谷氧还蛋白(AbGrx-1)对水稻干尖线虫在氧化胁迫下的保护作用

【目的】谷氧还蛋白(glutaredoxin, Grx)作为一种抗氧化酶，在通过清除多余活性氧来维持生物细胞氧化还原平衡、降低细胞膜损伤过程中发挥重要作用。水稻干尖线虫(Aphelenchoides besseyi)能在高温、渗透及氧化胁迫等多种逆境压力中存活。本研究旨在探究Grx在水稻干尖线虫抗氧化胁迫中的作用。【方法】通过cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends, RACE)，获得了一个水稻干尖线虫谷氧还蛋白基因AbGrx-1，进行了序列比对和遗传进化分析；通过qRT-PCR检测了AbGrx-1在线虫响应氧化和温度胁迫中的表达差异，通过原核表达获得了AbGrx-1的重组蛋白，并分析了AbGrx-1蛋白浸泡对水稻干尖线虫在氧化和高温胁迫下存活的影响。【结果】AbGrx-1基因全长包括90 bp的5＇非翻译区(UTR)、321 bp的编码区和97 bp的3＇UTR，开发阅读框(横跨91至411位)编码106个氨基酸。AbGrx-1蛋白的第24至27位点具有谷氧还蛋白催化残基(CPYC)，分别在第69至第72和第83至第86位点存在保守的谷胱甘肽结合位点RSVP和GGDD，归为Ⅰ类谷氧还蛋白。遗传进化树显示AbGrx-1与燕麦真滑刃线虫(Aphelenchus avenae)Grx亲缘关系最近，位于同一进化分支。AbGrx-1在H2O2处理和12℃下时显著上调表达，但在0℃, 4℃, 37℃和45℃极端温度中下调表达。高浓度H2O2和高温导致水稻干尖线虫死亡率增加，AbGrx-1重组蛋白能显著提高暴露于高浓度H2O2中线虫的存活率，但不影响高温下线虫的存活率。【结论】AbGrx-1参与调控水稻干尖线虫的抗氧化免疫反应，在抵抗氧化损伤、维持线虫生存方面具有重要功能。     

谷氧还蛋白(AbGrx-1)对水稻干尖线虫在氧化胁迫下的保护作用

目的 谷氧还蛋白(glutaredoxin, Grx)作为一种抗氧化酶,在通过清除多余活性氧来维持生物细胞氧化还原平衡、降低细胞膜损伤过程中发挥重要作用。水稻干尖线虫(Aphelenchoides besseyi)能在高温、渗透及氧化胁迫等多种逆境压力中存活。本研究旨在探究Grx在水稻干尖线虫抗氧化胁迫中的作用。方法 通过cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends, RACE),获得了一个水稻干尖线虫谷氧还蛋白基因AbGrx-1,进行了序列比对和遗传进化分析;通过qRT-PCR检测了AbGrx-1在线虫响应氧化和温度胁迫中的表达差异,通过原核表达获得了AbGrx-1的重组蛋白,并分析了AbGrx-1蛋白浸泡对水稻干尖线虫在氧化和高温胁迫下存活的影响。结果 AbGrx-1基因全长包括90 bp的5＇非翻译区(UTR)、321 bp的编码区和97 bp的3＇UTR,开发阅读框(横跨91至411位)编码106个氨基酸。AbGrx-1蛋白的第24至27位点具有谷氧还蛋白催化残基(CPYC),分别在第69至第72和第83至第86位点存在保守的谷胱甘肽结合位点RSVP和GGDD,归为Ⅰ类谷氧还蛋白。遗传进化树显示AbGrx-1与燕麦真滑刃线虫(Aphelenchus avenae)Grx亲缘关系最近,位于同一进化分支。AbGrx-1在H₂O₂处理和12℃下时显著上调表达,但在0℃, 4℃, 37℃和45℃极端温度中下调表达。高浓度H₂O₂和高温导致水稻干尖线虫死亡率增加,AbGrx-1重组蛋白能显著提高暴露于高浓度H₂O₂中线虫的存活率,但不影响高温下线虫的存活率。结论 AbGrx-1参与调控水稻干尖线虫的抗氧化免疫反应,在抵抗氧化损伤、维持线虫生存方面具有重要功能。     

水稻干尖线虫的环介导恒温扩增技术(LAMP)快速检测方法

【目的】本研究旨在为水稻干尖线虫(Aphelenchoides besseyi Christie,1942)的快速检测鉴定和早期诊断提供一个新的检测方法。【方法】利用水稻干尖线虫18S核糖体RNA基因,设计了水稻干尖线虫LAMP的特异引物,该引物包括1对外引物、1对内引物和1对环引物,以LAMP特异引物对待测样品DNA进行恒温扩增,扩增产物通过电泳法和荧光染料法进行检测,电泳检测出现阶梯状条带或加入荧光染料显现绿色荧光,则证明待检样品中含有水稻干尖线虫。【结果】本方法可以检测鉴定水稻干尖线虫不同虫态(雌虫、雄虫、幼虫或卵)的个体,可以从多种线虫混合的样品和植物组织样品中直接检测出水稻干尖线虫,检测灵敏度达到1/1000条虫DNA。【结论】本检测方法具有准确、灵敏、稳定和结果直观的优点,且操作简便、实用性强。     

小麦LEAsm基因及其启动子的克隆与功能研究

胚胎发育晚期丰富蛋白(LEA)是一个小的高亲水性的蛋白家族,该蛋白家族在逆境胁迫下大量积累,保护植物免受逆境胁迫。LEA蛋白可分为7组,其中重复的11-氨基酸基序是第3组LEA蛋白的特征。为深入分析第3组LEA蛋白在小麦响应逆境胁迫中的作用机制,利用芯片技术从小麦表达谱中筛选出一个渗透胁迫诱导表达的第3组LEA蛋白基因TaLEAsm,然后根据该基因序列设计引物筛选石麦15的BAC文库,获得1个含有该基因的BAC单克隆,以该BAC单克隆质粒为模板,通过BAC延伸测序克隆了TaLEAsm基因及其启动子序列,并对TaLEAsm序列特征、表达模式和启动子功能进行了初步分析。结果表明,TaLEAsm基因序列仅含有1个105bp的内含子,其开放读码框长675bp,编码224个氨基酸。TaLEAsm含有10个11-氨基酸重复序列,属于第3组LEA蛋白。低温、高盐和渗透胁迫均诱导TaLEAsm基因上调表达,但在根和叶中表达模式不同。在TaLEAsm基因起始密码子上游1 500bp序列中,预测含有14个逆境响应顺式元件。在拟南芥中,TaLEAsm基因启动子能够启动GUS基因表达,渗透胁迫诱导GUS基因明显上调表达。以上结果表明,TaLEAsm为小麦脱水响应基因,其启动子为渗透胁迫诱导启动子。     

水稻抗干尖线虫基因OC-XⅡ的克隆及表达研究

抗性验证试验表明籼稻大白谷抗水稻干尖线虫侵染。为进一步探究此抗性与病程相关蛋白——半胱氨酸蛋白酶抑制剂(Cystatin)的相关性,基于水稻基因组数据克隆籼稻大白谷Cystatin家族的OC-XII基因,分别进行OC-XII、JaponicaOC-XII和Indica-OC-XII蛋白质三维结构构建,并与水稻干尖线虫组织蛋白酶B(Cathepsin B)进行分子对接以验证OC-XII基因编码蛋白对Cathepsin B的抑制功能。通过荧光定量qPCR验证OC-XII基因在线虫侵染前后的表达特性,OC-XII蛋白可以与水稻干尖线虫Cathepsin B蛋白质特异结合,线虫侵染后OC-XII基因在浸染12h~2d期间表达量持续上调,侵染3d后下调。表明OC-XII基因在大白谷抗水稻干尖线虫侵染过程中发挥功能,具有对植物寄生线虫进行生物防治的潜力,有必要对其进行深入研究。     

水稻抗干尖线虫基因OC-XII的克隆及表达研究

抗性验证试验表明籼稻大白谷抗水稻干尖线虫侵染。为进一步探究此抗性与病程相关蛋白——半胱氨酸蛋白酶抑制剂(Cystatin)的相关性,基于水稻基因组数据克隆籼稻大白谷Cystatin家族的OC-XII基因,分别进行OC-XII、Japonica-OC-XII和Indica-OC-XII蛋白质三维结构构建,并与水稻干尖线虫组织蛋白酶B(Cathepsin B)进行分子对接以验证OC-XII基因编码蛋白对Cathepsin B的抑制功能。通过荧光定量qPCR验证OC-XII基因在线虫侵染前后的表达特性,OC-XII蛋白可以与水稻干尖线虫Cathepsin B蛋白质特异结合,线虫侵染后OC-XII基因在浸染12h~2d期间表达量持续上调,侵染3d后下调。表明OC-XII基因在大白谷抗水稻干尖线虫侵染过程中发挥功能,具有对植物寄生线虫进行生物防治的潜力,有必要对其进行深入研究。     

水稻烯酰辅酶A水合酶的功能预测分析

水稻潜根线虫是一类寄生于水稻根部的迁移性内寄生线虫，广泛分布于各类水稻田中，成为严重危害水稻的寄生线虫，其中水稻细尖潜根线虫是江西省最严重的水稻潜根线虫之一。目前培育抗病品种是防治水稻潜根线虫病最为经济、有效的措施。通过转录组分析水稻细尖潜根线虫侵染的和未受水稻细尖潜根线虫的感病水稻品种‘霸王鞭’根组织基因表达情况，筛选出差异表达显著上调基因OsECH1，并对OsECH1蛋白及其同源蛋白进行系统发育分析。结果表明：OsECH1蛋白与其他同源蛋白具有相同的保守结构域PLN02874，属于ECH家族。同时发现在水稻‘日本晴’中有5个同源基因，其中OsECH1基因位于染色体1上；克隆获得OsECH1基因全长并利用同源重组技术构建重组表达载体，通过农杆菌转化获得转基因水稻；经RT-qPCR分析该基因表达水平对水稻细尖潜根线虫侵染的影响。结果表明，在水稻中过表达OsECH1基因会减少水稻细尖潜根线虫的侵染，沉默OsECH1基因会增加水稻细尖潜根线虫的侵染；OsECH1蛋白亚细胞定位于细胞核中；通过His-tag pull down分析，该蛋白可能与5种防御相关蛋白互作。5种防御相关蛋白分别属于v...     

水稻纹枯病菌RsPhm基因的克隆及其表达分析

【目的】为了阐明苯酚2-单加氧酶基因(RsPhm)在水稻纹枯病菌(Rhizoctoniasolani AG-1ⅠA)黑化中的功能,【方法】采用常规PCR和RT-PCR技术对该基因进行克隆和生物信息学分析,通过荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测在儿茶酚胁迫下该基因的相对表达量。【结果】生物信息学分析结果表明,RsPhm基因的DNA和cDNA全长序列分别为2628 bp和1983 bp,编码660个氨基酸。系统进化树分析显示,RsPhm基因在立枯丝核菌(R. solani)不同融合群中具有较近的亲缘关系,在不同真菌之间在进化上具有一定保守性。通过qRT-PCR技术分析了在不同浓度儿茶酚胁迫下水稻纹枯病菌RsPhm基因的转录表达情况。外源儿茶酚能提高RsPhm基因的表达量,在12.5 µg/mL浓度下表达量最高,极显著上调35.7倍,在25 µg/mL和50 µg/mL浓度下表达量分别上调19.1倍和28.4倍,但在100 µg/mL浓度下表达量仅上调2.1倍。【结论】获得了RsPhm基因全长序列,了解了其基本生物学信息,明确了其在儿茶酚胁迫下的表达模式。研究结果为科学、系统地阐明水稻纹枯病菌RsPhm基因调控黑色素形成机制奠定了理论基础。     

水稻纹枯病菌RsPhm基因的克隆及其表达分析

【目的】为了阐明苯酚2-单加氧酶基因(Rs Phm)在水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani AG-1ⅠA)黑化中的功能,【方法】采用常规PCR和RT-PCR技术对该基因进行克隆和生物信息学分析,通过荧光定量PCR(q RT-PCR)技术检测在儿茶酚胁迫下该基因的相对表达量。【结果】生物信息学分析结果表明,Rs Phm基因的DNA和c DNA全长序列分别为2 628 bp和1 983 bp,编码660个氨基酸。系统进化树分析显示,Rs Phm基因在立枯丝核菌(R.solani)不同融合群中具有较近的亲缘关系,在不同真菌之间在进化上具有一定保守性。通过q RT-PCR技术分析了在不同浓度儿茶酚胁迫下水稻纹枯病菌Rs Phm基因的转录表达情况。外源儿茶酚能提高Rs Phm基因的表达量,在12.5μg/m L浓度下表达量最高,极显著上调35.7倍,在25μg/m L和50μg/m L浓度下表达量分别上调19.1倍和28.4倍,但在100μg/m L浓度下表达量仅上调2.1倍。【结论】获得了Rs Phm基因全长序列,了解了其基本生物学信息,明确了其在儿茶酚胁迫下的表达模式。研究结果为科学、系统地阐明水稻纹枯病菌Rs Phm基因调控黑色素形成机制奠定了理论基础。     

一个水稻铜锌SOD酶基因在应答亚砷酸盐胁迫中的作用

【目的】水稻Os08g44770.1基因编码一个铜锌SOD酶,但其在响应亚砷酸盐[As(Ⅲ)]胁迫中的生物学功能未知。本研究旨在深入揭示由该基因调控水稻砷耐性改变的分子机理并为水稻抗逆育种提供理论参考。【方法】以野生型日本晴(WT)和2个Os08g44770.1过表达转基因株系为试材,通过胁迫处理、生理指标测定和基因表达分析等,系统探究了转基因植株对As(Ⅲ)的耐受性表现,并初步揭示了其调控水稻砷耐性的生理和分子机理。【结果】与WT相比,过表达转基因株系对As(Ⅲ)更加敏感;转基因植株在砷胁迫下的根系相对伸长量、生物量(干质量)、叶绿素含量、根系细胞质膜完整性、叶片抗氧化程度等均显著低于WT;Os08g44770.1在砷处理后的WT和转基因植株叶片中的表达模式略有不同,但均表现为处理24 h时被显著诱导表达。【结论】过度表达Os08g44770.1基因可导致水稻的砷耐受性极显著下降。     

中国水稻干尖线虫部分群体对水稻的致病力测定

 为了解不同地理群体和寄主群体的中国水稻干尖线虫对水稻的致病力差异,通过室内水稻盆栽接种试验,对来自中国6个省、2种不同寄主植物上的水稻干尖线虫8个群体的致病力进行了测定和分析。结果表明,供试的8个水稻干尖线虫群体均能侵染供试的3个水稻品种,但不同群体对水稻同一品种的致病力,以及同一群体对不同水稻品种的致病力均存在差异;不同水稻品种被侵染后的症状也存在差异,仅有辽盐16被所有群体侵染后均表现“干尖”症状,武育粳3号和博优998没有明显“干尖”症状。供试的3个水稻品种接种水稻干尖线虫后均能抽穗,但是株高、穗长、单株穗数和千粒重受到不同程度的影响。此外,水稻干尖线虫对水稻的致病力与群体寄主相关,来自草莓的水稻干尖线虫群体对水稻的致病力明显弱于来自水稻上的群体;在供试的水稻干尖线虫群体中,HN 2群体对水稻品种辽盐16的生长影响最大,但在稻株上的虫量最少,显示该群体繁殖数量不大,但具有较强的致病力。这说明水稻干尖线虫在水稻上的繁殖数与致病力之间并不一定呈正相关。这些结果表明中国的水稻干尖线虫可能存在不同的生理小种或致病型。     

水稻二化螟病原线虫N-Yz1的分离鉴定及其感染特性

【目的】二化螟是危害水稻的重要害虫,其钻蛀为害,防治困难,严重威胁水稻生产。本研究对感染二化螟昆虫病原线虫的分离筛选和感染特性进行研究,期望为水稻钻蛀害虫危害的防治提供新的途径和方法。【方法】自越冬代二化螟幼虫体内通过组织分离筛选,获得野外感染二化螟的昆虫病原线虫,室内接种实验分析分离昆虫病原线虫对二化螟的感染活性和作用特性。【结果】自然罹死二化螟幼虫体内分离获得野外感染的昆虫病原线虫N-Yz1,接种4龄二化螟幼虫导致感染并死亡,后期虫体内产生大量形态一致的侵染期线虫(IJ)。形态学观察结合r DNA-ITS序列分析,鉴定分离昆虫病原线虫隶属于斯氏线虫属,与已鉴定种小卷蛾斯氏线虫同源性达99.87%。昆虫病原线虫N-Yz1对不同龄期二化螟幼虫都有较高感染致死作用,40头(IJ)的线虫接种剂量,对低龄(2～3龄)二化螟致死速度快、致死率高,接种24h就出现感染致死个体,48h后幼虫全部死亡。高龄幼虫(4～6龄)感染致死速度较慢,死亡高峰发生在接种线虫后的48 h。N-Yz1接种剂量与二化螟死亡率呈显著正相关,剂量超过30IJs/头时,4龄二化螟感染死亡率达90%以上。N-Yz1对二化螟幼...     

多巴胺引发对盐胁迫下水稻种子萌发及幼苗生长的影响

[目的]探讨多巴胺(Dopamine,DA)引发对盐胁迫下水稻种子萌发及幼苗生长的影响.[方法]以新疆自育水稻品种新稻17号为研究对象,分别用0(纯水)、0.1、0.5、1、1.5 mg/L的DA溶液(分别用S0、S0.1、S0.5、S1、S1.5表示)引发种子,采用浓度为100 mmol/L的NaCl溶液模拟盐胁迫,...     

二化螟实时荧光定量PCR内参基因筛选和表达稳定性评价

【目的】筛选特定试验条件下二化螟(Chilosuppressalis)稳定表达的内参基因,为二化螟基因表达研究奠定基础。【方法】根据二化螟转录组测序结果挑选出11个候选基因,利用实时荧光定量PCR测定其在二化螟不同发育历期、不同组织、温度处理、杀虫剂处理、取食不同饲料、取食不同水稻、dsRNA处理和混合样品的表达量,利用RefFinder、BestKeeper、Ge Norm和NormFinder等软件和ΔC_t值对11个候选基因的稳定性进行评估。【结果】5种分析方法表明,在二化螟不同发育历期稳定性较高的内参基因是AK、RPL10和EF1,不同组织中稳定性较高的内参基因是EF1、TUB和ACTB,不同温度下较稳定的内参基因为TUB、RPL10和EF1,杀虫剂处理样品中较稳定的是TF4和ACTA,取食不同饲料较稳定的是TUB、TF4、EF1和RPL10,取食不同品种水稻较稳定的是TUB和EF1,dsRNA处理样品中较稳定的是TUB、AK、ACTB和EF1,混合样品中较稳定的是EF1、TUB和ACTB。【结论】为不同试验条件下选择合适的内参基因提供了参考,也有利于在二化螟基因表达研究中获得更加可靠准确的数据。     

利用CRISPR/Cas9技术编辑AFP1基因提高水稻耐逆性

目的 为鉴定水稻AFP1在非生物胁迫响应中的作用,创制非生物胁迫抗性的水稻新材料。方法 以优异籼稻恢复系华占为转化受体,利用CRISPR/Cas9技术创制afp1突变体,并对afp1突变体的耐逆性进行初步鉴定。结果 AFP1靶点1和靶点2的编辑效率分别为66.67%和75.00%。所有突变株系中,突变类型仅有插入和缺失突变,90%突变株系的突变长度为小片段突变（<5bp）。获得了6种无转基因成分的afp1纯合突变体。正常条件下,afp1突变体株高和结实率降低,有效分蘖增加,穗长显著升高,单株产量在-4.06%和11.75%之间变化。和野生型相比,afp1突变体的ABA敏感性和叶片水分散失率降低,耐干旱、热和渗透胁迫能力提高。结论 编辑AFP1基因可提高水稻多种非生物胁迫抗性。