(S)-β-没药烯合酶N端截短对其功能的影响

【目的】探究(S)-β-没药烯合酶N端截短对其功能的影响。【方法】在截短处设计引物,引物引入限制性内切酶酶切位点,PCR产物经双酶切,连接到相应载体,经大肠杆菌Rosetta菌株表达,亲和层析纯化蛋白后蛋白酶切去融合标签,高分辨质谱测定蛋白分子量。体外催化产物经GC-FID/MS分析产物变化,Malachite Green无机磷酸含量法测定表观Kcat。【结果】截短10、20、30、40个氨基酸融合蛋白表达及纯化成功,GCFID分析结果表明去标签的不同长度截短的酶催化主产物均为没药烯,显示活性没有丧失;随着N端截短氨基酸数目的增多,表观Kcat稍有变化。截短60个氨基酸的融合蛋白His-N60表达成功,但亲和层析失败,取表达的上清蛋白体外催化,结果显示无倍半萜合酶活性。【结论】N端截短40个氨基酸不影响其产物特异性和活性。此结果和其他报道不一致,显示不同的倍半萜合酶N端的作用可能不同。     

296位氨基酸位阻效应影响黄花蒿没药醇合酶环化反应的起始

【目的】探究黄花蒿没药醇合酶第296位氨基酸突变抑制环化反应的机制。【方法】利用Quik Change?Multi Site-Directed Mutagenesis的方法将黄花蒿没药醇合酶的296位氨基酸残基由苏氨酸突变成异亮氨酸。原核表达,蛋白纯化后测定其催化特异性。【结果】黄花蒿没药醇合酶T296I体外催化(2E,6E)-法尼基焦磷酸主产物为非环化的法尼烯;但是将T296I蛋白与中间体(3R,6E)-橙花叔醇焦磷酸一起孵育时可生成环化的主产物α-bisabolol,野生型酶的天然产物。【结论】黄花蒿没药醇合酶T296I点突变进一步证明氨基酸残基的空间体积和立体化学是自然环化反应起始的控制关键,其位阻效应能够抑制法尼基焦磷酸向橙花叔醇焦磷酸转化。     

灵芝倍半萜合酶基因的克隆及表达

倍半萜合酶是倍半萜化合物生物合成途径中的关键酶。本试验从灵芝基因组数据库中筛选出1个编码灵芝萜类合酶的基因,并对其进行克隆及表达。序列分析表明,该基因开放阅读框的长度为1041bp,编码346个氨基酸;成功构建了1个灵芝萜类合酶基因的原核表达载体,并完成了该基因编码的倍半萜合酶在大肠杆菌中的可溶性表达;顶空固相微萃取—气相色谱质谱法分析结果表明重组的灵芝萜类合酶具有催化活性。为后续研究萜类化合物的多样性奠定基础。     

岷江百合单萜合酶基因克隆与表达分析

以岷江百合花被片为材料,通过RT-PCR方法,克隆单萜合酶基因,命名为LreTPS.该基因包含1770 bp的开放阅读框,编码590个氨基酸,编码蛋白质分子质量为68.18 ku,等电点为5.77.LreTPS编码的蛋白含有单萜合酶蛋白特有的DDXXD、RRX8W保守基序,氨基酸序列N端含有一段转运肽,与其他植物的单萜合酶基因蛋白同源性为40%-50%.系统进化树分析表明,LreTPS基因属于TPS-b亚家族.荧光定量表达结果表明,LreTPS在岷江百合花被片中表达量最高,其次在叶片中,在雄蕊与柱头中微量表达.     

利用VIGS技术研究广藿香醇合酶基因PatPTS的功能

广藿香精油主要存贮在植物地上组织的盾状腺毛中。提取广藿香（马来西亚品系）叶片的总RNA后,通过PCR技术扩增得到广藿香醇合酶基因（PatPTS）的全长cDNA序列,共编码552个氨基酸,与GenBank中已报道的印度广藿香中广藿香醇合酶的氨基酸序列存在3.6%的差异。使用烟草脆裂病毒（tobacco rattle virus,TRV）,选取PatPTS作为沉默目的基因,在广藿香中构建病毒诱导基因沉默（VIGS）体系,进一步利用该体系在广藿香中鉴定PatPTS基因的功能。病毒侵染广藿香叶片后,分别选取不同的时间点,使用GS-MS与qRT-PCR检测PatPTS催化产物和转录水平的变化,结果发现：β-广藿香烯、β-榄香烯、石竹烯、广藿香醇等倍半萜成分的含量在VIGS侵染后第2周明显下降,1周和3周效果不明显;PatPTS转录本下降趋势与其调控的倍半萜含量变化趋势类似;表明PatPTS基因负责了广藿香精油主要倍半萜成分的合成。说明广藿香中VIGS体系已初步建立,并在侵染植物2周后诱导基因沉默和干扰次生代谢产物合成的效果最好,为在广藿香中快速研究基因功能打下基础。     

植物三萜皂苷生物合成及关键酶鲨烯合酶的研究进展

三萜皂苷(triterpenoid saponins)是一类重要的植物次生代谢产物,有抗菌和抗虫害的作用,可用作药物,具有重要的商业价值.三萜皂苷含量和组成的变化又取决于三萜皂苷合成途径中的一些关键酶及其在细胞中的表达水平.鲨烯合酶(Squalene syntase,SS)是三萜皂苷生物合成的第一个关键酶,其含量和活性决定了后续产物的产量.因而若能在分子水平上实现对SS的调控,将为人工大量生产三萜皂苷提供可能.全文综述了三萜皂苷的生物合成途径及该途径的关键SS的研究进展.     

黄花蒿法呢基焦磷酸合酶、紫穗槐二烯合酶双功能酶基因的构建、原核表达与功能鉴定

试验将青蒿素生物合成途径中催化两步连续反应的酶(法呢基焦磷酸合酶和紫穗槐二烯合酶)的基因进行融合,经大肠杆菌表达后鉴定其融合蛋白的功能。结果表明:融合蛋白具有了双功能酶活性。双功能酶基因的构建,为进一步将双功能酶基因转入黄花蒿,提高青蒿素含量奠定了基础。     

嗜热革节孢内切葡聚糖酶EGⅠ中精氨酸Arg7的功能分析

本研究将嗜热革节孢GH45家族内切葡聚糖酶EGⅠ中的底物结合位点精氨酸Arg7进行饱和突变,测定其性质、动力学参数的变化,以期分析精氨酸Arg7的功能。结果表明,与原酶相比,突变酶R7A的K_m有所下降,R7P的k_(cat)显著性提高,但突变酶的k_(cat)/K_m均显著性降低。原酶的最适反应温度为50℃,突变酶R7C、R7P和R7V的则为40℃,其余突变酶的均为50℃。原酶于70℃下处理2 h具有61%的活性,相同处理条件下,突变酶R7F、R7H仍具有70%以上的活性,说明其热稳定性明显提高,R7A仅有20%的活性,剩余突变酶均有40%左右的活性。原酶的反应最适pH值为5. 0,而突变酶R7C的为6. 0,剩余突变酶的均为5. 0。本试验探究了精氨酸Arg7饱和突变后嗜热革节孢GH45家族内切葡聚糖酶的性质变化,可为GH45家族进一步的分子改造和功能研究提供参考。     

芪合酶基因的研究进展与应用现状

芪类化合物是一种重要的植物抗毒素,因其具有多种医疗保健作用,已引起多方关注。芪合酶是芪类化合物生物合成途径中的关键酶,关于它的研究已广泛开展。本文对芪类化合物的生物合成途径、药理作用,芪合酶的结构、功能,以及芪合酶基因的表达、芪合酶的基因工程研究等方面的进展进行综述,以期为进一步深入研究提供重要信息和科学参考。     

细菌Ⅲ型聚酮合酶研究进展

Ⅲ型聚酮合酶（PKS）被认为是结构最简单的聚酮合酶,这一类酶广泛存在于植物细菌和真菌中。随着基因组学的发展,细菌中Ⅲ型聚酮合酶引起越来越多的关注。Ⅲ型聚酮合酶在不同细菌中表现出不同的功能,其产物的结构和生物学活性也各不相同。对细菌Ⅲ型聚酮合酶的生物工程学改造也一直是研究的热点。综述了目前已经完成功能鉴定的细菌Ⅲ型聚酮合酶的研究进展,按照细菌Ⅲ型聚酮合酶产物的不同将其分为五类,并分别论述了各类细菌Ⅲ型聚酮合酶的结构、功能以及特点,对深入研究不同细菌Ⅲ型聚酮合酶以及进行生物工程学改造具有重要意义。     

水稻和稗草ALS活性测定及农美利选择性机理研究

乙酰乳酸合成酶（ＡＬＳ）是除草剂主要作用靶标,新型除草剂农美利（ｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ－ｓｏｄｉｕｍ）即是通过抑制ＡＬＳ的活性使支链氨基酸的生物合成受阻而达到除草目的。作者利用ＡＬＳ脱羧产物３－羟基丁酮与肌酸及甲萘酚形成的复合物,采用比色法测定ＡＬＳ活性和农美利的抑制作用,以明确农美利对水稻和稗草的选择性机理。研究结果表明,水稻和稗草体内ＡＬＳ酶促反应复合产物的吸收峰为５２０ｎｍ;ＡＬＳ活性在不同水稻品种和不同杂划体内各不相同,不同水稻品种依次为汕优６３、秀水１１〉样湖８４〈嘉育２９３,不同杂草依次为稗草、鳢肠〉异型莎草〉千金子。体内法测定农美利对植物体内ＡＬＳ的抑制程度结果显示,水稻ＡＬＳ受抑制快于稗草,恢复也快;不同水稻品种ＡＬＳ以嘉育２９３受抑制较快,秀水１１抑制程度较大,而祥湖８４和汕优６３受抑制慢且程度     

次郎柿ACC合成酶的转基因工艺研究

为获得抗软化的转基因柿果,初步建立了次郎柿转基因工艺。预培养时间为4 d;菌液OD600值为0.5,侵染时间10 min;共培养时间3 d;壮观霉素适宜浓度为30 mg/L。在此条件下,获得了次郎柿ACC合成酶的RNA干扰基因转基因苗。经PCR检测,得到8个转基因植株。     

葡萄白藜芦醇合酶基因转化水稻的研究

将来源于2个葡萄品种的白藜芦醇合酶基因以组成型表达的强启动子Ubiquitin驱动,并利用农杆菌介导的遗传转化引入粳稻品种中花11中。通过对单拷贝转基因家系基因表达量及白藜芦醇目标物的检测,发现大多数转基因家系的外源基因可稳定表达,但检测到的最终产物不是白藜芦醇,而是白藜芦醇苷(亦称云杉新苷),最高检出量达到了10.26μg/g,是野生型对照的1 000倍,推测这是在生成白藜芦醇的基础上,水稻内源的糖基转移酶作用的结果。虽然经抗病检测发现转基因植株并没有对稻瘟病菌表现出明显抗性,但是高含量的云杉新苷转基因家系可以作为提升水稻潜在营养价值的材料进行使用。     

拟南芥纤维素合酶的抗体制备与检测

将拟南芥CesA家族基因的高变区克隆到融合表达载体pGEX-4T-3中,构建重组质粒pGEX-AtCe-sAs,在大肠杆菌JM109中经IPTG诱导表达谷胱甘肽巯基转移酶融合蛋白(GST-AtCESAs)。采用GST亲和层析法纯化GST-AtCESAs并制备了多克隆抗体。Western-blotting检测表明,抗体Anti-CESA4和Anti-CE-SA7存在明显的交叉反应,Anti-CESA1、Anti-CESA3、Anti-CESA6、Anti-CESA2、Anti-CESA5、Anti-CESA8均能在拟南芥原生质膜上检测到特异免疫条带,这为进一步深入研究拟南芥纤维素合成机制提供了有利条件。     

玉米大斑病菌聚酮体合成酶基因 StPKS 功能分析

 【目的】利用RNA干扰技术初步探讨玉米大斑病菌聚酮体合成酶基因（StPKS）的功能。【方法】本试验将玉米大斑病菌StPKS基因片段连接到pSilent-1载体中,构建StPKS基因的RNA干扰载体pSilent-StPKS1-2。通过聚乙二醇介导的方法转入玉米大斑病菌野生型菌株01-23的原生质体,利用潮霉素筛选得到转化子,采用半定量RT-PCR方法分析转化子StPKS基因的表达情况,显微观察转化子与野生型菌丝形态的差异。【结果】本研究构建的StPKS基因RNA干扰载体对沉默该基因表达是有效的,经潮霉素抗性筛选,得到了30株阳性转化子,对其中5株黑色素积累下降、菌落颜色变浅的转化子进行了半定量PCR分析发现,5株转化子的StPKS基因表达量均有所下降;显微观察发现5株转化子的菌丝形态很不规则,发生了膨大、变形、分枝等现象。【结论】StPKS基因在DHN黑色素合成途径中起作用,其表达量下降会减少黑色素的产生,试验同时发现该基因与菌丝形态密切相关。     

绿竹与毛竹纤维素合成酶(CesA)的生物信息学分析

纤维素是竹细胞壁的主要组成成份,其存在形式--小微纤丝是由纤维素合成酶(CesA)催化作用得到的36根β-1,4糖苷链结晶而成.以GeneBank数据库中已登陆的完整竹类蛋白序列为分析对象,对其进行系统进化、物理性质、跨膜结构和二级结构的生物信息学分析.结果表明:(1)绿竹和毛竹CesA与水稻CesA具有较高同源性;(...     

R(-)-苄霜灵的合成研究

N (2 ,6二甲苯基 )丙氨酸甲酯经皂化反应后获得N (2 ,6二甲苯基 )丙氨酸。在甲苯和石油醚混合溶剂中 ,用R (+)或S (- )α甲基苄胺作为拆分剂与N (2 ,6二甲苯基 )丙氨酸反应 ,在不同的温度条件下 ,根据结晶速度不同 ,分别获得R (+)或S (- )N (2 ,6二甲苯基 )丙氨酸的非对映体盐。非对映体盐用 10 0g·L-1NaOH水解 ,10 0g·L-1HCl酸化 ,制得旋光性的N (2 ,6二甲苯基 )丙氨酸后用甲醇酯化 ,获得旋光性N (2 ,6二甲苯基 )丙氨酸甲酯。苯乙酰氯与旋光性N (2 ,6二甲苯基 )丙氨酸甲酯缩合 ,最终生成R (- )苄霜灵     

脱落酸(Abscisic acid, ABA)对映异构体的生物活性比较

 采用新方法精制脱落酸(ABA)异构体试样,改变以往靠光学离析法分离racemic型(SR)-(±)-ABA,提高了(S)-(+)-ABA与(R)-(-)-ABA两镜像体纯度。抑制生长试验和残留量分析结果表明:天然型(S)-(+)-ABA活性,显着高于非天然型(R)-(-)-ABA或(SR)-(±)-ABA活性。抑制莴苣种子发芽50%的活性强度(S)-(+)-ABA约是(R)-(-)-ABA的5倍,(SR)-(±)-ABA介于二者之间。抑制萝卜下胚轴生长试验,最显着有效期2～6天,(6天后差异渐小,8日甚微),生理作用期约为一周,(S)-(+)-ABA活性是(R)-(-)-ABA的3.6倍。差异原因可能是两异构体分子立体结构不同所致。     

Ri质粒介导fps基因对烟草的转化及表达

为了探讨外源fps基因表达对发状根合成抗菌物质能力的影响,将含有薄荷(Mentha spicata L.)fps基因的双元表达载体质粒,通过冻融法转化到发根农杆菌菌株Ar1334中,转化菌株与烟草叶圆片共培养诱导发状根产生,共获得18个稳定的发状根无性系,在附加20 mg·L-1卡那霉素的MS培养基上,筛选到4个生长旺盛的无性系.经PCR扩增得到大小为1 kb的目的片段,PCR-Southern检测表明外源fps基因已整合到烟草发状根的基因组中,Northern blot检测证明外源fps基因在转录水平进行了表达;酶活分析显示转基因发状根株系中FPS酶活性明显高于对照,抑菌试验也发现转基因发状根汁液对赤星病菌具有较高水平的抗性,表明外源fps基因在发状根中的表达有利于抗菌物质的合成与积累.     

烟草肌醇半乳糖苷合成酶基因NtGolS1的克隆及序列分析

为从烟草中克隆到与植物抗逆相关的肌醇半乳糖苷合成酶基因GolS,以辣椒GolS基因为探针,通过电子克隆法从烟草栽培品种K326中分离出一条编码GolS基因的cDNA序列,暂被命名为NtGolS1.NtGolS1包含一个完整的开放读码框,编码343个氨基酸,具备糖基转移酶保守结构域;序列比对结果表明,NtGolS1蛋白与其他植物的GolS蛋白具有很高的相似性;系统进化树分析表明,NtGolS1与耐旱植物维柯萨的Gols亲缘关系最近.这些结果为进一步研究NtGolS1的性质和功能,并为植物抗逆基因工程研究提供理论基础