支气管炎病毒各血清型毒株的检测。     

RT-PCR检测菊花B病毒的研究

根据菊花B病毒（CVB）的外壳蛋白基因序列设计、合成引物,以感病组织5和健康组织总RNA为模板,进行cDNA合成和PCR扩增,结果从感病组织中扩增出与预期的776bp大小一致的目标片段,而健康组织无此扩增产物;将PCR产物插入pGEM-T载体克隆并测序,序列分析表明与CVB的相应序列同源性达到85％;将感病组织总RNA以10x梯度稀释成不同浓度,测出RT－PCR检测CVB的灵敏度为10^-4x;PCR产物克隆作为RT－PCR反应的阳性对照,解决了毒源保存和传播的问题,从而建立了CVB快速、灵敏、准确的RT－PCR鉴定和检测技术。     

桃树苹果花叶病(APMV)的RT-PCR检测

本试验比较了4种桃叶片RNA提取方法,建立了RT-PCR桃苹果花叶病检测体系.结果表明:凯基TRIzol试剂法简便快捷,提取的RNA质量较好,可用于RT-PCR.RT-PCR最适反应体系为MgCl2 1.5 mmol/L,引物0.5 μmol/L,模板1.0 μg/50 μl,退火温度为43.5 ℃.采集桃主产区北京、陕西、山东、河北、河南、新疆以及江苏的徐州、无锡、南京等地带叶芽的桃枝样品作为试材,利用RT-CR进行苹果花叶病检测.结果显示,在河北重阳红、山东春雪、无锡朝晖、新疆2号、新疆3号、新疆5号、徐州朝晖发现苹果花叶病毒(APMV).     

PT-PCR方法在实验小鼠肝炎病毒检测中的应用

实验应用RT-PCR方法对来自不同单位、6个品系、不同等级的84只小鼠进行了MHV检测.结果显示:MHV阳性小鼠35只,阳性率为41.67%;其中普通级小鼠29只,阳性18只,阳性率为62.07%;SPF级小鼠55只,MHV阳性小鼠17只,阳性率为30.91%.