对位红抗原合成和多克隆抗体的制备

制备了一种特异性强的抗对位红的多克隆抗体。采用混合酸酐法将活化的对位红半抗原与阳离子化牛血清白蛋白（cBSA）偶联成免疫原,免疫大白兔制备多克隆抗体,利用紫外分光光度计分析结合物的结合情况,间接ELISA和间接竞争ELISA分析抗体特性。紫外扫描分析的免疫原对位红与蛋白结合的偶联率为14:1,间接竞争ELISA法分析多克隆抗体效价达到1×106,50%抑制率检测限为7.43 ng/mL,检测的对位红线性范围在0.1 ng/mL～1μg/mL,抗体与对位红和苏丹红I交叉反应率分别为100%和97.8%,与苏丹红II、III、IV和甲苯胺红的交叉反应率很低,与罗丹明类色素无交叉反应。制备的对位红多克隆抗体具有很高的特异性,与其他色素交叉反应率低,可用于对位红在食品中残留的检测。     

上海地区虾源弧菌分离鉴定及分子分型研究

为了进一步了解上海市凡纳滨对虾主养区虾源弧菌的分布特征以及主要种属的分子基因型特征,为本地区虾的弧菌病的流行调查、防控治疗提供依据。本研究采用选择性培养基筛选和全自动细菌鉴定仪鉴定的方法,对不同时间,不同池塘的虾源弧菌进行分离鉴定,总共分离到52株不同来源的弧菌,其中30株副溶血弧菌(57.7%),9株拟态弧菌(17.3%),7株创伤弧菌(13.5%),4株溶藻弧菌(7.7%),1株霍乱弧菌(1.9%)以及1株河流弧菌(1.9%)。调查结果显示,上海地区虾源弧菌以副溶血弧菌为主。进而对30副溶血弧菌株副溶血弧菌进行分子分型研究,EIRC-PCR指纹图谱显示基因型存在多态性,每个分离株的基因扩增条带数介于4~8之间,大小都在250~4500 bp之间;聚类分析分为5个亚群,其中Ⅰ亚群15株(50%),Ⅱ亚群6株(20%),Ⅲ亚群6株(20%),Ⅳ亚群2株(6.7%),Ⅴ亚群(3.3%)。结果表明,上海地区虾源副溶血弧菌存在一种主要流行亚群,对生产中药物筛选及疫苗研制具有一定的参考价值。     

马铃薯卷叶病毒与S病毒重组双CP多克隆抗体的制备

为了制备出马铃薯卷叶病毒(PLRV)与S病毒(PVS)重组双CP多克隆抗体并用于PLRV与PVS这2种病毒的间接与DAS-ELISA检测,构建了PLRV与PVS融合双CP基因的原核表达载体pET22b-LRCP/SCP,用超声破碎法代替溶菌酶法裂解重组菌BL21(pET22b-LRCP/SCP)并提取菌体蛋白,用镍离子亲和层析纯化获得了分子质量为51.2 ku的高纯度的重组双CP。用该重组双CP作抗原免疫家兔获得了高效价(1∶128 k)抗血清。纯化的重组双CP多克隆抗体与PLRV或PVS阳性标准物特异性结合,与另外4种马铃薯主要病毒(PVX、PVY、PVA与PVM)无交叉反应。间接ELISA反应中,稀释度为1∶3 200的重组双CP多克隆抗体与PLRV或PVS阳性物都呈现阳性反应;在DAS-ELISA反应中,稀释度均为1∶100的重组双CP多克隆抗体及其碱性磷酸酶标记物与PLRV或PVS的阳性标准物也分别呈现阳性反应。结果表明,制备的重组双CP抗体既可用于PLRV与PVS这2种病毒的间接ELISA检测,也可用于DAS-ELISA检测。     

新城疫病毒HN蛋白单克隆抗体的制备及其抗原捕捉ELISA方法的建立

为建立一种快速的新城疫病毒病原检测方法。本研究以原核表达的重组HN蛋白免疫7周龄BALB/c雌鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,经间接ELISA方法筛选,成功获得了1株能稳定分泌抗新城疫病毒HN蛋白的McAb杂交瘤细胞,命名为4E8,4E8亚类鉴定为重链属于IgG2a,轻链属于κ链。以多克隆抗体作为包被抗体、单克隆抗体4E8作为检测抗体,通过双抗夹心ELISA各个反应条件的优化,建立检测新城疫病毒抗原捕捉ELISA方法。该方法对EDSV、ITLV、IBV、IBDV不发生交叉反应,其敏感性比HA试验要高4倍以上,与RT-PCR相比较,符合率、敏感性和特异性分别为95.6%、93.3%、96.1%。本研究建立的NDV AC-ELISA有良好的重复性、敏感性和特异性,可应用于新城疫病毒感染的早期诊断。     

棉花黄萎病菌毒素结合位点初探

以纯化的棉花黄萎病菌毒素(PLPC)免疫新西兰白兔制备了PLPC特异性抗血清。将PLPC(15μg·ml 1)用不同浓度的抗体(1～20μg·ml 1IgG)吸附后处理泗棉3号的切根苗,毒素所引起的症状都有不同程度的减轻。表明所制备的抗体在与毒素发生特异性免疫学反应的同时,可部分封闭毒素分子上与毒素受体结合的位点。利用竞争ELISA测定了泗棉3号幼苗子叶的质膜制剂与PLPC的结合活性。结果表明,质膜制剂与毒素结合后能部分阻断毒素与其抗体的免疫学反应,即质膜制剂中含有毒素的结合位点。分别用胰蛋白酶和煮沸处理质膜制剂后,质膜制剂对毒素与其抗体的反应的抑制作用消失,初步表明质膜制剂中与毒素结合的是蛋白质。     

β-激动剂多组分残留的酶免疫分析方法

制备并筛选能和多种β-激动剂反应的簇特异性抗体,建立能同时检测多种药物的酶免疫分析方法,为研制多组分残留检测试剂盒奠定基础。选取沙丁胺醇、克伦特罗和多巴胺3种代表性β-受体激动剂,分别与钥孔血蓝蛋白（KLH）偶联作为免疫抗原,与牛血清白蛋白（BSA）偶联作为检测抗原,免疫家兔获取抗血清,ELISA检测抗血清交叉反应率,筛选交叉反应性最大的抗体作为簇特异性抗体,用于建立ELISA方法并制作标准曲线。经测定获得的3种抗血清,其中的抗沙丁胺醇抗血清除对沙丁胺醇具有100%的反应之外,还对克伦特罗具有128%的交叉反应性,具有部分簇特异性。用沙丁胺醇抗血清建立了同时适用于沙丁胺醇和克伦特罗的ELISA分析方法,为多组分残留检测试剂盒的研制奠定了基础。     

稻瘟病菌一假定α-甘露糖苷酶多克隆抗体的制备及应用

摘要：【研究目的】为检测α-甘露糖苷酶的表达及其可能的功能,制备了稻瘟病菌一假定α-甘露糖苷酶多克隆抗体,并探索其可能应用。【方法】将与-His标签融合的过量表达一假定α-甘露糖苷酶蛋白的稻瘟病菌转化子,在液体完全培养基中培养,收集其上清液,经Ni2+-NTA亲和柱纯化后,得到可溶的融合蛋白α-甘露糖苷酶-His。【结果】纯化后的融合蛋白免疫新西兰兔,得到抗α-甘露糖苷酶蛋白的多克隆抗体,ELISA检测结果表明抗体效价达1：51200,特异性高。利用该多克隆抗体以ELISA方法检测并Western验证分析稻瘟病菌30个田间菌株培养液α-甘露糖苷酶的表达量。【结论】不同菌株α-甘露糖苷酶表达量有明显差异。进一步分析表明,菌株70-15接种水稻后,不同时期α-甘露糖苷酶的表达量差异明显。菌株间致病型等生物学和生理学差异可能与α-甘露糖苷酶表达的差异有关。     

黄曲霉毒素B1检测ELISA条件的优化

采用黄曲霉毒素B1与牛血清白蛋白偶联物(AFB1—BSA)抗原免疫Balb/C小鼠获得特异性抗体。以AFB1—STI为检测抗原,利用此抗体,进行间接竞争ELISA法试验。通过正交实验确定了最佳抗原包被反应质量浓度为1.0μg/mL;最佳抗原包被条件为:4℃过夜,一抗和酶标二抗IgG—HRP;最佳稀释度为1∶200000和1∶5000。在此优化条件下制备的抗体检测黄曲霉毒素B1具有很高的特异性和灵敏性,具有实际应用价值。     

间接ELISA法检测棉子携带黄萎病菌新方法

以棉花黄萎病菌Bp2培养液中毒素蛋白免疫BALB/C小白鼠制备抗血清,建立了可特异性检测棉花黄萎病菌的间接ELISA方法。所制备的毒蛋白抗血清效价为1∶204800,对毒蛋白的最低检测量达7.81μg.L-1。可以与江苏省各地采集到的棉花黄萎病菌的培养液发生特异性反应,而与其它致病菌培养液反应呈阴性。用该方法对81份江苏省抽样的棉子进行检测,12份呈阳性反应。取检测为阳性反应的这些棉子培养液针刺接种棉苗也全都发病。这些结果表明所建立的间接ELISA方法可用于棉子携带黄萎病菌的快速检测。     

棉花黄萎病菌毒素ELISA检测方法的建立及其应用

以纯化的棉花黄萎病菌毒素(PLPC)免疫新西兰白兔制备了PLPC特异性抗血清,建立了可特异性检测棉花黄萎病菌毒素的A蛋白双抗体夹心ELISA方法。应用建立的ELISA方法测定了病菌培养滤液、人工接种幼苗和大田病株不同组织中的毒素,结果表明:不同产毒能力菌株(VD 8和VD-5)在25℃下振荡培养3d后就能在培养滤液中检测到毒素,这比生物测定要早2～3d。将VD-8菌株的孢子以灌根方式接种泗棉3号幼苗5d后,就能从接种幼苗的茎杆和叶柄中检测到毒素,这比幼苗自然发病显症要早3～5d。在测定的30份大田病株茎杆、叶柄、叶脉样品中,阳性样品率为100%。这些结果表明建立的ELISA方法可用于菌株产毒能力的测定和大田棉花黄萎病的早期诊断。     

鱼肠道弧菌疫苗制备及免疫保护效果

本文比较了不同灭活剂及灭活条件对鱼肠道弧菌（Vibrio ichthyoenteri）的灭活效果,确定以0.4%（v/v）福尔马林溶液在25℃下处理30h作为疫苗的最佳灭活条件,用灭活的鱼肠道弧菌疫苗免疫大菱鲆并测定了该疫苗针对鱼肠道弧菌、溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）、副溶血弧菌（Vibrio prarhaemolyticus）、鳗弧菌（Vibrio anguillarium）等的免疫保护力,结果表明,采用注射免疫方式接种后,针对鱼肠道弧菌的免疫保护率达75%;溶藻弧菌免疫保护率为67.6%;鳗弧菌免疫保护率为50%;副溶血弧菌免疫保护率为57.2%;采用浸浴免疫方式接种后,疫苗针对鱼肠道弧菌、溶藻弧菌、鳗弧菌、副溶血弧菌的免疫保护力分别为25%、22.3％、11.1%、12.5%。     

不同条件下副溶血弧菌对墨吉明对虾致病性研究

为研究墨吉明对虾的弧菌病防控措施,通过人工注射感染的方式,研究不同数量副溶血弧菌及在不同温度、盐度、pH、不同硝酸氮、亚硝酸氮和氨氮浓度条件下副溶血弧菌对墨吉明对虾的致病性的影响。结果表明：当人工感染副溶血弧菌数量为3.92×10⁶ CFU以上时,24 h内对虾累计死亡率100%,副溶血弧菌数量为3.92×10⁵ CFU时,24 h对虾累计死亡率为50%。温度为32℃时,对虾累计死亡率最高,在一定范围内,随着温度的升高对虾累计死亡率升高。在温度为(24±1)℃时,盐度为10‰时对虾的死亡率最高,盐度为30‰次之,盐度为20‰时最低;在温度为(24±1)℃,盐度为(22±1)‰时,对虾累计死亡率pH 9时最高,pH 7时次之,pH 8时最低;温度为(24±1)℃,盐度为(22±1)‰,硝酸氮浓度为30.0 mg/L时,对虾累计死亡率最高,浓度为20.0 mg/L时次之,浓度为10.0 mg/L时最低;亚硝酸氮浓度为10.0 mg/L时死亡率最高,5.0 mg/L时死亡率次之,1.0 mg/L时死亡率最低;氨氮浓度为1.5 mg/L时死亡率最高, 1.0 mg/L时死亡率次之,0.5 mg/L时死亡率最低。实验证实：当副溶血弧菌数量为3.92×10⁵ CFU以上和数量为3.92×10⁴ CFU爆发72 h之后,弧菌病难以控制;在26~32℃范围内,随着温度的升高对虾累计死亡率升高;盐度与pH对墨吉明对虾的致病性可能与噬菌体有关;硝酸氮对感染副溶血弧菌的墨吉明对虾有胁迫作用;一定范围内亚硝酸氮浓度(1.0~10.0 mg/L)、氨氮浓度(0.5~1.5 mg/L)越高,副溶血弧菌对墨吉明对虾的致病性的影响越强,对虾累计死亡率越高。该试验为墨吉明对虾的弧菌病防控提供了坚实的基础。     

产耐热直接相关溶血素的副溶血性弧菌PCR检测及其表型分析

运用PCR技术成功建立了检测产耐热直接相关溶血素(TRH)的副溶血性弧菌的方法,并应用该方法从1株标准株和其他3种不同来源的37株副溶血性弧菌中的13株扩增出0.5 kb的trh基因特异性扩增带;产TRH的副溶血性弧菌中1株标准株,12株分离自腹泻病人排泄物或呕吐物,1株分离自水产动物养殖用水;并且产TRH与尿素酶阳性的副溶血性弧菌菌株之间的具有一一对应的关系,结果认定尿素酶阳性是产TRH的副溶血性弧菌菌株的表现型。     

溶藻弧菌HY9901转运蛋白TolB的原核表达及条件优化和纯化

为研究溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus) HY9901转运蛋白TolB作为疫苗候选抗原的可能性,根据已发表的溶藻弧菌HY9901转运蛋白TolB序列(JQ846501),设计1对带酶切位点的引物,PCR扩增tolB基因,然后经酶切、连接等步骤,构建tolB基因的原核表达载体pET-TolB,并对其IPTG浓度、诱导时间、温度、洗脱浓度进行优化,以期获得较大量的目的蛋白。结果表明：IPTG诱导后经SDS-PAGE与Western-blot分析,成功表达了溶藻弧菌HY9901株TolB蛋白,分子量与预期相符,且表达的蛋白以包涵体的形式存在;TolB蛋白在大肠杆菌中诱导表达的优化条件为：0.2 mmol/L IPTG,37℃诱导4 h;最佳咪唑洗脱浓度为400 mmol/L。这些结果为进一步研究目的蛋白的免疫原性和疫苗制备奠定基础。     

脱硫石膏对乔木树种抗盐生理特性影响的研究

为了研究脱硫石膏提供的外源钙化合物对乔木树种耐盐性生理影响,本试验利用新疆阜康电厂脱硫石膏,研究外源钙化合物对4个树种(长枝榆、白榆、大叶白蜡、紫穗槐)的耐盐性、植物生理特性的影响。结果表明:施用脱硫石膏后,加快了林木生长,提高了林木的存活率、耐盐指数;增加了叶片中叶绿素a、叶绿素b、脯氨酸的含量和K+离子的吸收能力,但是却降低Na+离子的吸收。因此推测,外源钙化合物通过影响植物叶绿素和脯氨酸含量、调节植物体内K~+/Na~+的平衡,增加植物的抗盐性。     

南美白对虾养殖系统中弧菌为主的致病菌群的分子比较

弧菌是最常见、最重要的细菌性病原菌,采用16 S rDNA克隆文库法对南美白对虾(Litopenaeus vannarnei)养殖系统中水体和底泥的弧菌为主的致病群落的组成进行分析研究。从水体和底泥16 S rDNA克隆文库中各随机挑选55个克隆子进行测序(约114 bp),对测序结果进行了BLAST比对。结果表明:水体样品有16个OTU,主要Vibrio(弧菌,33.3%)、Chloroflexi(绿屈挠菌,18.5%)和Pantoea(泛菌属菌,7.41%);底泥样品有14个OTU,主要是Vibrio(弧菌,50.0%)和Chloroflexi(绿屈挠菌,13.6%);2个文库比较来看,proteobacterium(变形细菌)仅在水体样品中,Aeromonas(气单胞菌)仅在底泥样品中。用MEGA 4从测序的克隆子中选出30个OTU进行系统发育分析。     

苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白CryIA单克隆抗体的制备及在转Bt基因棉毒蛋白检测上的应用

用苏云金杆菌菌株HD-1和HD-73分别发酵培养制备了孢晶混合物，孢晶混合物经分离、纯化、电泳得到CryIA、CryIA(c)杀虫晶体蛋白。用CryIA和CryIA(c)分别免疫家兔制备了两种多抗。用CryIA免疫小鼠，经细胞杂交、融合、克隆后筛选出4个单克隆株系A4F5F11、B4E6C7、B4E6D8、B4F5G11。用CryIA(c)多抗包被，B4E6D8上清液作为夹心抗体成功地建立了双抗夹心 ELISA，并检测了中棉所30、NUCOTN33B蕾期叶片中毒蛋白的含量，结果分别为23．4ng·g-1 FW、24．7ng·g-1 FW。     

A major quantitative trait locus for resistance to Turnip Yellows Virus (TuYV, syn. beet western yellows virus, BWYV) in rapeseed

Turnip yellows virus (TuYV) is responsible for a recognizable loss of yield in European winter oilseed rape cultivation. To map genes involved in TuYV resistance, a double haploid population was established by crossing a resynthesized rapeseed line (R54) as donor for TuYV resistance with an elite rapeseed line (‘Express’). Resistance was determined with 10 plants per line by double antibody sandwich‐enzyme‐linked immunosorbent assay. After screening 17 primer combinations (Pstl/Msel and EcoRI/Msel), 143 amplified fragment length polymorphism markers were mapped to 20 linkage groups representing 15 chromosomes of the rapeseed genome. Quantitative trait loci (QTL) were mapped using the composite interval mapping approach. As a result, one major quantitative trait locus was found on linkage group MS17, explaining up to 50% of the phenotypic variation. Because no other factors displaying a significant effect on the expression of resistance could be identified, a simple mode of inheritance for TuYV resistance is suggested, thus enabling marker‐assisted selection during rapeseed breeding.     

免疫增强剂对仿刺参肠道微生物的影响

为了探讨肠道微生物和免疫增强剂的相互作用、拓展免疫增强剂的评价效果,通过植物源免疫增强剂党参来研究仿刺参肠道微生物的特性及其代谢能力变化。从摄食免疫增强剂党参后的健康仿刺参肠道中分离纯化优势菌株,经16S rDNA进行鉴定;以仿刺参“腐皮综合症”致病菌灿烂弧菌(Vibrio splendidus)为指示菌,采用十字交叉和纸片法进行体外拮抗试验,优势菌株进行生理生化特性分析,肠道内容物进行代谢能力分析。结果表明,筛选优化菌株共18株,系交替假单胞菌属、芽胞杆菌属、希瓦氏菌属、不动杆菌属、弧菌属等不同菌属;拮抗试验筛选优势菌株共4株,通过分泌酶等活性物质产生空间竞争,同时产生抑制灿烂弧菌的胞外产物,发生协同抑菌效果;4株优势菌株具有不同的底物特异性,通过透明圈观察其蛋白酶和淀粉酶活性较高,氧化酶、蔗糖、赖氨酸酶试验表现了不同的生化性质;且经党参投喂后仿刺参肠道微生物菌群代谢能力提高。总结,植物源免疫增强剂党参可调控、优化仿刺参肠道微生物特性,提高肠道代谢力,间接提高机体免疫力。