SYBR Green I实时定量RT-PCR技术在甜樱桃病毒定量分析中的应用

为了探讨SYBRGreenI实时定量RT—PCR技术在甜樱桃病毒粒子定量分析中的应用前景,以复合感染李属坏死环斑病毒（Prunusnecrotic ringspot virus,PNRSV）、李矮缩病毒（Prune Dwarf vi—rus,PDV）、樱桃病毒A（CherryvirusA,CVA）、樱桃小果病毒一2（Little cherry virus一2,LChV－2）的甜樱桃“红灯”PrunusaviumCV．RedLamp植株为研究对象,采用相对定量方法,分析各病毒的外壳蛋白基因的表达,用以指示病毒的增殖量。在花、幼叶、功能叶、衰老叶中均能检测到4个基因,但各基因表达量在各器官中存在差异。PNRSV-CP与CVA—CP表达模式相似,功能叶中明显高于其它器官,衰老叶中急剧降低。PDV-CP与LChV2一卯表达模式类似,幼叶中的表达量较高,功能叶片中较低。PNRSV-CP在花、功能叶中的表达显著高于其它3个病毒基因。LChV2一cP在各器官中的表达量均低于其余3个基因。该方法适用于植物组织内多种甜樱桃病毒增殖量的分析。     

甜瓜黄斑病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法

为建立检测甜瓜黄斑病毒(melon yellow spot virus, MYSV)的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR(qPCR)方法。基于MYSV核衣壳蛋白基因保守序列设计qPCR特异性引物对,针对引物退火温度、引物浓度、特异性和敏感性进行系列优化。结果显示,优化后的qPCR方法最适退火温度为61.3℃,最适引物浓度为0.65μmol·L^-1,特异性强,灵敏度高,比PCR高100倍。以携带目的基因片段的重组质粒为标准品,构建的qPCR标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,相关系数为0.999 7。实验样品验证表明建立的qPCR方法可用于MYSV的定量检测。     

甜樱桃李矮缩病毒(PDV) RT-PCR检测方法的优化与应用

以甜樱桃(Prunus avium L.)品种红灯的叶片为材料,提取总RNA,选用随机六聚体引物进行反转录合成cDNA,根据李矮缩病毒外壳蛋白基因设计2对特异引物,分别从感病样品中扩增出与预期片段大小相符的目的片段.通过对RT-PCR反应体系中引物、模板浓度和退火温度的优化,改进了现有的李矮缩病毒的RT-PCR检测方法,并成功用于山东泰安地区甜樱桃果园的病毒调查.另外,还可以扩增18 sRNA,实现对李矮缩病毒外壳蛋白基因表达的相对定量分析.     

葡萄卷叶伴随病毒2实时荧光定量RT-PCR技术的检测应用

通过引物筛选和体系优化建立了葡萄卷叶伴随病毒2 Grapevine leafroll-associated virus 2(GLRaV-2)的SYBR GreenⅠ染料法实时荧光定量RT-PCR检测技术。该技术标准曲线扩增效率为102.2%,决定系数为0.999,最低检出限可达10^-3稀释梯度,是常规RT-PCR的100倍。对不同季节和不同部位葡萄样品的检出率普遍高于常规RT-PCR。春夏秋季样品检出率分别为67%、89%和86%,比常规RT-PCR检出率分别高42%、28%和17%。冬季休眠枝条检出率最高(100%),与常规RT-PCR相同。夏季老叶柄和卷须、秋季和冬季枝条等样品检测效果最好,检出率均为100%。对来自我国17个省38个品种的116份田间葡萄样品检测结果表明,qRT-PCR共检测到10个样品为阳性,检出率略高于常规RT-PCR。     

应用实时荧光定量RT-PCR高效检测葡萄病毒B

 本研究建立了葡萄病毒B的 SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)检测技术。该技术标准曲线扩增效率102.4%,相关系数0.999,最低检测限达10^-4倍稀释cDNA,灵敏度为常规RT-PCR的100倍。重复性试验组内和组间变异系数分别为0.00%~0.65%和0.02%~2.00%,表明检测稳定性好。该技术对田间葡萄样品检测适用范围广,对枝条和老叶柄检测效果最好,冬季枝条和春夏秋季所有老叶柄样品检出率均为100%,与常规RT-PCR检测结果一致。对于其他季节或部位样品,RT-qPCR检出率(43% ~74%)则普遍高于常规RT-PCR(5% ~71%),特别是春季样品和春夏秋季所有嫩叶样品,检出率比常规RT-PCR分别高31% 和38%。对来自我国13个省21个品种的52份田间葡萄样品检测结果表明, RT-qPCR共检测到6个样品为阳性,检出率11.5%,为常规RT-PCR(检出率5.8%)的2倍。     

应用实时荧光定量RT-PCR高效检测葡萄病毒B

 本研究建立了葡萄病毒B的 SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)检测技术。该技术标准曲线扩增效率102.4%,相关系数0.999,最低检测限达10^-4倍稀释cDNA,灵敏度为常规RT-PCR的100倍。重复性试验组内和组间变异系数分别为0.00%~0.65%和0.02%~2.00%,表明检测稳定性好。该技术对田间葡萄样品检测适用范围广,对枝条和老叶柄检测效果最好,冬季枝条和春夏秋季所有老叶柄样品检出率均为100%,与常规RT-PCR检测结果一致。对于其他季节或部位样品,RT-qPCR检出率(43% ~74%)则普遍高于常规RT-PCR(5% ~71%),特别是春季样品和春夏秋季所有嫩叶样品,检出率比常规RT-PCR分别高31% 和38%。对来自我国13个省21个品种的52份田间葡萄样品检测结果表明, RT-qPCR共检测到6个样品为阳性,检出率11.5%,为常规RT-PCR(检出率5.8%)的2倍。     

番茄褐色皱果病毒SYBR GreenⅠ实时荧光RT-PCR检测方法的建立和应用

根据番茄褐色皱果病毒（tomato brown rugose fruit virus,ToBRFV）外壳蛋白（coat protein,CP）的保守基因序列设计1对特异性引物,建立了基于SYBR Green I的ToBRFV实时荧光RT-PCR检测方法,并对其进行了特异性、灵敏度检测,对自然感染ToBRFV的番茄、辣椒种子进行了检测验证。结果表明,构建的实时荧光RT-PCR检测ToBRFV阳性的番茄种子总RNA和重组质粒标准品的检测低限分别为0.2 ng/μL和50.0拷贝/μL,均为普通RT-PCR检测灵敏度的100倍;对番茄花叶病毒（tomato mosaic virus,ToMV）、番茄环斑病毒（tomato ringspot virus,ToRSV）、番茄黑环病毒（tomato black ring virus,TBRV）、番茄斑萎病毒（tomato spotted wilt virus,TSWV）、辣椒轻斑驳病毒（pepper mild mottle virus,PMMoV）、烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus,TMV）和烟草环斑病毒（tobacco ri...     

北京月季病原病毒的高通量测序鉴定和RT-PCR检测

本研究利用高通量测序技术对北京地区的月季染病样品进行了病毒鉴定,通过序列比对和拼接获得了李属坏死环斑病毒(prunus necrotic ringspot virus,PNRSV)、苹果茎沟病毒(apple stem grooving virus,ASGV)、柑橘碎叶病毒(citrus tatter leaf viru...     

番茄褪绿病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR方法

 根据番茄褪绿病毒(Tomato chlorosis virus, ToCV)热激蛋白70(Hsp70)的基因序列,设计ToCV实时荧光定量PCR特异引物。利用重组质粒ToCV-1为标准品建立SYBR Green I实时荧光定量方法。针对引物浓度、退火温度、特异性、灵敏度、重复性和稳定性进行系列优化。结果表明,最适退火温度为63℃,最适引物浓度为0.3 μmol·L^-1。熔解曲线为特异性单峰,表明其特异性良好。建立的SYBR Green I实时荧光定量PCR较常规PCR灵敏100倍,且具有良好的重复性和稳定性。基于SYBR Green I实时荧光定量PCR技术建立的ToCV检测方法,速度快、特异性强、灵敏度高、重复性好,可以用于ToCV的定量检测。     

菠萝凋萎相关病毒-1实时荧光定量RT-PCR检测体系的建立与应用

菠萝凋萎相关病毒-1( Pineapple mealybug wilt associated virus-1, PMWaV-1)是田间检出率最高的菠萝凋萎病毒。本研究根据PMWaV-1 CP基因保守序列设计特异性TaqMan探针和引物, 建立并优化了PMWaV-1实时荧光定量RT-PCR检测方法。优化后的反应体系制备的标准曲线为 y=-3.307×logx+38.18, 相关系数 r2为0.998。试验结果表明, 该方法能特异性地检测PMWaV-1, 对PMWaV-2、3和阴性对照均无反应; 最低检测限达到40拷贝。重复性试验表明批内和批间变异系数均小于1.98%, 是一种操作简便、特异性强、灵敏度高、重复性较好的PMWaV-1定量检测方法。样品检测结果表明PMWaV-1在菠萝植株老叶、嫩叶和吸芽中的病毒含量呈递减趋势。     

一种高效的苹果褪绿叶斑病毒TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法

为建立一种检测苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus,ACLSV)的Taq Man探针实时荧光定量RT-PCR方法,根据ACLSV外壳蛋白基因(coat protein,cp)保守序列设计了特异性引物和Taq Man探针,以构建的ACLSV-cp重组质粒为阳性标准品绘制标准曲线,并对该方法的特异性、灵敏性、重复性进行检验。结果显示,以ACLSV-cp重组质粒为标准品建立的标准曲线相关系数达0.999,扩增效率为103.7%;建立的Taq Man探针实时荧光定量RT-PCR方法特异性好,与苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus,ASGV)、苹果茎痘病毒(Apple stem pitting virus,ASPV)、苹果锈果类病毒(Apple scar skin viroid,ASSVd)均无交叉反应;灵敏度为100拷贝/μL,比常规RT-PCR高100倍;批内和批间变异系数均小于0.84%。表明Taq Man探针实时荧光定量RT-PCR方法具有特异性强、灵敏性高、重复性好的优点,适用于实际样品中ACLSV的快速准确检测。     

猕猴桃植株中柑橘叶斑驳病毒实时荧光定量PCR检测技术的建立及应用

 柑橘叶斑驳病毒(Citrus leaf blotch virus, CLBV)在陕西省栽培猕猴桃中发生普遍。为监测CLBV发生情况,本研究建立了CLBV的实时荧光定量PCR(Real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测方法。该方法特异性强,可准确检测目的病毒,标准曲线斜率为-3.378,决定系数R²=0.997 9,扩增效率为97.7%,比普通RT-PCR灵敏度高100倍,可用于猕猴桃植株CLBV的批量检测或低丰度病毒样本(如猕猴桃休眠枝条)的检测。为苗木携带CLBV病毒的早期诊断、果园病毒病预测预报和防控奠定了基础。     

实时荧光定量PCR技术在湖南油菜根肿病菌检测中的应用

为完善湖南油菜根肿病的监测预警体系, 分析油菜根肿病的发生与芸薹根肿菌休眠孢子量的关系, 防止湖南油菜根肿病进一步蔓延?本研究依据芸薹根肿菌ITS序列设计了一对特异性引物, 通过制备标准质粒构建了快速?精准的实时荧光定量PCR检测方法?其检测灵敏度为3×10-10 μg/μL, 比常规PCR 高100 倍; 利用建立的方法检测了来自湖南各地土壤样品中芸薹根肿菌的休眠孢子数量, 64份土样中的休眠孢子含量基本大于104个/g, 所检测的土样中孢子含量最高为2.22×107个/g?据实地调查, 当土壤中休眠孢子数量大于 104个/g 时, 油菜发生根肿病的风险较大, 休眠孢子含量较高的田块其发病程度也较为严重?结果表明, 建立的实时荧光定量PCR检测方法能对油菜根肿病进行早期诊断, 为湖南油菜根肿病发生的监测预警提供有效技术参考?