家蚕谷胱甘肽-S-转移酶研究进展

谷胱甘肽-S-转移酶在内外源有毒物质的代谢中起着重要作用。家蚕既是重要的经济昆虫,也是重要的模式生物。家蚕作为鳞翅目昆虫的模式生物,研究家蚕谷胱甘肽-S-转移酶,对于阐明谷胱甘肽-S-转移酶与杀虫剂抗性的关系,防治农林害虫有着重要的理论意义。本文就谷胱甘肽-S-转移酶在家蚕中的研究现状作了归纳,希望对今后谷胱甘肽-S-转移酶的研究能有所帮助。     

谷胱甘肽硫转移酶参与家蚕氟化物耐受性形成的研究

利用对氟化物高度敏感的家蚕品种733新和高度耐受性品种T6构建耐氟近等基因系,对回交15代的近等基因系群体从幼虫2龄眠起开始至4龄第3天连续添食200 mg/kg Na F溶液浸渍的桑叶,调查蚕体重要代谢酶类谷胱甘肽硫转移酶(glutathione S-transferase,GST)基因表达和酶活性的变化。解剖获取4龄3 d幼虫中肠组织进行双向电泳分析的结果显示,近等基因系群体中耐氟个体中肠的GST表达量比敏感个体明显上调。进一步利用实时荧光定量PCR检测GST基因在耐氟个体与敏感个体中肠、血淋巴、脂肪体和马氏管中的相对表达量,并对5龄1~6 d幼虫中肠、血淋巴中的GST酶活力进行测定。结果表明,家蚕对氟化物的抵抗力可能与体内GST酶活力的强弱有关,由于受氟化物刺激的诱导,可能导致GST基因表达水平发生了变化。研究结果为进一步探索家蚕耐氟机制提供了有用信息。     

氟化物添食对家蚕耐氟品种和敏感品种5龄幼虫体内蛋白质及谷胱甘肽硫转移酶含量的影响

为探明家蚕耐氟化物机理,以家蚕耐氟品种T6和敏感品种734为材料,通过人工添食NaF的方法测定了其血液与中肠组织蛋白质及谷胱甘肽硫转移酶（GSTs）的活力.结果表明：随着NaF添食浓度的增加,敏感品种734血液蛋白质浓度低于耐氟品种T6血液蛋白质浓度,而两者中肠组织的蛋白质浓度无明显差异.敏感品种734血液及中肠组织的GSTs酶活力呈现幅度较大的波动;耐氟品种T6血液中的GSTs酶活力呈现上升趋势,中肠组织的GSTs酶活力波动的幅度较小.由此可见,耐氟家蚕品种能够在氟化物的调控下提高体内GSTs的含量,推测其为耐氟家蚕品种具有氟化物抗性的原因之一.     

家蚕和蓖麻蚕的γ-谷氨酰环化转移酶的组织分布及其活性动态

γ-谷氨酰环化转移酶(Y-GCT)催化γ-L-谷氨酰-L-氨基酸转换成5-氧-L-脯氨酸和L-氨基酸。当用γ-L-〔~(14)C〕-谷氨酰-α-L-氨基丁酸为该酶的底物时,观察到γ-GCT广泛分布于家蚕和蓖麻蚕的中肠、马氏管,后丝腙,脂肪体和体壁等组织中。家蚕各组织的γ-GCT在五龄中期均出现活力峰;并在白蛹期,脂肪体和体壁的γ-GCT突出地再现活力峰。这些结果表明,蚕体的γ-GCT的组织分布和活力变化,蚕体的γ-谷氨酰转肽酶和5-氧-L-脯氨酸酶存在相应关系,蚕体各主要组织细胞,将能通过这三种酶的联合作用吸收和传递氨基酸。     

二化性家蚕滞育过程中谷胱甘肽S-转移酶活性的变化

二化性家蚕卵以25℃和15℃催青,可分别诱导成虫产下子代滞育和非滞育卵,而即时浸酸和5℃左右的低温处理可以分别阻止和解除胚胎滞育。利用1-氯-2,4-二硝基苯(CDNB)显色法测定了经上述处理后的胚胎滞育过程中谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase,GST)的活性,结果表明:胚胎发育后期的蚕卵经25℃催青,卵中的GST活性显著高于15℃催青蚕卵;蚕卵即时浸酸未显著改变胚胎滞育发动阶段蚕卵中的GST活性;5℃低温处理显著提高了滞育卵中的GST活性,但是未能显著改变即时浸酸卵的GST活性。上述结果表明,蚕卵中的GST活性变化与二化性家蚕胚胎滞育诱导和解除密切相关。     

SO2对家蚕血淋巴中谷胱甘肽含量及相关酶活性的影响

通过分析在SO2胁迫下家蚕5龄幼虫血淋巴中谷胱甘肽(GSH)含量及相关酶活性的变化,探讨SO2对家蚕的毒理作用机制。当对家蚕5龄幼虫每天以40 mg/m3SO2熏气刺激6 h,蚕体血淋巴中的GSH含量显著降低,雄蚕GSH的平均含量为49.8μmol/L,雌蚕为41.0μmol/L,分别为对照的73.80%和55.76%,而谷胱甘肽硫-转移酶(GST)活性显著升高,雄蚕GST的平均活性为31.86 U/L,雌蚕为31.80 U/L,分别高于对照46.15%和27.30%。与此同时,γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT)活性在蚕体中也有不同程度的升高,其中在雄蚕体内的变化极为显著;谷胱甘肽过氧化酶(GSH-Px)和谷胱甘肽合成酶系的活性在蚕体内均无显著变化。以上结果表明:SO2刺激可对家蚕血淋巴中的GSH含量及其相关酶的活性产生影响,且雌、雄蚕对SO2的敏感性不同;GSH含量的减少及其相关酶活性的上升,说明SO2对蚕体的毒害作用与其降低蚕体抗氧化物质水平、削弱抗氧化防御系统有关。     

桑螟触角中谷胱甘肽硫转移酶基因的鉴定及组织表达谱分析

桑螟(Glyphodes pyloalis)是桑树的主要害虫,严重危害各蚕桑主产区的桑叶产量。从桑螟触角转录组数据库中共鉴定出15个谷胱甘肽硫转移酶(GST)基因。序列分析显示,这些基因均具有完整的开放阅读框,与其他鳞翅目昆虫的GST基因具有高度的相似性,其中8个GST基因具有谷胱甘肽结合域。系统进化树显示这些GST基因分别归属于GST的6个亚类。荧光定量PCR结果表明,GpGST-D1在雌、雄成虫触角中高度特异性表达,推测可能参与桑螟触角中气味降解过程。GpGST-O1和GpGST-O2在雌成虫触角中的表达量高于其他组织,GpGST-D3在雌成虫腹部的表达量最高,但在触角中的表达量与雄成虫无显著差异。除GpGST-D3外,10个GpGST(GpGST-D2、GpGST-D4、GpGST-E1、GpGST-E2、GpGST-E3、GpGST-T1、GpGST-Z1、GpGST-S1、GpGST-S2、GpGST-S3)在桑螟成虫腹部的表达量也高于其他组织,但呈现出性别差异。研究结果为深入了解桑螟嗅觉感受行为的分子机制提供了基础,也为研发新型桑螟防治手段提供了参考。     

家蚕谷胱甘肽-S-转移酶基因(BmGSTd1)的诱导表达定量分析

谷胱甘肽-S-转移酶(GST)在机体的解毒代谢和抗氧化中起重要作用。为探究家蚕谷胱甘肽-S-转移酶基因(BmGSTd1)在家蚕体内的解毒和抗性功能,采用实时荧光定量PCR方法,对BmGSTd1基因在正常饲养及添食NaF家蚕5龄幼虫不同组织中的转录水平进行检测,并采用家蚕Actin3、GAPDH、28S rRNA 3种内参照基因对检测结果进行归一化处理。BmGSTd1基因在家蚕5龄幼虫各组织的转录水平存在差异,且采用不同内参照基因结果不一致:分别以家蚕Actin3、GAPDH、28S rRNA基因为内参照,该基因转录水平最高的组织分别为中肠、丝腺、脂肪体。5龄第2天幼虫添食NaF对体内各组织中BmGSTd1基因的转录水平具有诱导作用,且在不同组织中诱导表达的情况不同,采用以上3种内参照基因进行归一化处理的结果数据表明,中肠和脂肪体组织中的诱导转录水平最高,可能与这2种组织是家蚕主要的解毒器官有关。研究认为,检测基因在不同组织中的转录水平,采用合适的内参照基因对保证检测结果的可靠性非常重要。     

家蚕谷胱甘肽-S-转移酶E4基因的组织表达和序列特征及重组蛋白的酶活性分析

昆虫体内的谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)主要行使对异生或内源有毒物质进行代谢解毒的功能。选择家蚕谷胱甘肽-S-转移酶E4的编码基因Bmgste4为靶标,研究其组织表达谱、序列结构特征及原核表达重组蛋白的酶活性。RT-PCR检测不同组织表达特征的结果显示,Bmgste4基因在家蚕5龄第3天幼虫的头部、触角、下颚须、表皮、脂肪体、丝腺以及雄性个体的马氏管和雌性个体的卵巢中均有表达,而在血细胞、中肠以及雄性个体的精巢和雌性个体的马氏管中不表达。多序列比对结果显示BmGSTE4具有完整和保守的GST二级结构特征,N端氨基酸残基保守,特别是谷胱甘肽结合位点。构建插入Bmgste4基因开放阅读框片段的重组表达质粒p28-Bmgste4,并转化E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞进行原核表达后,利用分光光度法测定重组蛋白对通用底物1-氯-2,4-二硝基苯的酶活参数:Km=0.58 mmol/L,Vmax=24.55μmol/(mg.min)。这些结果为进一步研究家蚕体内解毒和抗药性机制以及开发鳞翅目害虫新型生物防治药剂提供了基础信息。     

家蚕γ-谷氨酰环化转移酶的纯化及其性质的研究

首次从家蚕(Bombyx mori L.)蛹体脂肪织织及真皮细胞分离得到催化丫-L-谷氨酰-2-L-氨基丁酸反应生成吡咯烷酮羧酸和2-L-氨基丁酸的Y-谷氨酰环化转移酶。并采用硫酸铵沉淀、葡聚糖G-75柱层析、DEAE-纤维素DE_(32)柱层析和羟基磷灰石柱层析等步骤,将该酶提纯了1,285倍。高度纯化后的酶,对Y-L-谷氨酰-2-L-氨基丁酸具有最适pH7.2-7.4,最适酶反应温度为47℃,米氏常数(Km)为0.04M。在分离纯化过程中未发现蚕体内有该酶的同功酶存在,纯化后的酶溶解于pH8.0、0.01M的Tris—HCl缓冲掖中,-30℃经过一个月没有发现明显的失活现象,但在4℃中一个月后丧失活性76％。     

微粒子病家蚕中肠组织蛋白质的变化

用浓度为104spores/mL、106spores/mL和108spores/mL的家蚕微孢子虫孢子2mL分别感染三组4龄起蚕(每组100条),另设一组作为空白对照。分别于5龄起蚕饷食后第48h、96h和144h解剖获取中肠组织,提取中肠组织蛋白质进行SDS-PAGE电泳。SDS-PAGE结果显示感染后的不同时间,家蚕中肠组织蛋白质出现了不同的变化,并且某些蛋白的变化与感染的浓度呈相关性     

家蚕γ-谷氨酰转肽酶和谷胱甘肽的研究

膜结合的γ-谷氨酰转肽酶(γ-GTP),广泛地分布于家蚕的中肠、马氏管、脂防体、体壁、后丝腺和脑组织中,马氏管和中肠的酶活力较高.产丝量较高的品种苏6×苏5,中肠γ-GTP活力也较高,各品种中肠γ-GTP活力峰均在5龄中期.大部分必需氨基酸是该酶很好的氨基酸受体,但谷氨酰胺等几种氨基酸明显抑制该酶活力.蚕中肠组织的GSH含量变化与γ-GTP活力变化有关.γ-GTP活力较高的苏6×苏5品种,其中肠GSH浓度也较高.以上结果反映出,家蚕中肠γ-GTP和GSH在吸收氨基酸,尤其是必需氨基酸中起重要作用.     

家蚕丝素基因表达水平的定量分析

采用实时定量RT-PCR方法,对丝素轻链基因(fib-L)、丝素重链基因(fib-H)、P25基因在家蚕幼虫不同组织和不同发育时期的表达进行了定量分析。结果发现3种丝素基因除主要在5龄幼虫的后部丝腺中表达外,在其它组织如脂肪体和中部丝腺中也有一定程度的表达;在4龄眠期的后部丝腺中3种丝素基因也有一定的表达水平,其中fib-L在这一时期的表达量较高。同时发现在5龄第3天和第5天的后部丝腺中,fib-H、fib-L与P25在mR-NA水平上的摩尔比分别为9∶18∶1和19∶32∶1,推测丝素基因的表达可能具有转录后调控,此结果说明家蚕丝素基因的表达可能具有更加精细的调控机制。     

家蚕雌蛾体中雌二醇含量的影响因素研究

用放射免疫法研究了家蚕雌蛾体中雌二醇(estradiol,E2)含量在品种、蛾龄、饲养季节间的变化规律等。结果表明:家蚕雌蛾体富含雌二醇,其含量在蚕品种间存在显著差异,在供试的17个品种中,雌蛾体内E2含量相差2.34倍;在刚羽化至自然死亡的不同蛾龄间,随蛾龄增大,E2含量逐渐增加,至自然死亡前一天达最高值,死亡后又下降;不同饲养季节间雌蛾体的E2含量是春蚕蛾>秋蚕蛾>夏蚕蛾;交配对雌蛾体的E2含量无明显影响。     

家蚕体内叶酸的存在形态和转换代谢

采用高效液相色谱 (high performanceliquidchromatography ,HPLC)技术 ,探讨了家蚕体内叶酸化合物的存在形态和转换代谢途径。用添加蝶酰谷氨酸 (pteroylglutamicacid ,PteGlu)的人工合成饲料饲育 5龄幼虫 ,其体内叶酸的主要存在型 ,血淋巴为PteGlu ;血淋巴以外的组织为四氢叶酸 (H4PteGlu)。脂肪体是H4PteGlu的主要储存场所。叶酸转换代谢酶的检索分析结果也证实家蚕缺乏哺乳动物体内的 5 ,10 亚甲四氢叶酸 ( 5 ,10 CH2 H4PteGlu)→ 5 甲基四氢叶酸 ( 5 CH3 H4PteGlu)→H4PteGlu转换途径。家蚕体内叶酸代谢方式简单 ,推测主要和核酸合成系、丝氨酸 /甘氨酸转换系相联系     

肠球菌在家蚕消化道中的分布

用ＡＰＩ２０ ＳＴＲＥＰ（Ｖ５０） 系统对从健康家蚕消化道来源的８９ 株肠球菌菌株进行数值分类学研究的结果表明：在分离菌株中分布着Ｅｎｔ．ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ、Ｅｎｔ．ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅｎｔ．ａｖｉｕｍ 、Ｅｎｔ．ｄｕｒａｎｓ 和Ｅｎｔ．ｇａｌｌｉ ｎａｒｕｍ 等菌种，其分布频率分别为３２６ ％ 、２５９％ 、１５７ ％ 、３４ ％ 和２２ ％ 。其余１８ 个菌株未能被该系统所分类。Ｅｎｔ．ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ 和Ｅｎｔ．ｆａｅｃａｌｉｓ 是家蚕消化道内的主要肠球菌菌丛。Ｅｎｔ．ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ 在５ 龄初和末的分布频率较高，Ｅｎｔ．ｆａｅｃａｌｉｓ 在５ 龄第４ 和第５ 天的分布频率较高。     

家蚕变态期酚氧化酶原基因PPO1的表达谱分析

酚氧化酶在昆虫的变态发育和免疫防御机制中起着非常重要的作用。利用GenBank上登录的家蚕酚氧化酶原基因PPO1的cDNA序列设计正反向特异引物,通过半定量反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测了家蚕变态期(从5龄第3天到化蛾)雌、雄个体酚氧化酶原基因PPO1的转录活性。家蚕雌性变态期的PPO1基因仅在5龄第4天和上蔟第0、12、24、36、48、60小时及第3、4、5、6、8、10天有表达,其中上蔟第48小时和上蔟第3天的表达量最高;而在雄性家蚕变态期,该基因仅在5龄第4、5、6天及上蔟第36、48小时与第3、5、9、10天和蛾期有表达,其中上蔟第5天的表达量最高。家蚕PPO1基因的转录表达具有时空特异性,推测其在家蚕雌、雄个体变态发育的不同时期中执行不同的功能。     

家蚕胚胎发育相关基因的分析(英文)

在家蚕基因组中检索分析了与果蝇86个胚胎发育相关基因同源的基因。分析结果表明,在果蝇的这86个基因中,有62(72%)个基因在家蚕基因组中存在直向同源关系,其中58(67%)个基因并且在家蚕、果蝇、冈比亚按蚊3种昆虫的基因组间呈现1∶1∶1直向同源关系。通过比较分析发现,体节极性决定基因在3种昆虫基因组间最为保守。同果蝇和冈比亚按蚊相比,家蚕中决定背-腹部形成的基因分化最大。进一步利用芯片数据对其中的12个母性基因在家蚕5龄第3天幼虫生殖腺中的表达情况进行分析:有2个基因(orb和nanos)在卵巢中特异表达;4个基因(spire、Ras85D、gd和arrest)在精巢中特异表达;另外的6个基因(exuperantia、vasa、pumilio、mago nashi、nudel和dorsal)在精巢和卵巢中均有表达,但是其中的2个基因(pumilio和nudel)在雌、雄间的表达量存在显著差异。研究结果为家蚕发育调控机制的进一步研究提供了重要线索和数据信息。     

家蚕胚胎发育过程的组织形态学研究

家蚕胚胎发育过程的组织形态学研究对家蚕胚胎发育研究具有重要作用。将不同发育时期的家蚕卵经软化卵壳后进行石蜡切片和HE染色观察,获得了家蚕胚盘形成、胚带形成、中胚层分化、头胸部突起明显、腹部突起显现、反转前、反转时、反转后和器官形成等典型胚胎发育时期的形态图片;用连续切片技术观察到了类原始生殖细胞存在于中胚层突起处。