水稻成熟胚盾片诱导愈伤组织再生体系的建立

采用水稻成熟胚盾片诱导愈伤组织作为分化再生的外植体，通过优化激素组合和调节培养基渗透压，建立了适合水稻遗传转化的高效再生体系，将水稻成熟胚诱导愈伤组织分化再生的过程划分为3个不同时期，即成熟胚盾片愈伤组织诱导，胚性细胞诱导保持，胚性愈伤组织分化再生，以CultureI(LS 2,4-D2.0mg/L)诱导成熟胚盾片愈伤组织，愈伤组织剥离后接种于Culture II-3(LS 2,4-D 2.5mg/L 山梨醇3g/L)上诱导胚性愈伤组织，继代后接种于Culture Ⅲ-2(MS NAA 0.5mg/L 6-BA 1.0mg/L Kinetin 2.0mg/L 山梨醇8g／L）上分化成苗，培养结果表明，该再生体系所获得的胚性愈伤组织分化再生率均在60％－80％之间，利用本研究建立的高效再生体系建立水稻外源基因遗传转化系统，使转化过程中所得转化愈伤组织高效再生成苗，从而顺利获得转化植株，可以提高水稻外源基因转化的效率，为水稻品种的定向遗传改良提供优良的遗传转化技术体系。     

小麦成熟胚诱导胚性愈伤组织的影响因素

为加快小麦成熟胚在转基因研究中的利用,以陕麦159成熟胚为外植体,通过胚性愈伤组织诱导,建立了一套有效的小麦愈伤组织诱导体系。研究表明,不同消毒处理、2,4-D浓度和接种方法对胚性愈伤出愈率的影响有极显著差异,不同浸种时间和培养基类型对胚性愈伤组织出愈率的影响无显著差异。采用次氯酸钠初次消毒20min,升汞二次消毒5min,消毒彻底,对种子损害较小;浸种时间18～20h易于成熟胚的剥取,且诱导的愈伤组织质量较好;MS培养基较1/2MS培养基诱导愈伤组织效果好,MS培养基2,4-D浓度为4mg.L-1时（30g蔗糖＋7g琼脂）胚性愈伤组织率最高,愈伤组织质量较好;完整胚诱导胚性愈伤组织率最高达84.17%,碎胚诱导胚性愈伤组织率最高达94.17%。     

不同小麦成熟胚对愈伤组织形成及萌发的影响

为了解决小麦成熟胚离体培养过程中脱分化较为困难的问题,对2001-2003年不同时期收获及不同保存条件下的小麦品种川农17、川农12号成熟胚分别在六种诱导培养基中进行离体培养,结果表明,2002年成熟胚形成愈伤组织的能力和萌发能力高于2001年的成熟胚;2003年4月27日与5月13日收获的两批成熟胚(包括在室温26 2℃和低温4℃下存放)在形成愈伤组织及愈伤组织的分化能力方面没有显著差异,但2003年5月13日收获的成熟胚在诱导培养基中直接萌发成苗的能力更强。4℃存放虽然促进早期(4月27日)收获的成熟胚在诱导培养基中直接萌发成苗,但对各时期收获的成熟胚形成愈伤组织的能力没有影响;高浓度2,4-D(6 mg／L和8 mg／L)抑制胚萌发,但KT(0.5 mg／L)可以促进胚萌发。     

几个籼稻品种的成熟胚愈伤组织植株再生体系的建立

组织培养技术在作物改良上的成功应用需要合适的植株再生体系。本试验以7个籼稻成熟胚为材料，通过优化激素配比，建立适合于水稻遗传转化的高频植株再生体系。研究结果表明，NB 2mg／L2，4-D适合于供试品种的成熟胚愈伤组织的诱导，诱导率达90％以上；在分化培养基中添加3．0-3．5mg／L KT，0．5～1．0mg／L NAA和5．0mg／L ABA的激素配比，明恢81、N175、航1号的最高分化率分别达72．7％、80．0％和78．0％；移栽成活95％以上。     

成熟胚愈伤诱导及再生条件优化

采用三因素随机区组设计,研究不同基因型、培养基种类及2,4-D处理浓度对成熟胚愈伤诱导率的影响。结果表明,影响玉米成熟胚胚性愈伤组织诱导的主要因素是基因型,且基因型、培养基和2,4-D处理对岀愈率影响效果差异达到显著或极显著水平,除初级愈伤三因素互作不显著外,任意两因素或三因素之间的互作效应显著。丹988的最佳培养组合为MN+2,4-2mg/L;铁7922最佳培养组合为MS+2,4-D 2mg/L。添加1mg/L的KT有利于愈伤组织分化。     

水稻愈伤组织生长和衰老过程中信息大分子化合物的变化

 水稻愈伤组织转移继代培养后的0—20天,生长速率较快,核酸和蛋白质含量急剧增加,且维持较高水平,核糖核酸酶和血红蛋白水解酶活性急剧下降,且维持较低活性。因此,愈伤组织的继代培养时间最好掌握在生长速率较快,核酸蛋白质含量较高、水解酶类活性较低的阶段,即在20天以内。核酸和蛋白质含量与其水解酶类(核糖核酸酶和血红蛋白水解酶)的比活之间存在着密切的关系,从而认为核糖核酸酶和血红蛋白水解酶分别在核酸和蛋白质含量下降中起着积极作用。根据信息大分子化合物的变化动态和愈伤组织外部形态变化提出愈伤组织转移继代培养过程可以分为三个阶段,即旺盛生长、稳定生长和衰老阶段。     

裸燕麦胚性愈伤组织诱导及植株再生能力的研究

裸燕麦成熟胚在ＩＮ６培养基上诱导并继代所形成的是白色、瘤状、外软内硬、易分化植株的非松脆型愈伤组织．当在ＩＭ１—ＩＭ４培养基上进行循环式调控培养时，经７—８个月，初始愈伤组织状态转变为浅黄色、小颗粒状、生活力强的松脆型胚性愈伤组织，有效地减缓了愈伤组织经长期继代过程中生活力的衰退，并能稳定地维持胚性愈伤组织达９５％以上．对植株再生能力测定表明，调控的胚性愈伤组织具有较强的分化潜力，维持时间可达２年以上．     

水稻愈伤组织中脱落酸特异诱导蛋白的纯化及分析

用硫酸铵分级沉淀、离子交换（DEAE Sepharose和TSK gel）的方法,结合SDS PAGE和2D电泳（two dimension electrophoresis）技术,从水稻愈伤组织中分离并精制了两个分子量相同（24.5 kD）, 等电点分别为61和6.9的脱落酸（ABA）特异诱导蛋白。Western blot印迹分析发现,这两个蛋白在不同组织中的表达差异明显。A1（pI 6.1）蛋白在ABA处理的水稻愈伤组织和种子胚中表达,但在未经ABA处理的材料(包括幼芽、愈伤组织)和白色干燥性愈伤组织中没有检测到表达;A2（pI 6.9）蛋白在经ABA处理材料、种胚和白色干燥性愈伤组织中检测到表达,在未经ABA处理的材料中没有检测到表达。推测这两个蛋白可能在胚（或不定胚）的形成过程中起重要作用。     

农杆菌介导小麦成熟胚愈伤组织的遗传转化研究

为建立和优化小麦成熟胚愈伤组织遗传转化体系,以筛选出的适合小麦成熟胚组织培养再生的普通小麦山农2618为材料,采用农杆菌介导法对其成熟胚愈伤组织进行转化,对影响转化效率的因素如侵染菌液的浓度、侵染时间、超声波处理、真空处理等进行了研究.结果表明,这些因素对小麦成熟胚遗传转化效率有很大影响.菌液侵染浓度OD600为0.8、侵染时间为60 min时转化效率最高.在此基础上辅以超声波处理、真空处理可明显提高转化效率,最高转化率可达8.1%.对转化愈伤组织和转化植株分别进行GUS染色和PCR检测,结果表明外源基因已整合到小麦基因组中.     

水稻OsWRKY89基因启动子的表达特性

利用PCR技术从粳稻品种秀水11中扩增了转录因子WRKY89编码区5′上游大小为1470 bp的调控序列,命名为OsW89p,将它与GUS基因融合,构建植物表达载体。用农杆菌介导法将载体转化水稻,GUS组织化学分析结果表明,OsW89p驱动的GUS基因在转基因植株各个时期的叶、茎和叶鞘中均有表达;在花器的外稃和花药中有活性而在花粉和成熟种子中均无活性;种子萌发时在胚中有活性;2.5叶期时在种子根、不定根和侧根中均有活性但根尖中无活性,5叶期时根部只有侧根中有活性。分析了GUS在T1代苗期时的诱导表达特性,GUS荧光测定结果表明：1) GUS的表达被茉莉酸甲酯增强,诱导倍数是4.0,被2,4 D抑制,水杨酸对OsW89p的表达几乎没有影响;2) 用NaCl和PEG这2种非生物因子处理转基因苗根部,根中GUS的表达被抑制,但叶片中可被诱导增强;3) GUS的表达可被紫外线照射、高温(42℃)、低温(5℃)和伤处理这4种非生物逆境因子增强,其中以紫外线照射处理的诱导倍数最高。     

水稻精细胞优势表达基因RSG6启动子的克隆及表达

利用已知的[i]RSG6[/i]基因序列和GenBank中提供的[i]RSG6[/i]前导序列设计引物,通过基因组DNA的PCR扩增得到长度为1 408 bp和1 173 bp的两个[i]RSG6[/i]启动子片段PB、PS,测定序列分析发现,PB、PS分别位于水稻第10和第4染色体上,PB、PS序列之间具有较高的同源性,且都含有大量的启动子元件。通过设计带有酶切位点的引物扩增出PB和PS的各两条缺失片段PB1、PB2、PS1、PS2,与质粒pBI221连接后得到中间载体pBI221 PB1、pBI221 PB2、pBI221 PS1、pBI221 PS2,再与质粒pBIN19连接构建出双元表达载体pBIN GUSB1、pBIN GUSB2、pBIN GUSS1、pBIN GUSS2,转化农杆菌EHA105,感染烟草叶片和烟草花粉,瞬时表达显示缺失片段PB1、PB2、PS1、PS2均具有启动子功能,且PB1、PS1的启动效率较PB2、PS2高。     

水稻异淀粉酶基因ISA1及其启动子的表达特性分析

 利用实时定量RT-PCR方法研究了水稻异淀粉酶基因ISA1在各组织及不同发育阶段籽粒中的表达模式,结果表明该基因只在发育籽粒中表达。同时,克隆了ISA1基因起始密码子上游1.1 kb和2.1 kb两个不同长度的启动子片段,并分别与GUS报告基因融合,经农杆菌介导转入水稻中。对转基因水稻植株中GUS活性的定性与定量结果表明,2.1 kb的ISA1启动子具有很好的胚乳表达特异性,与内源基因定量表达分析的结果一致;而1.1 kb的ISA1启动子则不具备该表达特性,它在胚乳、茎、茎节及谷壳中都有很高的表达。这可能是因为 2.1 kb启动子中含有抑制目的基因在茎等组织或器官中表达的顺式作用元件。     

水稻谷蛋白基因GluB-6的cDNA克隆及表达

根据已克隆谷蛋白基因的保守氨基酸序列搜索基因组数据库,获得与之高度同源的水稻基因组序列,通过生物软件进行基因预测和验证,用RT PCR法克隆得到1个新的谷蛋白基因的cDNA克隆。核酸序列分析和体外表达结果表明,该基因cDNA序列全长为1517 bp,含有1个编码495个氨基酸残基的开放阅读框（ORF）,推导的氨基酸序列与谷蛋白基因家族的相似性介于53.6%~82.8%,并与B亚族谷蛋白基因的同源性更高,因此命名为GluB 6（GenBank注册号AY429651）。Northern杂交显示,GluB 6基因具有高度的胚乳表达特性。     

外源木聚糖酶基因atx在水稻中的表达

 为通过在转基因植株中表达木聚糖酶来提高木聚糖酶的生产效率,将具有较高热稳定性和催化活性的杂合木聚糖酶基因atx连接到双元表达载体pCAMBIA1301上,成功构建了木聚糖酶植物表达载体atx Ru3ep 1301。然后以水稻成熟胚的愈伤组织作为转化受体,采用农杆菌介导法将木聚糖酶基因导入水稻(中花11)中。经过潮霉素抗性检测和PCR鉴定,证实目的基因已经整合到转基因水稻基因组中。RT PCR分析结果显示,外源木聚糖酶基因能够在CaMV 35S启动子的引导下在转基因水稻中正常转录。转基因水稻能够正常生长和繁殖。木聚糖酶活性分析表明,转基因植株最高木聚糖酶活性约为4.37 U/g（鲜叶片）。因此,利用转基因水稻生产木聚糖酶将会是一种经济、有效的方法。     

水稻OsF-box基因表达的初步研究

为研究水稻中OsF-box基因的功能,构建了该基因的RNAi表达载体转化水稻日本晴,通过PCR、Southern-blot鉴定出阳性植株.与野生型植株相比,阳性植株抽穗期延迟,且在进入生殖生长期后出现很多高位分蘖.进一步克隆了OsF-box基因的启动子序列,构建与GUS报告基因融合表达载体转化水稻,染色结果表明,该基因在水稻茎秆和花药部位有明显的表达,而根和叶片中没有检测到明显的表达活性.     

水稻蛋白激酶基因启动子OsSRLp的分离及特性分析

【目的】为研究水稻中I型酪蛋白激酶基因OsSRL启动子的结构及功能,【方法】以水稻中花11基因组DNA为模板,经PCR扩增获得基因上游约1600 bp序列,命名为启动子OsSRLp。应用PLACE在线软件,分析序列中的顺式作用元件,同时构建含有GUS报告基因的植物表达载体,转化水稻。【结果】OsSRL为组成型表达,OsSRLp含有调控生殖发育、激素应答及逆境响应等多种顺式作用元件。OsSRLp驱动的GUS报告基因在根、茎中均有所表达,在小穗中表达丰度较高,而在其他组织中表达丰度较低。【结论】OsSRLp为组成型启动子,其下游调控基因OsSRL可能参与水稻发育及生殖过程。     

抑制水稻隐花色素基因OsCRY1a表达对水稻农艺性状的影响

 利用已公布的OsCRY1a基因的序列设计引物,扩增部分基因片段,构建RNAi植物表达载体并转化水稻,导致该基因表达水平下降和功能缺失。根据转基因植株重要农艺性状的表现,分析该基因的功能。结果表明,抑制OsCRY1a基因的表达,水稻开花期推迟16 d,株高和粒长明显增加,而其他重要农艺性状如剑叶长、宽和穗长等无明显变化。     

水稻抗感纹枯病品种Ospgip1基因的表达特征

 从水稻基因组DNA中扩增出1 184 bp的Ospgip1基因片段。该片段包含930 bp的完整开放阅读框,终止密码子为TAA,无内含子。RT PCR结果表明,Ospgip1基因在水稻抗、感纹枯病品种中均能表达,但不同生育期、不同部位表达量有差异。实时PCR结果显示,抗病品种YSBR1和中感品种Jasmine 85中Ospgip1的表达量要明显高于感病品种Lemont;稻苗黄化处理后,无论是抗病品种还是感病品种的Ospgip1表达量均显著提高;纹枯病菌侵染使得抗病品种Ospgip1表达量大大增加,而对感病品种影响不大。     

Effects of Suppressing OsCRY1a Gene Expression on Rice Agronomic Traits

Using primers designed according to the published sequence of rice OsCRY1a gene,we obtained part of the gene fragment by PCR and constructed an RNA interference expression vector with it.To down-regulate the expression level of the gene or lead to the loss-of-function of the gene,the vector was then introduced into rice via Agrobacterium-mediated transformation.Based on the performance of the transgenic plants,the functions of the gene were analyzed and deduced.The results indicated that suppressing the expression of the gene retarded flowering for 16 d in rice with the plant height and grain length significantly increasing whereas other important agronomic traits observed remained unchanged apparently.