饲料磷脂对已交配和未交配雌性三疣梭子蟹卵巢发育、组织学和卵黄蛋白原表达的影响

为探讨饲料磷脂对已交配和未交配雌性三疣梭子蟹卵巢发育、组织学结构和卵黄蛋白原基因表达的影响,本研究采用2×2双因子随机区组设计(日粮类型:0%和4%大豆卵磷脂;三疣梭子蟹交配处理:已交配和未交配),共4个处理组,以大豆卵磷脂0%和4%两种人工配合饲料分别投喂交配和未交配两组三疣梭子蟹雌蟹,进行了为期12周的饲养实验。结果显示,无论三疣梭子蟹是否交配,饲料中添加4%大豆卵磷脂可显著增加三疣梭子蟹的卵巢指数,提高血清中卵黄蛋白原、孕酮和雌二醇的浓度,增大卵母细胞直径;同时上调肝胰腺卵黄蛋白原m RNA相对表达量,但无显著性差异,肝胰腺指数呈现出和卵巢指数相反的趋势;交配后的三疣梭子蟹卵巢指数、肝胰腺卵黄蛋白原m RNA表达量显著高于未交配组。组织学观察显示,交配使得三疣梭子蟹卵母细胞沉积更丰富的卵黄颗粒,促进卵母细胞成熟,交配处理对肝胰腺指数和血清中卵黄蛋白原及孕酮的水平无显著性影响。此外,饲料磷脂水平和交配处理的交互作用显著影响了三疣梭子蟹血清中类固醇激素孕酮和雌二醇的浓度。本实验结果显示,饲料中大豆磷脂和交配处理均能促进雌性三疣梭子蟹的卵巢发育,交配处理对卵母细胞成熟的促进作用更为明显。     

莱州湾三疣梭子蟹的生化遗传分析

采用聚丙烯酰胺不连续凝胶垂直板电泳技术对三疣梭子蟹的同工酶进行检测。分析了13种同工酶在莱州湾三疣梭子蟹肌肉中的表达情况,并对同工酶的表型进行了生化遗传分析。结果表明,13种同工酶有22个基因位点编码,其中Ldh-1,Me-3,Gdh-1,Sdh-1,G6pd-1和Sod-3共6个位点是多态的,多态位点百分数是27.3%。三疣梭子蟹的平均每个位点的等位基因的有效数目Ae为1.2270,平均每个位点的预期杂合度He为0.1170,实际杂合度Ho为0.2159。同时还分析了三疣梭子蟹的各个多态位点的Hardy-Weinberg偏离指数:Ldh-1、Me-3和Sod-3的d值都为1.0000,Gdh-1、Sdh-1和G6pd-1的d值分别为0.5047、0.8726和0.0597。这些数据表明,莱州湾三疣梭子蟹的种质资源还处于较好的状态。     

三疣梭子蟹卵黄磷蛋白纯化及其ELISA测定方法

采用凝胶过滤层析法纯化了三疣梭子蟹成熟卵巢的卵黄磷蛋白(vitellin,Vn),采用变性凝胶电泳(SDS-PAGE)确定了Vn亚基数量和分子量,以纯化的Vn为抗原,制备了三疣梭子蟹Vn多克隆抗血清,纯化后得到Vn抗体,在此基础上比较和优化了三疣梭子蟹Vn测定的酶联免疫吸附法(ELISA)参数,建立了稳定的三疣梭子蟹Vn含量测定的ELISA方法。结果表明:(1) SDS-PAGE 显示三疣梭子蟹成熟卵巢中的Vn含有分子量为100、75和66 ku的3个亚基,Western-blotting检测表明,这3个亚基均具有较强的免疫特异性;(2) 样品直接包被法比双抗体夹心法具有更高的线性相关性,Vn抗体最佳稀释倍数为1∶90 000,最佳包被时间为8 h,一抗和二抗反应时间分别为2 h和1 h,显色时间为20 min;(3) 该方法定性检测的灵敏度为14.9 ng/mL左右,标准曲线方程为y=0.000 9x+0.399 1(R²=0.986 1),其中x和y分别代表Vn浓度和OD₄₅₀值,工作范围为200～900 ng/mL;(4) 应用该方法测定三疣梭子蟹卵巢中Vn含量,结果表明,批次内和批次间平均变异系数分别为3.59%和3.10%,重复性良好。     

三疣梭子蟹池塘养殖技术

<正> 三疣梭子蟹广泛分布于我国近海,而以东海、黄渤海产量较大。近年来,由于海洋渔业资源结构的变化,梭子蟹自然资源急剧衰退,商品价值倍增,人工养殖迅速兴起。1994～1998年我们在杨岐垦区虾塘进行示范养殖,1998年100亩示范池,共收获梭子蟹6350kg(其中雄蟹2100kg,雌蟹4250kg),产值46.65万元,利税31.65万元,平均亩产63.5kg,投入产出比1:3.1,取得显著的社会经济效益。现将养殖情况总结如下:     

三疣梭子蟹育苗技术探讨

本试验利用普通的对虾育苗室，于１９９４￣１９９５年进行了三疣梭子蟹育苗生产性试验，其结果：１９９４年在３６０ｍ＾３水体中育出苗２２０万只，计２１．５ｋｇ，１９９年在３６０ｍ＾３水体中育出Ｃ１苗８８２万只，计８０ｋｇ，取得了较好的经济效益。     

三疣梭子蟹人工育苗试验总结

三疣梭子蟹(Portunus trit uberculatus)属甲壳纲、十足目、短尾派、梭子蟹科。人工育苗技术的研究早在60年代日本就开始并取得一定的成绩,至70年代已能进行工厂化苗种生产。在因内,辽宁省海洋水产研究所(1982)和中国水科院北戴河中心实验站(1986)曾进行三疣梭子蟹人工育苗试验,均取得成功。     

中国对虾和三疣梭子蟹混养试验

于1999－2000年进行了中国对虾（Penaeus chinensis)和三疣梭子蟹（Portunus trituberculatas)的混养试验。1999年的产量对虾为388．92kg/hm^2，梭子蟹为909．31kg/hm^2，纯收入和投入产出比为3．64万元／hm和1：1．98；2000年的产量对虾为412．50kg/hm^2,梭子蟹为722．25kg/hm^2。纯收入和投入产出比为2．55万元／hm^2和1：1．23，两个年度的实验都取得了较好经济效益，混养的纯利润比对虾单养提高了7－10倍，投入产出比提高1－2．5倍。     

三疣梭子蟹核型分析

实验用三疣梭子蟹于2003年3月－2004年6月购自浙江象山石浦港。以成熟卵、精巢、胚胎及溞状幼体等为材料进行三疣梭子蟹染色体数目和核型的研究。染色体制片采用组织切片法和气干法,用Olympus显微镜进行观测、摄影,依据Levan等的染色体分类标准进行核型分析。结果表明,精巢最适宜进行三疣梭子蟹染色体计数,卵内溞状幼体最适宜做核型分析。三疣梭子蟹染色体的数目是2n=106,n=53。核型分析显示,三疣梭子蟹有20对（第1～20号）中部着丝粒染色体（m）、3对（第21－23号）亚中部着丝粒染色体（sm）和30对（笫24～53号）端部着丝粒染包体（t）。因此,三疣梭子蟹核型为2n=106=40m＋6sm＋60t,染色体臂数NF=152;没有检查出异形性染色体的存在。     

三疣梭子蟹综合养殖技术

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)属甲壳纲、十足目,梭子蟹科,广泛分布于我国沿海,是经济价值较高的大型海产蟹类.20世纪80年代初,山东沿海进行了三疣梭子蟹土池育肥和蓄养试验,并取得了初步成功[1].目前,我国沿海各省均开展了三疣梭子蟹人工养殖,尤其在山东、江苏和河北等省养殖规模较大.三疣梭子蟹人工养殖方式主要有两种:一种是单养[2],另一种是与对虾、贝类等综合养殖[3].笔者对三疣梭子蟹综合养殖技术进行总结,以期为三疣梭子蟹人工养殖提供技术支持.     

三疣梭子蟹开口饵料探讨

对梭子蟹的开口饵料进行了４组对比实验,比实验中可以看出,喂轮虫加豆粉的变态率高于单一喂轮虫的变态率,喂轮虫变态率高于喂卤虫的变态率,喂卤虫的变态率高于喂蛋黄和酵母的变态率。     

三疣梭子蟹几丁质酶基因1的克隆及功能鉴定

为丰富三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)几丁质酶基因家族的组成,进行了几丁质酶基因1(PtCht1)的研究。PtCht1基因cDNA全长为2220 bp,编码583个氨基酸。结构域比对发现,PtCht1含有甲壳动物几丁质酶GH18家族基因的基本结构及保守序列,且进化树显示,三疣梭子蟹Cht1与拟穴青蟹(Scylla serrata)等物种的Cht1聚为一类,同源性最高,达92.80%。由此确定,PtCht1为甲壳动物GH18家族Group1基因,也是三疣梭子蟹该分类下的首个基因。此外,全组织表达分析结果显示,PtCht1在肝胰腺中较特异性高表达,且在蜕皮间期的肝胰腺中的表达量显著高于前期和后期(P<0.05)。低盐度胁迫处理后,在肝胰腺中,PtCht1基因的表达量在3 h快速升至峰值,为对照组的2.72倍;在鳃中,除12 h外,PtCht1基因的表达量均呈显著上调表达(P<0.05),最高上调9.96倍。结果表明,PtCht1基因能够参与机体对几丁质类食物的消化过程,并且在渗透压的调控等方面发挥重要作用。本研究可为三疣梭子蟹几丁质酶GH18家族Group1基因的研究奠定基础,为解析盐度影响三疣梭子蟹生长提供参考。     

三疣梭子蟹幼蟹配合饲料中蛋白质、脂肪、粗纤维适宜含量研究

以初始平均体重为7.1 g的三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)幼蟹为试验对象,以粗蛋白、粗脂肪和粗纤维为试验因素,各设3个水平,采用正交试验设计L9(34),配制成9种饲料,在室内水族箱进行为期4周的饲养试验,以探讨三疣梭子蟹幼蟹配合饲料中蛋白质、脂肪和粗纤维的适宜含量.结果表明,三疣梭子蟹幼蟹配合饲料中蛋白质、脂肪和粗纤维的适宜含量分别为40%、6%～8%和≤5%时,三疣梭子蟹幼蟹增重率和蜕壳率高,饲料系数低和蛋白质效率较高.     

饲料中蛋白水平对三疣梭子蟹雌体生长、卵巢发育和生化组成的影响

本研究配制蛋白水平分别为32.16％、36.13％、39.59％和41.24％的等脂等能配合饲料(分别记为饲料1～4),对初始体重为(10.98±0.28)g的三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)雌体进行池塘养殖120 d,以探究饲料蛋白水平对三疣梭子蟹雌体生长、卵巢发育和生化组成的影响.结果...     

梭子蟹定置三重刺网设计与试验

根据捕捞目标的生物学习性和体型特征,设计了一种捕捞三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)的专用定置三重刺网并进行了生产试验。所设计的刺网主尺度为50.00 m×1.08 m,上纲长50.00 m,下纲长66.00 m;内网衣规格为1 200目×18.5目,目大120 mm;外网衣规格为200目×2.5目,目大500 mm。2015年9月4—26日在莱州湾渔场进行了生产试验。结果表明,新刺网所捕获的三疣梭子蟹平均体重为175.69 g,单位捕捞努力量渔获量(CPUE)为1.61 kg/(片·次),主捕率高,其中梭子蟹产量占总渔获量的99.31%。新设计的刺网,下纲比上纲长32%,网衣底部较松弛,提高了网衣对梭子蟹的缠络性能,因而提高了捕捞效率;内网衣网目较大,利于释放幼鱼,网高较低,减小了捕获中上层鱼类的几率,因此,兼捕率较低,有利于渔业资源的保护。     

盐度对三疣梭子蟹生长、蜕壳及能量利用的影响

在实验室条件下,研究了盐度(15,20,25,30,35)对三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)幼蟹生长、蜕壳和能量利用的影响,探讨了三疣梭子蟹生长的最适盐度、蜕壳与生长的关系以及不同盐度水平下蟹的蜕壳同步性。实验时间为50 d,结果显示:1、盐度显著影响三疣梭子蟹的摄食、生长和能量利用。盐度20、25和30组,三疣梭子蟹的日摄食率(FId)较小,但其食物转化效率(FCEd)较高,其中盐度30组蟹的食物转化效率显著高于盐度15和35组(P<0.05),与盐度20和25组差异不显著(P>0.05)。盐度20、25和30组的能量吸收效率(K1)和净生长效率(K2)显著高于盐度15和35组。实验结束时,盐度30组三疣梭子蟹获得了较高的湿重、相对增重率和特定生长率,且显著高于盐度15和35组(P<0.05),而与盐度20和25组间的差异不明显(P<0.05)。回归分析表明,当水体盐度为26.3时,三疣梭子蟹特定生长率(SGRd)最大。2、不同盐度下,三疣梭子蟹幼蟹从Ⅶ期生长到Ⅹ期的蜕壳周期为18.9~23.5 d,各盐度组间的差异不明显(P>0.05),但盐度30组三疣梭子蟹蜕壳周期较其他盐度组缩短了3.1~4.6d。低盐(15)下,三疣梭子蟹出现MDS(蜕壳未遂)死亡,蜕壳受到抑制;而高盐(35)则抑制三疣梭子蟹新壳的硬化,盐度20和25组三疣梭子蟹的蜕壳同步性较好。实验结果初步表明,养殖生产中水体盐度控制在25左右有利于三疣梭子蟹的蜕壳同步及生长。     

三疣梭子蟹卵巢发育期间孕激素受体的免疫识别与分布

为探讨三疣梭子蟹卵巢发育过程中孕激素受体（Progestin receptor, PR）的调控作用,采用免疫印迹和免疫组化方法,首次对三疣梭子蟹卵巢、肝胰腺、大颚器、Y器官、视神经节和胸神经团中的PR进行免疫识别和定位, 并系统研究了卵巢发育期间PR在这些器官中的分布和变化。结果表明：(1) 三疣梭子蟹视神经节中存在PR阳性条带,分子量约100kDa;(2) PR仅在早期(Ⅰ-Ⅲ期)生殖细胞胞质和后期(Ⅲ-Ⅴ期)细胞核呈强阳性, 但在各期滤泡细胞中始终呈强阳性; (3) PR阳性主要存在于Ⅰ-Ⅴ期肝胰腺F细胞和Ⅲ期R细胞核中, 其余肝胰腺细胞中均无PR阳性; (4) 大颚器腺细胞中的PR阳性仅发现于Ⅳ期腺细胞胞质中, 各期Y器官腺细胞中均呈PR阴性; (5) 就视神经节而言, PR主要存在于Ⅲ-Ⅴ期的神经细胞。就胸神经团而言, Ⅰ-Ⅴ期神经细胞中的PR阳性呈增强趋势, 而Ⅰ-Ⅴ期神经髓质中PR始终呈PR强阳性。以上结果暗示, 孕酮不仅可以通过与卵巢和肝胰腺中PR结合直接调控三疣梭子蟹的卵黄发生和卵巢发育, 还可能通过影响其它内分泌激素的合成和分泌来间接调控其卵巢发育。     

三疣梭子蟹胚胎发育过程中主要生化组成的变化及其能量来源

系统研究了三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)胚胎发育过程中胚胎体积、单卵干重、湿重、蛋白质、脂肪、碳水化合物的变化规律,探讨胚胎发育过程中能量来源和消耗规律。结果表明,三疣梭子蟹胚胎发育过程中,胚胎体积持续增加,由受精卵时的(24.5±1.72)×106μm3增加到孵化前的(39.2±2.8)×106μm3(P<0.01);胚胎体积增加主要发生在胚胎发育后期。胚胎发育过程中单卵中水分含量呈上升趋势(P<0.05),水分绝对量由受精卵的(19.88±1.65)μg上升到心跳期的(28.82±1.77)μg,单卵水分含量升高了44.97%,故单卵湿重显著上升(P<0.05)。整个胚胎发育过程中单卵干重下降了4.64%。胚胎发育过程中单卵中的蛋白质、脂肪下降显著,分别减少了(1.97±0.35)μg和(1.99±0.45)μg,脂肪含量下降幅度为50.48%,而蛋白质含量下降幅度为23.48%;三疣梭子蟹胚胎发育过程中能量主要由脂类提供(71.32±20.46)%,其次由蛋白质提供(27.13±4.29)%,脂类和蛋白质分别充当了不同胚胎时期的主要能量来源,胚胎中的能量消耗主要发生在卵裂期、原肠期和心跳期。     

东海三疣梭子蟹成熟群体生殖特征和条件状况

为了探求东海三疣梭子蟹成熟群体的发育生殖机制,采用生态学、资源生物学等相关研究方法,通过对三疣梭子蟹性腺、肝胰腺及条件指数等指标的研究,初步建立起雄性三疣梭子蟹成熟阶段发育分期的特征变化,反映了目前东海三疣梭子蟹成熟群体的生殖特征和条件状况。三疣梭子蟹生殖群体由1龄蟹为主,规格偏小。头胸甲宽主要分布在100~160 mm之间,体重为50~200 g。头胸甲宽与长呈线性相关,而头胸甲宽、长与体重则呈幂函数关系。成熟阶段输精管发育程度和头胸甲宽正显著相关。根据三疣梭子蟹输精管的粗糙程度、管径及管重大小,本文首次提出把处于成熟阶段的雄蟹分为5个阶段。输精管重增长为幂函数方式,输精管指数则随发育线性增长。雌蟹卵巢发育规律和头胸甲宽之间关系不甚明显,而和季节相关。研究表明,9月份三疣梭子蟹交配后卵巢迅速发育,增长明显,10~12月份生殖群体卵巢普遍处于Ⅱ~Ⅳ期。三疣梭子蟹肝胰腺重量随体重和甲壳的增长而增加,而肝体指数相反。雌蟹卵巢Ⅱ期阶段梭子蟹肝胰腺重量最高,平均重量为18.21±5.68 g,随后逐渐降低,说明肝胰腺能量发生了转移;相比于雄蟹,雌蟹储能更多。雌蟹卵巢重量随肝胰腺重量变化呈对数关系增长,而雄蟹输精管重随肝胰腺重呈线性。三疣梭子蟹生殖群体在发育变化过程中两个条件指数基本处于一个平衡阶段,雌雄间差异变化不大。     

Isolation,characterization and virulence of Mesanophrys sp. (Ciliophora: Orchitophryidae) in farmed swimming crab (Portunus trituberculatus) in eastern China

A disease outbreak occurred in swimming crab (Portunus trituberculatus) farmed in eastern China, with a mortality rate of more than 80%. To further investigate the characteristics and pathogenesis, we reported isolation, characterization and virulence of the causative agent of this disease from 10 sick crabs. Histopathological observation found that multiple tissues, especially haemolymph, contained lots of ciliates. The ciliate was isolated and cultured in vitro, and molecular and morphological studies were done. The results showed that SSU rDNA and LSU rDNA sequences of the ciliate were similar to Mesanophrys ciliates (>96.81%), while ITS1-5.8s-ITS2 sequence was similar to Mesanophrys pugettensis (95.37%) and identical to Orchitophrya stellarum (100%). Furthermore, the results of the morphological study confirmed that the ciliate was similar to Mesanophrys ciliates and O. stellarum cultured in supportive media, but different from O. stellarum cultured in living sperm cells of starfish (Leptasterias spp.). Also, the growth of the ciliate did not interfere with light, which was different from O. stellarum. Accordingly, the ciliate was classified as genus Mesanophrys and temporarily named as Mesanophrys sp. In addition, experimental infection confirmed that Mesanophrys sp. was the pathogen that infected farmed crabs. In summary, Mesanophrys sp. was first isolated and characterized in P. trituberculatus.     

三疣梭子蟹生长相关 SNP 位点的鉴定

为了发掘三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)与生长相关的SNP,本研究基于三疣梭子蟹比较转录组学数据,筛选出生长相关候选基因片段19条,利用该基因序列设计引物进行PCR扩增,得到总长为17 387 bp的DNA片段;通过直接测序法发现74个SNP位点,分布频率为0.43/100 bp,其中转换突变的比例为80%,颠换突变的比例为20%,转换的比例远远大于颠换,符合"transition bias"原理。C/T(G/A)突变所占比例为60%,G/T(C/A)突变占20%,A/T突变占9.33%,G/C突变占10.67%,C/T(G/A)突变所占比例最大。内含子上突变发生的频率为1.34/100 bp,外显子上仅为0.17/100 bp,说明外显子上的碱基更加保守。通过飞行质谱法,在三疣梭子蟹生长性状分离群体中成功分型了10个SNP位点;通过卡方检验和多元方差分析的方法进行性状关联分析,发现3个SNP位点与生长性状显著相关(P0.05),并且comp58070-R31位点与生长性状极显著相关(P0.01);一般线性模型的多元方差分析显示,comp58070-R31位点与体重、全甲宽、甲宽3个性状极显著相关(P0.01),与体长、体高2个性状为显著相关(P0.05);comp46623-F49位点与甲宽显著相关(P=0.05);comp49193-R333位点与甲宽显著相关(P0.05)。通过对SNP位点的多态性分析发现,三疣梭子蟹SNP标记观测杂合度(Ho)范围为0.162 8~0.833 3,期望杂合度(He)范围为0.189 6~0.591 2,并且显示SNP标记的信息量低于微卫星标记。该研究的结果将有助于推进三疣梭子蟹分子标记辅助育种进程。