用分子生物学方法鉴定布氏杆菌

应用细菌DNAG CM01％和DNA—DNA分子杂交分类鉴定技术,对两株难以判定的可疑布氏杆菌进行了DNA同源性测定.结合这两株菌形态特征.确定为布氏杆菌.解决了病畜的诊断问题。     

制品生产用及地方疑难布氏菌DNA基因同源性的研究

本文以布氏菌19株国际标准菌种为对照,对国内外实验室参考菌种14株及地方疑难菌种11株结合常规方法进行了DNA G+Cmol％测定,同时以羊种菌M16 DNA为标准,与布氏菌所有种和型的24个代表株及8株地方疑难菌种进行了DNA-DNA杂交测定,布氏菌及地方疑难菌种的G+Cmol％值范围为54.1～59.3,M16株与布氏菌参考菌种的杂交率81.7～109％,与地方疑难菌种的杂交率除一株为72.1外,其余为84.2～109％,属高度同源,鉴定为布氏菌。本试验首次使用进口新仪器“PEKIN LAMBDA 17UV/Vis SPECTROPHOTOMETER”采用热变性法测DNA G+Cmol％,复性速率法进行DNA-DNA杂交,使杂交的DNA样品变性和复性在同一比色杯中进行,省去半导体点温计操作带来的麻烦,减小了实验误差,缩短测时,结果精确、操作简便、重复性好。     

犬种布氏菌地方株的DNA中G Cmol%测定

首次利用热变性法对9株地方犬种布氏菌DNA的G C含量进行了测定,同时以2株国际标准株为对照。G C mol％值在56.6～58.4范围内,与文献报道的犬种布氏菌和我们所用的2株标准株所得的G C mol％值是一致的。各株菌经常规检定、噬菌体裂解试验、血清学检查所得的结果均符合于犬种布氏菌的特性。说明本试验测定的G C mol％值代表了犬种布氏菌的DNA分子结构比值。为我国地方菌种、特别是粗糙型布氏菌的检定提供了一个新的方法。此外,对传统的DNA提取法进行了改进,使之更便于本试验的要求。     

应用细菌DNA同源性鉴定布鲁氏菌

应用细菌 DNA 的 G C Mo1%和 DNA-DNA 分子杂交分类鉴定技术对7株待鉴定菌进行了 DNA 同源性测定,确定7株送检菌为布鲁氏菌。     

巢式PCR检测乳中布氏杆菌

本研究建立了检测乳中布氏杆菌omp22基因的巢式PCR方法,经过反复操作验证该检测方法有较好的重复性和稳定性。对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、棒状杆菌、绿脓杆菌等羊常见菌及羊基因组检测阴性,表明此方法有很好的特异性。该方法有较强的敏感性,羊乳中布氏杆菌的检测灵敏度可达到40CFU/mL乳汁。     

用热变性温度法测定禽霉形体DNA的G+C含量

提取5个禽霉形体国际模式株和15株火鸡源霉形体的DNA,利用热变性温度法(thermal denaturation temperature)测定这些DNA样品的G-C碱基对克分子百分含量。全部样品的T_m值分布于80.8—84.0℃,相应的G+C含量为26.3—34.1mol%。国际模式株的测定结果与文献报道相符,15株新分离霉形体的试验结果与生物化学以及血清学鉴定结果一致。本文还讨论了一些影响G+C含量测定值的一些因素。     

鸭源鸡杆菌双重PCR检测方法的初步建立

为建立鸭源鸡杆菌(G.anatis)双重PCR检测方法,并对鸡杆菌分离株进行种类鉴定,本研究根据GenBank中G.anatis12656-12株的gtxA基因序列设计一对PCR引物,合成扩增rpoB基因的引物作为内参基因,建立了G.anatis双重PCR检测方法.检测结果显示:以G.anatis Yu-PDS-RZ-1-SLG株DNA为模板进行的双重PCR检测能够扩增出两条目的片段;其它16株细菌包括副鸡禽杆菌、多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、福氏志贺菌和奇异变形杆菌均只扩增出了一条目的片段;该方法可以检测到浓度为6.5×102 cfu/mL的G.anatis;34株鸡杆菌分离株均扩增出了两条预期大小的目的片段.此外,序列分析结果表明,10株鸡杆菌河南分离株的rpoB基因序列与鸭源鸡杆菌种参考株(CCUG15563)的同源性最高(97.5％～99.0％),属于鸭源鸡杆菌种.本研究建立的G.anatis双重PCR检测方法,可用于含gtxA基因鸡杆菌菌株的鉴定及临床病原学诊断.     

猪布氏菌病血清学交叉反应的初步研究

布氏菌与多种微生物发生血清学交叉反应早已为人们所关注。自1926年Francis 等报道布氏菌和土拉伦氏菌在血清学方面存在交叉反应之后,许多国家的研究者们又相继发现了巴氏杆菌、沙门氏菌、霍乱弧菌、大肠杆菌和耶尔森氏菌(简称耶氏菌)等微生物与布氏菌的交叉反应。布氏菌同这些微生物的交叉反应不仅涉及光滑型布氏菌,也包括非光滑型菌,如:犬型布氏菌与多杀性巴氏     

大肠杆菌和绿脓杆菌混合感染引起的水貂出血性肺炎的鉴定

为了鉴定引起水貂发生出血性肺炎的病原体,试验采用病原分离鉴定、分离株16S rRNA扩增与序列分析、分离株对小鼠致病力试验、分离株血清分型鉴定、大肠杆菌H基因型鉴定、分离株药敏试验和分离株动物感染试验对来自山东省、辽宁省、河北省和黑龙江省的28份具有典型出血性肺炎症状死亡水貂的病料进行鉴定。结果表明:混合感染12例,单一病原菌感染16例,镜检可见短小的阴性杆菌和两端钝圆的阴性长杆菌; 16S rRNA扩增与序列分析共分离出22株绿脓杆菌和18株大肠杆菌,其中有4株对小鼠致死率达到50%以上,9株对小鼠致死率在10%～40%;从22株绿脓杆菌中共分离出8株G型、7株E型和7株D型,未检测出大肠杆菌血清型,大肠杆菌H基因型为H11;绿脓杆菌分离株对环丙沙星、妥布霉素、阿米卡星等6种药物敏感,大肠杆菌分离株对环丙沙星、妥布霉素、阿米卡星等10种药物均耐药;大肠杆菌和绿脓杆菌分离株均可导致水貂死亡并造成肺泡壁毛细血管瘀血、脾脏淋巴细胞数量减少、肺脏上皮细胞坏死、红髓内巨噬细胞数量增多等明显病理变化。说明目前引起水貂出血性肺炎的病原体已由传统的绿脓杆菌单一感染逐渐转变为大肠杆菌和绿脓杆菌的混合感染。     

光滑型布鲁氏菌LPS单克隆抗体的制备及鉴定

为制备抗布鲁氏菌单克隆抗体(MAb),本研究用灭活的布鲁氏菌疫苗M5-90株免疫BALB/c小鼠,利用细胞融合技术获得杂交瘤细胞.以布氏杆菌疫苗株M5-90、S-19及小肠结肠炎耶尔森菌0:9的脂多糖(LPS)分别作为抗原包被酶标板,对杂交瘤细胞进行筛选,获得两株稳定分泌抗光滑型布氏杆菌LPS(S-LPS)MAb的细胞4G6和16C5.特异性分析表明,MAb 4G6除与耶尔森0:9全菌体有轻微的交叉反应外与其它革兰氏阴性菌无交叉,而16C5完全排除了与其他各菌的交叉反应.Ig亚型分析表明,所制备MAb的轻链亚类均为κ,4G6重链为IgM.16C5重链为IgG3.用Protein G亲和层析纯化MAb 16C5腹水并初步用于竞争ELISA方法,检测布氏杆菌抗体水平,结果表明了该实验方法的有效性.本研究制备的MAb 16C5具有高度的特异性和敏感性,排除了与其他革兰氏阴性菌的交叉反应,为建立一种诊断布鲁氏病的快速、有效、敏感的方法奠定了有力的基础.     

广东与四川地区发病猪副猪嗜血杆菌分离株omp5基因的克隆及序列分析

为了比较副猪嗜血杆菌(HPS)外膜蛋白P5(omp5)基因的同源性及抗原性,试验设计合成1对特异性引物,通过PCR方法从广东省和四川省发病猪的30株分离菌中扩增出HPS omp5基因,然后将PCR产物克隆至pMDTM18-T载体上,转化大肠杆菌DH5α,并进行序列测定与分析.结果表明:30株HPS omp5基因的完整序...     

布氏杆菌和结核杆菌二重实时荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用

本试验旨在利用二重实时荧光定量PCR技术建立鉴别诊断布氏杆菌和结核杆菌的方法。通过筛选布氏杆菌omp10、omp19、omp17、omp25、omp31和结核杆菌cfp10基因的最佳引物组合,建立二重实时定量PCR鉴别诊断方法,对该方法进行稳定性、特异性和敏感性试验,并对临床样品及模拟样品进行检测。经筛选布氏杆菌的omp25基因与结核杆菌cfp10基因引物组合最佳,该二重实时荧光定量PCR方法中布氏杆菌Tm值为88～89℃,结核杆菌Tm值为90～91℃,对其他供试的菌株则为阴性;该方法对布氏杆菌的DNA最低检出量为20拷贝.μL-1,结核杆菌为50拷贝.μL-1,两病原都存在时为100拷贝.μL-1,比常规PCR高100倍。利用所建立的二重荧光定量PCR方法及常规PCR,对24份结核痰样、11份布氏杆菌基因粗提物及30份模拟奶样进行检测,符合率为100%。本试验建立的方法可用于同时检测布氏杆菌和结核杆菌,并且具有良好的特异性、敏感性和稳定性。     

毛皮动物细菌病流行病学调查及耐药分析

为调查毛皮动物细菌病的流行现状及耐药状况,对患病毛皮动物进行病理剖检、细菌分离培养、生化鉴定和药敏试验。结果,共分离出51株11种致病菌,分别为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肠杆菌、变形杆菌、枸橼酸杆菌、巴氏杆菌、绿脓杆菌、嗜血杆菌、耶尔森氏菌、志贺杆菌、肺炎双球菌。多数细菌对磷霉素钠、先锋V、头孢噻肟钠、庆大霉素、硫酸链霉素敏感,对氨苄西林、青霉素、四环素、林可霉素表现出耐药性。其结果可为毛皮动物细菌病的防治奠定基础。     

我省部分地区死亡畜禽的病原分离及鉴定

本试验共收集了死亡畜、禽、胚病料537份,分离出致病菌220株。其中鸡97羽,分离出多杀性巴氏杆菌64株,葡萄球菌1株;火鸡76羽,分离出多杀性巴氏杆菌17株,葡萄球菌1株;猪51头,分离出多杀性巴氏杆菌8株,猪丹毒杆菌10株,大肠株菌2株;羊13头,分离出葡萄球菌2株,大肠杆菌3株;兔9只,分离出多杀性巴氏杆菌1株;火鸡死胚255枚,分离出葡萄球菌42株,沙门氏杆菌33株,绿脓杆菌15株,大肠杆菌4株,链球菌2株;死亡鸡胚25枚,分离出绿脓杆菌8株,葡萄球菌4株,大肠杆菌3株。上述结果表明:致死家禽的病原菌主要有多杀性巴氏杆菌和葡萄球菌。家畜除此而外还有猪丹毒杆菌和大肠杆菌。致死胚胎的细菌主要有葡萄球菌、沙门氏菌、绿脓杆菌和大肠杆菌。本试验为减少畜禽的死亡和疫病的防治提供了依据,同时保存了地方菌株,为今后的科研和生产提供了保贵资料。     

抗生素及其动物用品种的发展与应用（下）

（接上期）5 氨基甙类抗生素 是由氨基糖分子甙元结合而成的一类抗生素。抗G－菌作用突出，也抗G＋菌但作用较青霉素弱，部分品种对结核杆菌、绿脓杆菌或霉形体也有作用。本类药对听神经易产生毒副作用，药物之间有单向交叉耐药性，例如对链霉素耐药的细菌对庆大霉素与卡那霉素仍然敏感，但细菌对庆大霉素与卡那霉素耐药后，对链霉素也同时耐药。5.1 链霉素：制剂有硫酸链霉素及硫酸双氢链霉素（粉针或溶剂）。本品对多数G＋菌的作用不如青霉素，但对多数G－菌（如布氏杆菌、巴氏杆菌、大肠杆菌）和结核杆菌作用良好。内服硫酸链霉素对肠…     

生物素标记LT基因探针检测产肠毒素性大肠杆菌

用碱变性法提取重组质粒pEWD299,经Hind Ⅲ酶切后,进行琼脂糖凝胶电泳,用电洗脱法回收LT基因850bp的核酸片段,再用二步法缺口翻译反应制备生物素标记的LT基因探针.通过菌落杂交试验表明,在严格去蛋白和RNA的条件下,该探针与试验中所有产LT和ST,或仅产LT的ETEC发生杂交反应;而与所有仅产ST的ETEC、侵袭性大肠杆菌(EIEC)、普通大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、小肠结肠耶尔森氏菌、霍乱弧菌均无杂交反应.其检测提纯的LT—DNA的敏感性水平为25pg,检测食品模拟标本中产LT大肠杆菌的敏感性达到130个细菌/g的水平.     

鱼源小肠结肠炎耶尔森菌5种毒力基因的检测和分析

采用煮沸法和细菌基因组DNA试剂盒两种方法制备鱼源小肠结肠炎耶尔森菌DNA模板,运用聚合酶链反应(PCR)方法检测小肠结肠炎耶尔森菌的5种毒力基因(ail、yadA、virF、ystB和HPI-int),并对HPI-int基因进行测序分析.结果表明,小肠结肠炎耶尔森菌ail、virF和HPI-int 3种毒力基因被检测出,而另外两种毒力基因ystB和yadA未被检测到.HPI-int基因长度为722 bp,GenBank序列号为JX041513,与该数据库中的小肠结肠炎耶尔森菌强毒力岛基因的相似性达到99％,由此推断该菌株具有较强的致病性.这为深入研究小肠结肠炎耶尔森菌的毒力和危害积累了科学资料.     

呼和浩特地区布氏杆菌bp26基因序列分析

为了研究呼和浩特地区布氏杆菌的分子生物学特点,试验采用分子生物学手段,根据Gen-Bank已发表的布氏杆菌bp26基因序列设计1对引物,提取布氏杆菌分离株的DNA进行PCR扩增并测序,再与参考菌株的bp26基因序列进行同源性比较、分析。结果表明:成功扩增了布氏杆菌呼和浩特分离株bp26基因,包含1个完整的开放性阅读框753 bp,与羊种(马耳他)布氏杆菌16M、C68株的同源性为100%;与猪种1330株、牛种290株、S19的同源性分别为99.9%、99.9%、98.5%。     

四川攀西地区奶牛乳房炎病原菌调查与敏感药物筛选试验

为了解四川攀西地区奶牛乳房炎病原菌和主要病原菌的耐药性情况,采用常规方法对3个奶牛场92个牛奶样品中的病原菌进行了分离鉴定,结果分离到17种菌,共计86株,分离到的病原菌数量最多的依次是大肠杆菌23株、绿脓杆菌17株、葡萄球菌15株、链球菌7株、沙雷菌属4株、弗劳氏枸橼酸杆菌3株、沙门氏菌3株、阴沟肠杆菌复合菌3株、粪肠球菌2株、猪丹毒丝菌2株以及坐皮肤球菌、产酸克雷伯氏菌、屎肠球菌、睾丸酮丛毛单胞菌、枯草芽孢杆菌、施氏假单胞杆菌、奇异变形杆菌各1株。采样量为12头、16头、18头奶牛的3个场,分别分离出14种、13种、16种乳房炎病原菌。同时,采用常规药敏试验方法对分离病原菌株数量最多的8种主要病原菌即大肠杆菌、绿脓杆菌、葡萄球菌、链球菌、沙雷菌、弗劳氏枸橼酸杆菌、沙门氏菌、阴沟肠杆菌复合菌进行了常用抗生素敏感试验,结果表明他们均存在不同程度的耐药性。     

布氏杆菌S2疫苗株GL_0002181基因的原核表达

为了鉴别羊种布氏杆菌自然感染和S2疫苗(猪种)免疫羊,选用布氏杆菌S2疫苗株进行了全基因组测序,预测出的编码基因与已公布的布氏杆菌基因组数据库比对分析,找出S2特有基因GL_0002181,对GL_0002181基因进行原核表达及免疫原性验证,同时用BP26蛋白作为对照组。Western blot结果显示:以S2疫苗免疫绵羊血清作为检测抗体,重组菌BL21(pETGL_0002181)、BL21(pETBP26)与BL21(DE3)空菌比较,分别在31 ku、32 ku处出现了特异性条带,说明重组蛋白能够与S2免疫血清中的抗体发生特异性反应,具有较好的免疫原性;而重组表达菌BL21(pETGL_0002181)菌体蛋白与自然感染血清不反应,重组蛋白BP26与自然感染血清反应,说明GL_0002181基因在S2疫苗株中存在,在羊种自然流行株中不存在。结果表明:GL_0002181抗原可用于布氏杆菌S2疫苗免疫与羊种布氏杆菌自然感染鉴别诊断,为布氏杆菌病有效诊断提供理论依据。