日本晴组培培养基的筛选及转稻瘟菌蛋白激发子基因植株的获得

采用B6、MS和NB三种培养基，以粳稻品种日本晴的成熟胚为受体材料进行组织培养，比较了三种培养基的效果。结果表明，在三种培养基中，NB培养基对愈伤组织的诱导效果最好，转化效率最高，最适合于日本晴成熟胚的组织培养。在此基础上，通过根癌农杆菌介导转化法将稻瘟菌蛋白激发子基因pemG1导入日本晴基因组，获得了转基因水稻植株。PCR、Northern blot和Western blot分别证实了pemG1基因的整合、转录和表达。遗传分析表明，外源基因在转基因日本晴后代中的分离符合3：1的理论比例。     

抗真菌γ -硫堇蛋白Rs-afp1基因导入丰产梨获得转基因植株

梨童期长，自交不亲和，杂合程度高，进行常规杂交育种改良相当困难。而采用遗传转化手段，将期望性状引入现有品种，不会出现基因的大量重组，也避开了童期的干扰。该技术已使许多作物获得了抗病的基因工程植株。本实验通过采用光诱导绿色组织特异表达的启动子Rubisco-acfivase(RCAP)驱动，将对真菌具有广普抗性的Rs-afp1，基因导人，建立了梨农杆菌转化体系，为进一步选育抗病品种奠定基础。     

水稻巯基蛋白酶抑制剂基因(OCI )转化甘薯获得转基因植株

用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法将水稻巯基蛋白酶抑制剂基因(OCI)导入甘薯（Ipomoea batatas)品种栗子香，获得了转基因植株。所用菌株为根癌农杆菌LBA4404，其携带的pBinh质粒上含有新霉素磷酸转移酶Ⅱ(NPT Ⅱ)基因和OCI基因。将继代培养3d后的栗子香胚性悬浮细胞与LBA4404(OD600nm=0．5)共培养4d。将共培养后的胚性悬浮细胞首先在含有2mg／L2，4-D和300mg／L Carb(carbencillin)、但不含有Kan（kanamycin)的MS液体培养基中培养5d，然后在含有2mg／L2，4-D、50mg／L Kan和300mg／L Carb的MS液体培养基中进行选择培养。选择培养4周后，将直径约1mm的抗Kan细胞团转移到添加2mg／L2，A-D、50mg／L Kan和300mg／L Carb的MS固体培养基上，共转移200个细胞团，诱导得到了8个胚性愈伤组织。将这些抗Kan胚性愈伤组织转移到添加1mg／L ABA、50mg／L Kan和100mg／LCarb的MS固体培养基上，通过体细胞胚胎发生途径获得了13株再生植株。PCR和PCR-Southern检测结果表明，获得的13株再生植株中7株是转基因植株。     

转hBMP-3m基因烟草的初步研究

重组人骨形成蛋白hBMP已在中国仓鼠卵巢细胞、昆虫等真核细胞和大肠杆菌等原核细胞表达系统中得到了表达[1,2].关于hBMP转化植物的研究国内外尚未见报道.     

商陆抗病毒蛋白基因转化芥菜的获得及抗性研究

以芥菜(Brassica Juncea Coss.)的子叶为外植体,通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的介导,将商陆抗病毒蛋白基因PAP导入到芥菜中。对所获得的40株抗性植株进行PCR扩增,其中阳性植株为29株;Southern blot分析结果证明PAP基因已被整合到芥菜基因组中,在大多数转基因植株中外源基因呈单拷贝,少数为双拷贝;Northern blot分析结果表明,PAP在转基因植株中正常表达。转基因植株接种病毒试验初步结果表明,转PAP基因的植株对芜菁花叶病毒TuMV的侵染有一定的抑制作用。     

转CBF1基因增强水稻的耐逆性

为改良水稻(Oryza sativaL.)的耐逆性,以来源于成熟种子的胚性愈伤组织为受体材料,通过农杆菌介导法将拟南芥(Arabidopsis thaliana)耐逆相关CBF1基因导入粳稻品种秀水11基因组,经GUS组织化学染色、PCR检测和Southern杂交分析验证,获得一批转基因植株。T1代检测结果显示,所转基因已遗传给后代,且大多数株系的分离比符合3∶1。试验表明,在高盐与高渗胁迫下,转基因株系较非转化对照具有显著或极显著生长优势,表现苗高负增长率较小,长出的根数较多,根长较长;经低温胁迫处理后,转基因株系的叶片相对电导率显著或极显著低于对照。这些结果证明水稻转基因株系的耐逆性得到了增强。     

苜蓿花叶病毒外壳蛋白基因在白三叶中的表达及转基因植株的抗病性分析

以白三叶(Trifolium repens L.)的两个品种Irrigation和Huia的子叶为转化体，用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法将外源的苜蓿花叶病毒外壳蛋白基因转入白三叶，经过筛选、分化和再生，得到了具有卡拉霉素抗性的再生植株。对这些植株进行PCR、Southern和Northern分析，结果表明，外源目的基因已经整合到白三叶基因组中并且得到了表达。对Northern分析呈阳性的植株进行了抗病性检测，证明表达苜蓿花叶病毒外壳蛋白基因的植株病症减轻，发病率、病情指数及病毒积累量都明显低于对照，有的甚至不表现症状，达到了免疫的程度。     

转柽柳金属硫蛋白基因（MT1）烟草的获得及对重金属镉的抗性分析

将柽柳（Tamarix. sp）金属硫蛋白基因（MT1）插入到植物表达载体pBI121，利用农杆菌（Agrobactrium tumefaciens）介导法将MT1导入烟草基因组。对转基因T1植株的卡那霉素抗性分析表明，多数转基因植株后代表现为3:1的分离比例，只有少数转基因植株的抗性分离表现为15:1或不符合孟德尔遗传的分离比例。说明整合到烟草基因组的外源基因多为单拷贝基因，也有少数为多拷贝基因。对具有卡那霉素抗性的转基因植株进行PCR-Southern检测和Northern杂交分析表明，外源MT1基因已整合到烟草基因组，并且得到了正确表达。转基因植株对重金属镉的抗性比对照显著提高，表现为转基因植株的株高和鲜重均明显优于非转基因株系。     

瞬时表达黄瓜花叶病毒部分复制酶基因和番茄花叶病毒移动蛋白基因的dsRNA能阻止相关病毒的侵染

根癌农杆菌介导的瞬时表达法已开始用于研究RNA沉默，在非转基因植物细胞中，如能建立借助于根癌农杆菌介导的瞬时表达法。考察反向重复片段转录出的dsRNA对入侵病毒的干涉作用，则可以快速预测所构建重组载体用于抗病毒基因工程的效果。本研究证明用根癌农杆菌浸润法在植物的叶片组织中瞬时表达dsRNA，可以阻止相关病毒的侵染。     

棉花农杆菌基因转化体系的优化和转苜蓿抗菌肽基因(alfAFP)植株的获得

为了优化根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的棉花(Gossypium hirsutumL.)下胚轴切段的基因转化体系,以苜蓿(Medicago sativa L.)抗菌肽基因(alflafa antifungul peptide,alfAFP)为目标,利用γ-葡萄糖甘酸酶基因(gus)和潮霉素抗性基因(Hpt)的检测方法,分析了根癌农杆菌菌种、菌液浓度、浸染下胚轴的时间、共培养中乙酰丁香酮(AS)的浓度、共培养温度和时间等因子对基因转化的影响.优化分析表明,用农杆菌菌株LBA4404,当OD_(600)值为0.5～0.7的菌液浸染5～7日龄的棉花无菌苗下胚轴切段10～15 min.在含200 μmol/L AS的共培养基中21℃暗培养60h,可更有效地提高转化率.经上述条件处理的下胚轴在含50 mg/L潮霉素的愈伤诱导培养基上培养3周可产生转化率最高的愈伤组织.愈伤组织经分化培养获得15株再生棉花,经过PCR和PCR-Southern分析.发现其中12株含有外源基因alfAFP.     

抗真菌γ—硫堇蛋白Rs—afp1基因导入苹果获得转基因植株

以“皇家嘎啦”（Royal Gala)苹果（Malus domestica Borkh）为试材，在绿色组织特异表达的菠菜核酮糖二磷酸羧化酶／加氧酶的激活酶（Rubisco-activase)启动子（RCAP）驱动下，将抗真菌γ-硫堇蛋白（γ-thionin)Rs-afp1基因和uidA(gus)基因导入白化茎段外植体，获得了nptⅡ抗性植株。转化体经PCR和Southern blotting杂交检测，证实了γ-硫堇蛋白Rs-afp1基因和gus基因已经整合到苹果的染色体组上。gus染色证实了RCAD启动子在苹果组织中的特异性表达。转基因植株已移栽于大田，进行农业性状鉴定。     

转拟南芥NPR1基因桂99 T3代植株的抗病性及农艺性状表现

以转拟南芥AtNPR1基因的恢复系品种桂99T3代纯合株系为材料,考查其农艺性状及其抗病性,并比较转基因植株与桂99侵染水稻白叶枯病菌后的农艺性状。结果表明：转基因植株表现出对水稻白叶枯病的抗性显著增强77%以上;穗长、剑叶长、有效穗数、一次枝梗数、每穗实粒数、单株产量和谷粒宽等农艺性状与未转基因桂99无显著差别。在受到水稻白叶枯病菌侵染后,转基因植株的一次枝梗数、每穗粒数、每穗实粒数和单株产量等方面均比对照桂99高出13%～78%。说明AtNPR1基因增强了水稻的抗病能力,从而降低了病害引起的产量损失。转基因植株的恢复力不受影响,稻米品质比桂99更加优良。本工作为转基因水稻抗病育种的研究奠定了基础。     

高赖氨酸蛋白质基因和bar基因导入水稻及转基因植株的检测

构建了1个含高赖氨酸蛋白质基因和bar基因的植物表达载体，用基因枪法将其分别导入籼稻(Oryza sativa ssp．indica)中优早5号幼胚和龙特甫B成熟胚诱导的愈伤组织中，筛选后得到16株可育的再生植株。PCR和Southern blot检测结果表明，外源基因已整合到水稻的基因组中。T1代植株表现出对PPT的抗性。对部分T1代转基因水稻种子进行分析表明，中优早5号种子中蛋白质含量(12．07％～16．2％)和赖氨酸含量(0．52％-0．67％)分别提高了35．18％和45．09％，龙特甫B种子中蛋白质含量(11．92％，12．87％)和赖氨酸含量(0．51％-0．57％)分别提高了27．69％和16．15％。     

转基因水稻中ThEn-42基因的稳定遗传及其抗病性的提高*

用农杆菌介导法将CaMV35S启动子调控下的外源基因ThEn-42转入粳稻(Oryza sativa ssp．japonica)品种台北309中。对100多株再生植株进行了PCR鉴定，结果表明，90％以上的植株为阳性植株。Southern检测的结果进一步证实，外源基因已经整合到水稻基因组中。对T1代植株也进行了PCR鉴定和潮霉素抗性鉴定，结果表明，大约70％的T1代转基因株系符合3：1(阳性：阴性)的分离比，表明ThEn-42基因在这些株系中有单个插入位点；大约20％的T1代株系分离比符合15：1，表明这些株系含有2个整合位点。选择部分T1代潮霉素抗性植株进行Southern杂交鉴定，结果证实，外源基因已经稳定遗传给T1代。检测了T0代和T1代转基因植株对水稻纹枯病(Rhizoctonia solani)和两个分别属于A群和B群的稻瘟病(Magnapotthe grisea)小种的抗性，结果表明，30%株系表现了对这两种病害抗性水平不同程度的提高。有7个株系的抗性与对照相比有显著的提高，其中Tp64表现对两个稻瘟病小种完全免疫。这些结果表明内切几丁质酶基因ThEn-42已经在受体植物中准确表达，并且在提高水稻抗病性方面起了重要作用。     

位点特异性重组及其在剔除植物筛选标记基因中的应用

植物遗传转化中筛选标记基因的剔除是转基因植物商品化的一个重要因素,位点特异性重组可用于剔除筛选标记基因.常用的位点特异性重组系统主要有Cre/loxP、FLP/FRT和R/Rs系统.在应用中,可以通过二次转化或与含重组酶的转基因植株杂交来组成性表达重组酶,或利用瞬时表达、诱导性表达、组织特异性表达重组酶来剔除选择标记基因,从而获得无标记基因的转基因植株,而诱导性标记基因剔除最为有效.     

晚粳稻品种浙粳22内稃突变体基因的遗传分析和基因定位

晚粳稻品种浙粳22内稃突变体是60Co γ射线对浙粳22辐照后选到的内稃约有正常内稃一半大小的突变体。遗传分析表明,该突变性状由1对隐性基因控制。该内稃突变体与籼稻珍汕97杂交的F₂群体,采用SSR分子标记对突变性状基因进行初步遗传定位,把内稃突变基因定位在第9号染色体上,暂将该突变基因命名为hig1,位于RM6051和RM556之间,遗传距离为12.7cM。