Time-related Pathological Changes in Horses Experimentally Inoculated with Equine Influenza A Virus

To investigate the pathology of equine influenza, necropsy of 7 horses experimentally infected with equine influenza A virus (EIV) subtype H3N8 was conducted on post-infection days (PID) 2, 3, 7, and 14. Histopathologically, rhinitis or tracheitis including epithelial degeneration or necrosis with loss of ciliated epithelia and a reduction in goblet cell numbers, was observed in the respiratory tracts on PIDs 2 and 3. Epithelial hyperplasia or squamous metaplasia and suppurative bronchopneumonia with proliferation of type II pneumocytes were observed on PIDs 7 and 14. Viral antigen was detected immunohistochemically in the epithelia of the nasal mucosa, trachea, and bronchi on PIDs 2 and 3. The sodA gene of Streptococcus equi subsp. zooepidemicus, a suspected cause of suppurative bronchopneumonia, was detected in paraffin-embedded lung tissue sections, but only on PIDs 7 and 14. These findings suggest that damage caused to ciliated epithelia and goblet cells by EIV infection results in secondary bacterial bronchopneumonia due to a reduction in mucociliary clearance.     

猪流感病毒血凝素基因的研究进展

猪流感是由猪流感病毒引起的一种急性、热性、高度接触传染性呼吸道疾病,可继发和并发多种细菌病和病毒病,已日益成为危害世界猪群的主要传染病之一。猪流感病毒血凝素基因作为流感病毒表面最主要的抗原基因,其表达蛋白具有丰富的生物学作用,对流感病毒的致病性起着主导作用。作者主要对猪流感病毒血凝素基因的研究进行了综述,为进一步防治猪流感及开发新型疫苗提供帮助。     

免疫PCR检测微量H5亚型禽流感病毒

为了有效检测低浓度禽流感病毒,笔者通过将高特异性的抗原-抗体反应与高灵敏性的PCR扩增技术相结合,建立了一种快速检测痕量H5亚型禽流感病毒的间接免疫PCR方法和间接“三明治”抗体夹心免疫PCR方法.以TopYield 96孔板为固相免疫吸附载体,以禽流感病毒H5蛋白为检测对象,通过一系列免疫反应及亲和素-生物素桥联作用,将生物素标记的报告DNA分子和生物素标记的禽流感病毒H5亚型抗体分子连接.充分洗涤后,在TopYield板孔中添加PCR反应液,对板壁偶联的报告DNA进行PCR扩增,间接达到检测微量禽流感病毒H5蛋白的目标.通过优化报告DNA分子和链亲和素的浓度,2种免疫PCR技术都可检测到约1 fg的禽流感病毒H5蛋白,与常规ELISA方法相比,灵敏性提高了近1 000倍.     

表达猪流感病毒血凝素基因的重组腺病毒的构建及免疫原性分析

通过细菌内同源重组的方法成功构建了表达H3N2亚型猪流感病毒血凝素的重组腺病毒。首先将血凝素基因亚克隆到穿梭载体质粒pAdeno Vator-CMV5-IRES-GFP上，与腺病毒基因组质粒pAdeno Vator△E1／E3共转化大肠杆菌BJ5183菌株，经细菌内同源重组产生重组腺病毒质粒pAd—HA—GFP。将该重组质粒转染293细胞以包装重组腺病毒。根据报告基因GFP的表达及Western-blot分析，证明获得了可正确表达猪流感病毒血凝素的重组腺病毒rAd—HA—GFP。重组腺病毒经一次性腹腔注射接种昆明鼠，2周后可检测到血凝抑制抗体，并且抗体至少可以持续12周，证实重组腺病毒介导表达的血凝素蛋白具有良好的免疫原性，可诱导小鼠产生高滴度的特异性抗体。     

H3N2亚型禽流感病毒及猪流感病毒感染人肺腺癌细胞后增殖的差异性变化

人肺腺癌细胞A549被H3N2亚型禽流感病毒和猪流感病毒感染后,探讨不同毒株跨种属感染人呼吸道组织的可能性和趋势性。通过观察病毒感染A549细胞后的细胞病变(CPE)、血凝试验(HA)和50%组织细胞感染量(TCID50)来比较不同毒株感染细胞后的复制差异和毒力改变,发现同一亚型不同来源的流感病毒对A549细胞感染和复制能力有较大差异,哺乳动物来源的病毒更有感染人呼吸道细胞的趋势,SW/GX/NS2783/2010有潜在的感染人细胞的能力。感染过程中的细胞因子变化和病毒基因组组成特点是进一步研究的方向,应重点关注具有跨种属感染趋势的流感病毒及其特殊分子决定簇的组成和特点。     

鹅源H5N1亚型禽流感病毒株HA基因的克隆与序列分析

本研究对1株鹅源H5N1亚型禽流感病毒血凝素（HA）基因进行了扩增、克隆及序列测定。结果表明：所扩增的片段长1707bp，包含完整的开放阅读框架，编码568个氨基酸。该毒株裂解位点的氨基酸序列为RRRKKR，具有高致病性的分子特征；该毒株有6个潜在糖基化位点；受体结合位点的氨基酸分别为YWIHELY，其左侧壁氨基酸为SGVSSA，右侧壁为NGQSGR。该毒株与国内外一些参考毒株的HA基因序列比较，核苷酸同源率为76.8％～98．1％，氨基酸同源率为85．7％～97．4％，属于欧亚种系。     

基于血凝素裂解位点的DNA条形码在A型流感病毒分型中的应用

为了建立一种快速鉴别AIV的HA亚型的RT-PCR方法,本研究探讨了流感病毒血凝素裂解位点基因作为DNA条形码对A型流感病毒进行亚型鉴定的可行性。通过生物信息学方法对16种A型流感病毒的血凝素基因全长进行比对,在HA裂解位点的两端高度保守区设计一对DNA条形码引物,RT-PCR扩增获得约170bp的核苷酸片段。利用MEGA5.0软件构建N-J系统树并计算亚型间及亚型内平均遗传距离。结果显示,不同A型流感病毒裂解位点氨基酸具有单系性,每一亚型可分别形成各自独立的分支。不同亚型间平均遗传距离为0.277,相同亚型内平均遗传距离0.032。研究表明,利用DNA条形码技术可在A型流感病毒分型方面进行有效的分子分类鉴定。     

H4亚型禽流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体的制备

以H4亚型AIV分离株A/鸭/扬州/185/2003免疫BALB/c小鼠,取小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞进行融合,经血凝抑制(HI)试验筛选并克隆后,获得能够稳定分泌抗体的单克隆细胞株:2C11、6E7、4C8和5C5。4株单抗腹水的HI效价在2~(12)～2~(15),单抗亚类均为IgG2a。4株单抗均能与感染了H4亚型AIV的MDCK细胞发生间接免疫荧光(IFA)反应。并且,均不与其他亚型AIV、NDV、IBV和EDS-76病毒发生HI反应。另外,4株单抗均能使病毒失去感染细胞的能力,显示出良好的中和特性。单抗HI反应谱表明,2C11、4C8、6E7和5C5分别可以抑制10株H4亚型AIV中9、8、7和7株病毒的血凝反应,且均不能抑制A/鸭/苏州/1/2002毒株的血凝作用。     

核酸免疫制备抗猪流感病毒HA单克隆抗体

为制备H1N1猪流感病毒HA蛋白单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb),本试验利用表达猪流感病毒A/Swine/Guangdong/2004(H1N1)毒株HA蛋白的表达质粒pVAX1-HA肌注股内肌免疫BALB/c小鼠,将其脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)进行融合;通过间接ELISA方法筛选和有限稀释法克隆,获得9株稳定分泌抗HA单克隆抗体的杂交瘤细胞。中和试验结果显示,单克隆抗体4D5株对H1N1流感病毒起中和作用,该单克隆抗体杂交瘤细胞培养上清的效价为1∶1024。这株单克隆抗体与哈尔滨兽医研究所国家重点实验室保存的H3N2流感病毒、H5N1流感病毒均不发生交叉反应,显示出了很好的H1特异性;间接免疫荧光试验结果显示,这株单克隆抗体能与H1N1流感病毒发生特异性反应。制备的特异性抗HA单克隆抗体为建立H1N1流感病毒免疫学检测方法和单链抗体抗病毒复制研究奠定了基础。     

共表达H5亚型AIV HA 基因与鸡IL-18基因的重组鸡痘病毒的构建

以鸡痘病毒(FPV)疫苗株为载体,将H5亚型AIV血凝素基因(HA)和鸡白细胞介素18(IL-18)基因分别插入到鸡痘病毒表达载体pUTA-16-LacZ复合启动子(ATI-P7.5×20)和单一启动子(P7.5)下游,构建了携带AIV HA基因和鸡IL-18基因的重组鸡痘病毒转移载体质粒pUTAL-H5HA-IL18.将H5亚型AIV HA基因插入到鸡痘病毒表达载体pUTA2复合启动子(ATI-P7.5×20)下游构建了携带H5亚型AIV HA基因的重组鸡痘病毒转移载体质粒pUTA2-H5HA.应用脂质体转染法,将重组鸡痘病毒转移载体质粒与282E4株鸡痘病毒共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),在BrdU药物加压下进行3次蚀斑筛选.以不同代次细胞的mRNA为模板,利用H5亚型AIV HA基因和鸡IL-18基因特异引物进行RT-PCR和蛋白印迹检测,筛选出能共表达H5亚型AIV HA基因与鸡IL-18基因和单独表达H5亚型AIV HA基因的重组鸡痘病毒rFPV-H5HA-IL18和rFPV-H5HA,这些重组鸡痘病毒的构建为AIV活载体疫苗的研制奠定了基础.     

共表达鸡IL-6和H5亚型禽流感病毒HA基因重组鸡痘病毒免疫抗体消长规律及免疫效力研究

为评价共表达鸡IL-6和H5亚型禽流感病毒HA基因重组鸡痘病毒(rFPV-AIH5AIL6)的免疫抗体消长规律及免疫效力,将重组病毒通过颈部皮下注射和翅部皮下注射2种不同的免疫途径来免疫鸡群,结果发现,2种免疫途径中,重组鸡痘病毒对鸡体质量增加均无影响,而野生型鸡痘病毒均可抑制鸡体质量增加。翅部皮下注射疫苗组能够产生较高的血凝抑制(HI)抗体水平,免疫21d后抗体水平达到高峰,28d后开始下降,49d时仍保持在一定的水平。免疫SPF鸡21d后攻毒,表明该重组病毒能使经滴鼻攻毒的SPF鸡抵抗H5亚型AIV的致死性攻击,保护率为95%,与油苗组相同,与单表达H5亚型禽流感病毒HA基因重组鸡痘病毒组(40%)差异显著;攻毒后3、5、7d采集喉头、泄殖腔棉拭子检测排毒情况,结果发现第3天排毒率最高,其中rFPV-AIH5AIL6免疫组排毒率为最低,显示IL-6在rFPV-AIH5IL6免疫过程中起到了免疫佐剂的作用,这为研制新型的禽流感重组鸡痘病毒疫苗奠定了基础。     

鸭源流感病毒人工感染鸡的病毒抗原定位动态

研究了由南京地区分离的鸭源流感病毒A/duck/Nanjing/21/95（H9N2？）感染商品来航鸡后，各组织脏器中病毒分离情况和病毒抗原分布。结果表明，禽流感病毒（AIV）可以从肾脏、肺脏、脾脏和心脏中分离出来，接种后3d(PI3），病毒在组织中的分离率最高，且又以肾脏的分离率最高。病毒抗原主要分布在肾小管上皮细胞、呼吸系统单核细胞和少量上皮细胞的胞核内，PI3时病毒抗原的检出率最高。这些结果表明，肾脏是该毒株复制的主要部位，肾脏的病变是病毒直接损伤的结果，而且该株AIV具备在呼吸系统内复制的潜力。     

H6亚型禽流感病毒血凝素蛋白线性表位的预测与鉴定

应用生物信息学方法预测H6亚型禽流感病毒血凝素蛋白(HA)线性抗原表位,并对所获表位的免疫原性进行初步鉴定,为流感病毒表位疫苗研制和H6亚型特异性ELISA检测方法奠定基础。依据近年流感病毒流行趋势,从GenBank下载具有代表性的H6、H5、H7和H9亚型禽流感病毒血凝素蛋白的氨基酸序列。利用DNA Star软件进行H6同亚型间氨基酸序列保守性分析,再将H6与H5、H7、H9不同亚型之间氨基酸同源性进行比较,然后借助在线服务器ExPASy和IEDB对序列进行抗原性、亲水性、柔韧性、二级结构和表面可及性预测。最后去除H6与H5、H7、H9亚型氨基酸同源区域,选择H6亚型氨基酸相对保守区域并且抗原表位综合预测结果较优的几个片段,所选择表位长度为15个氨基酸。合成所获得的优势线性表位,并用间接ELISA方法对所获表位的免疫原性进行鉴定。预测后获得4个线性抗原表位,经鉴定免疫原性最好的为表位A,最差的为表位B。     

H1N1猪流感病毒血凝素蛋白抗原表位的筛选及其抗原性分析

本研究旨在对H1N1猪流感病毒血凝素蛋白抗原分子的模拟表位进行分离鉴定并分析其抗原性。用抗H1N1猪流感病毒血凝素蛋白小鼠血清IgG对噬菌体随机12肽库进行筛选,3轮亲和筛选后,特异性噬菌体得到了有效富集;对随机挑选的47个噬菌体克隆用ELISA进行鉴定,其中40个为阳性;对40个阳性克隆测序得到3种不同氨基酸序列;用Western blotting对获得的3个不同序列的噬菌体克隆进行抗原性分析,显示这3种噬菌体插入短肽能和H1N1猪流感病毒感染小鼠血清特异性结合。结果表明,本试验获得了3种H1N1猪流感病毒血凝素蛋白模拟抗原表位,它们都具有明显的抗原性,为H1N1猪流感病毒的疫苗研究和诊断奠定了基础。     

H5N1禽流感病毒感染小鼠后内参基因的筛选

本研究旨在评定H5N1禽流感病毒(H5N1 avian influenza virus,H5N1 AIV)感染小鼠后,脾脏组织中6个候选内参基因酪氨酸3/色氨酸5-单加氧酶激活蛋白(tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activation protein,Ywhaz)、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1(hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase 1,Hprt1)、琥珀酸脱氢酶A亚基(succinate dehydrogenase flavoprotein subunit,Sdha)、β-肌动蛋白(β-actin,Actb)、肽基脯氨酰异构酶A(peptidyl prolyl isomerase A,Ppia)和18S核糖体RNA(18S ribosomal RNA,18S rRNA)的稳定性。通过H5N1 AIV强毒株A/DK/GD/378/08感染小鼠,采用Real-time PCR方法分别于12、24、48、72、96、120和144 h检测感染组与对照组中6个候选内参基因的表达水平,然后用Genorm软件对内参的稳定性进行评价。结果表明,正常小鼠脾脏组织中6个内参基因稳定度由高到低分别为Ywhaz/Hprt、Sdha、Actb、Ppia、18S rRNA;H5N1 AIV感染的小鼠脾脏组织中6个内参基因稳定度由高到低分别为Ppia/Sdha、18S rRNA、Hprt、Ywhaz、Actb;综合评价正常和H5N1 AIV感染后小鼠脾脏组织中6个内参基因的表达稳定度由高到低分别为Sdha/Hprt1、Ywhaz、Ppia、Actb、18S rRNA。因此,小鼠脾脏组织中Ppia和Sdha是研究H5N1 AIV在机体中复制时最理想的2个内参基因;Sdha和Hprt1则是在研究H5N1 AIV与机体相互作用时最理想的2个内参基因。     

豚鼠醛化红细胞在人流感病毒血凝活性测定中的应用

在流感疫情监测中,血凝试验是最常用的检测方法.针对鸡红细胞不能凝集流感病毒"O"相毒株,新鲜红细胞需现采现配、麻烦、费时,易溶血、不易保存等问题,本试验对豚鼠醛化红细胞制备方法的筛选和制备条件的优化进行研究,并以新鲜豚鼠红细胞为对照,用于流感病毒不同型别血凝试验.结果表明,戊二醛固定法制备的豚鼠醛化红细胞不溶血、结果稳定性好、保存期长、血凝活性与新鲜豚鼠红细胞基本一致,可以替代新鲜豚鼠红细胞用于血凝试验.     

H3N8亚型马流感病毒单克隆抗体的制备及鉴定

以灭活马流感病毒(EIV)A/Equine/Jilin/1/1989(H3N8)为免疫原,免疫Balb/c小鼠,经常规细胞融合后,用血凝抑制试验(H1)和间接ELISA方法筛选获得3株(3C2、5G10和5A10)能稳定分泌H3N8亚型马流感病毒单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞株.其中3C2和5G10为IgG2α,5A...     

猪流感病毒蛋白研究进展

猪流感（swine influenza,SI）是由猪流感病毒（swine influenza virus,SIV）引起的猪的一种传染病,其在世界各地的广泛存在和流行,给养猪业带来了巨大的经济损失。猪流感病毒属于正黏病毒科A型流感病毒属,作者就猪流感病毒蛋白,包括血凝素（HA）、神经氨酸酶（NA）、核蛋白（NP）、基质蛋白（M）、聚合酶蛋白（PA、PB1和PB2）和非结构蛋白（NS）进行简要概述,以期为猪流感病毒的致病机制、诊断、分子流行病学等方面的研究提供参考。     

抗流感及禽流感病毒新药"帕拉米韦"研究进展

帕拉米韦（Peramivir）是一种以流感病毒表面糖蛋白神经氨酸酶为作用靶点的新型环戊烷类抗流感药物.本文综述了帕拉米韦的合成工艺、作用机理、药效学、药动学、临床研究及毒副作用等方面的研究进展.     

H9N2亚型禽流感病毒中和单克隆抗体的制备与应用

为建立H9N2亚型禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）免疫层析快速检测技术,本研究以差速离心法纯化H9N2亚型AIV免疫BALB/c小鼠,将免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合和HAT选择性培养;以H9N2亚型AIV感染MDCK细胞建立异源免疫过氧化物酶单层细胞试验（IPMA）的单克隆抗体检测方法,通过对杂交瘤细胞的IPMA筛选和连续克隆化筛选鉴定抗H9N2亚型AIV中和性单克隆抗体;以胶体金标记HA单克隆抗体,配对HA单克隆抗体和羊抗小鼠IgG为检测线和质控线,制备H9N2亚型AIV快速检测试纸条,测定其特异性和敏感性。结果显示,获得了11株稳定分泌抗H9N2亚型AIV单克隆抗体的杂交瘤细胞,其单克隆抗体腹水IPMA效价在1.28×10^-4至2.56×10^-5之间。单克隆抗体3A2、5H6、6B8、7E10和9G12血凝抑制试验（HI）显示血凝抑制活性,其（HI）效价在6log2~9log2之间。单克隆抗体3A2、6B8和9G12在病毒中和试验中对H9N2亚型AIV有显著病毒中和活性,中和效价分别1∶6 400、1∶25 600和1∶25 600。Western blotting结果提示,该中和单克隆抗体识别HA蛋白线性抗原表位。利用配对单克隆抗体3A2和9G12研制的H9N2亚型AIV检测试纸条检测H9N2亚型AIV尿囊液的效价为9log2,灵敏度与经典血凝试验（HA）相当,与其他亚型AIV （H1、H3、H5、H7）,以及新城疫病毒和鸡传染性法氏囊病病毒等相关病毒均无交叉反应。本研究制备了具有病毒中和活性的抗H9N2亚型AIV单克隆抗体,并初步研制了H9N2亚型AIV检测试纸条,为H9N2亚型AIV新型疫苗研制和快速检测奠定良好的研究基础。