橘色双冠丽鱼体色相关基因mitf的结构及表达调控特性

为了解小眼畸形相关转录因子mitf基因在鱼类早期体色褪黑过程中的调控作用,本研究采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术获得橘色双冠丽鱼(Amphilophus citrinellus) mitf基因cDNA序列全长,利用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)技术检测其在橘色双冠丽鱼胚胎不同发育时期、体色褪黑不同时期和各个组织中的表达规律。获得mitf基因2个亚型,其中,mitf1的cDNA全长为1816 bp,包括5′非编码区(UTR) 158 bp、3′UTR 428 bp、开放阅读框(ORF) 1230 bp,共编码409个氨基酸;mitf2的cDNA全长为1638 bp,包括5´UTR 160 bp、3´UTR 428 bp和ORF 1050 bp,共编码349个氨基酸。同源性和系统进化分析显示,mitf1和mitf2聚在一小支,与慈鲷科(Cichlidae)鱼类同源性最高,与哺乳类动物同源性较低。qRT-PCR结果显示,在成鱼各个组织中,mitf1和mitf2均有不同程度表达,其中,眼部表达量最高且显著高于其他组织(P<0.05),肌肉、脑和肾脏也有较高表达;mitf1和mitf2在胚胎各个发育时期均有表达,在受精卵时期表达量最高,显著高于其他胚胎期;随着橘色双冠丽鱼体色由黑色过渡到橘黄色,mitf1和mitf2在鱼皮肤、鳞片、尾鳍中的表达均呈逐渐下降的趋势,表明mitf基因表达与鱼体色由黑到黄转变的表型间存在关联性,推测与鱼体色发育阶段色素细胞的分化和分布比例的动态变化相关。本研究通过了解鱼类体色发育和变异的分子基础,可为鱼类色素细胞发育和体色人工改良积累资料。     

橘色双冠丽鱼黑素皮质素受体1基因(MC1R)整胚原位杂交

为探究黑素皮质素受体1基因(MC1R)在橘色双冠丽鱼胚胎发育和体色形成过程中的表达定位及功能,本研究首先制备了MC1R基因的RNA正反义探针,T7方向转录的正义RNA探针质量浓度为447.529 ng/μL,SP6方向转录的反义RNA探针质量浓度为342.698 ng/μL。经10～20倍稀释后的探针用于原位杂交,MC1R基因探针表达定位显示,随橘色双冠丽鱼胚胎的发育杂交信号总体呈逐渐减弱趋势,原肠期和视泡期其卵黄和胚体侧卧部分有杂交信号分布;出膜期其脊柱、卵黄囊及其内容物和色素细胞内出现杂交信号;出膜期第1天,卵黄表面有信号分布。总体来看,杂交信号在脊索、卵黄囊、卵黄囊内容物质及色素细胞有特异表达,而以正义探针作为阴性对照组在5个胚胎阶段均无任何信号,杂交信号显现的MC1R表达定位说明其在橘色双冠丽鱼色素细胞的分化、迁移中起到重要调控作用,也与神经、营养、免疫功能相关,初步建立了鱼类体色相关基因功能和定位研究的整胚原位杂交方法。     

齐口裂腹鱼败血症的病原分离与鉴定

从发生败血症的齐口裂腹鱼体内分离出2株致病菌，通过细菌的形态特征、培养特性和生化实验鉴定为嗜水气单胞菌和温和气单胞菌。经人工感染健康鱼表现出与自然病鱼相同的症状，并从人工感染死亡鱼中分离获得同种细菌，证实齐口裂腹鱼败血症的病原为嗜水气单胞菌和温和气单胞菌。药敏实验结果表明新霉素、头孢三嗪、庆大霉素对其高度敏感，红霉素、羧苄青霉素、氮苄青霉素和磺胺等不敏感。     

草鱼肠巨噬细胞的分离培养与鉴定

为了建立草鱼肠巨噬细胞的分离培养与鉴定方法,本研究在采用刮除法结合胶原酶IV消化法制备肠黏膜固有层单细胞悬液的基础上,使用鱼类脏器单核细胞分离试剂盒分离肠巨噬细胞,再经差异贴壁法纯化肠巨噬细胞,最后,用含10%胎牛血清和5%草鱼血清的RPMI 1640完全培养液,在28°C、5%CO2条件下原代培养肠巨噬细胞,并通过细胞形态学检查、分子标记检测和功能验证实验加以鉴定。结果显示,每尾鱼(约250 g)肠巨噬细胞的获得量约为3×107个,细胞活率为99.6%,纯度达到95%以上;倒置显微镜观察发现,原代培养4~5 d的贴壁细胞多呈圆形或多边形,体积明显增大,细胞汇合度达到95%;光镜和电镜观察到染色后的贴壁细胞具有巨噬细胞的形态结构特征,贴壁细胞经荧光定量PCR在m RNA水平检测到巨噬细胞特异性标志分子(草鱼巨噬细胞集落刺激因子受体),功能实验证实贴壁细胞具有吞噬功能,脂多糖能够显著提高其呼吸暴发活性。本研究首次成功建立了草鱼肠巨噬细胞的分离培养与鉴定方法,为开展口服疫苗诱导的草鱼肠黏膜免疫应答研究提供细胞模型。     

血鹦鹉鱼木糖葡萄球菌的分离鉴定和耐药性研究

自患病血鹦鹉鱼肾脏分离获得优势菌CVSX1,做分离纯化培养、生化与分子鉴定、人工感染试验和药敏试验,以期对该病有效预防和治疗。分离菌株血液培养菌落呈圆形,表面光滑,边缘整齐,颜色灰白色至略黄,周围有弱溶血环。经过涂片染色镜检,该菌株革兰氏染色为阳性圆形球菌,直径约为0.8~1.0μm,多数成堆,少数散在、成对或四联状排列。该菌株无荚膜或鞭毛,亦无芽孢,根据形态和生理、生化性状可初步鉴定为木糖葡萄球菌。菌株的16SrDNA序列比对表明,菌株CVSX1与已登录GenBank数据库的木糖葡萄球菌16SrDNA序列的相似性99%,聚类分析结果表明菌株CVSX1与葡萄球菌属的木糖葡萄球菌遗传距离最小。通过人工感染试验证明木糖葡萄球菌CVSX1对血鹦鹉幼鱼有较强的致病性。应用临床常用的抗生素对木糖葡萄球菌CVSX1进行药敏检测,菌体CVSX1对磺胺嘧啶、青霉素G、诺氟沙星、四环素高度耐药,对红霉素、丁胺卡那敏感,对环丙沙星、氧氟沙星表现为中介。     

全雄黄颡鱼红头病病原菌的分离鉴定

以患红头病的全雄黄颡鱼为研究对象,从其病灶处分离纯化得到病原菌,通过形态和生理生化特征、16S rRNA基因序列及特异性PCR扩增检测等鉴定,以及药敏性斑马鱼人工感染试验,分析其药敏性和致病性。结果显示,从患病全雄黄颡鱼病灶处分离获得的优势菌株为■爱德华菌;该菌株具有较强的致病性,LD₅₀为2.3×10⁵CFU,感染该菌株的斑马鱼发病症状与自然发病症状相似。药敏试验结果显示,该菌株对青霉素、氯霉素、四环素等28种抗菌药物高度敏感,对红霉素中度敏感,对苯唑西啉、克拉霉素、万古霉素等6种药物耐药。     

眼斑星丽鱼的生物学特性及繁育技术

眼斑星丽鱼原产于亚马逊河,食用价值和观赏价值兼备。文章简述了眼斑星丽鱼的生物学特性,介绍了它的人工繁育技术。     

大口黑鲈杀鱼爱德华氏菌的分离鉴定及耐药性分析

2022年3月,广东珠三角地区养殖的大口黑鲈（Micropterus salmoides）发生了大规模暴发性死亡,特别是佛山市南海区,死亡率高达20%～50%。为明确大口黑鲈死亡原因,采集佛山市南海区沙头镇腹部膨大和内脏缺血、体长25～35 cm濒死病鱼42尾,进行组织病理分析、病原分离与鉴定、病原菌毒力和耐药性检测等,为该病的诊断和防控提供科学依据。结果显示,病鱼主要临床症状为严重腹水、肝脏和鳃缺血以及肝脏和肾脏肿大。病理切片显示。肝脏和肾脏均严重组织变性和细胞坏死。从肝脾肾组织中均分离出大量菌落形态一致的细菌,其中肝组织细菌丰度最高。生化鉴定和16S r RNA分子鉴定结果表明：细菌S1为杀鱼爱德华氏菌（Edwardsiella piscicida）,在系统进化树中与杀鱼爱德华氏菌（MN203719.1）自然聚为一支。动物回归感染实验表明该菌为引起大口黑鲈死亡的致病菌,且毒力很强。药敏试验结果显示,该菌对氟苯尼考、恩诺沙星、多西环素等药物敏感,对利福平、阿莫西林、四环素耐受。     

长丝裂腹鱼温和气单胞菌的分离鉴定及药敏检测

2017年4月,四川省西昌某养殖场养殖的长丝裂腹鱼暴发一种以体表、内脏器官出血及角膜浑浊为特征的传染病。为探究此次疫病的病因,自病鱼的肝、脾和肾组织中分离到1株病原菌LXP170412,在脑心浸液琼脂上28℃培养48h,形成白色、半透明、表面光滑的圆形菌落,人工感染试验证实了其病原性;通过表型特征特性测定、16SrDNA和gyrB基因序列分析鉴定,分离菌LXP170412为温和气单胞菌。药敏试验结果表明,温和气单胞菌LXP170412对强力霉素、环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星等敏感,对头孢拉定、新霉素、阿莫西林、庆大霉素、丁胺卡那、恩诺沙星、青霉素、罗红霉素等耐药。试验证实,温和气单胞菌为此次流行病的病原菌,药敏试验结果将为临床用药提供参考依据。     

光合细菌菌种的分离、富集培养、纯化和菌种鉴定及净化水质的研究

光合细菌一般生长在湖底土、河流底土、海底土和水田等地，笔者选择有机物污染较为严重的东平湖畔的河流底土，经富集培养、纯化，最后经菌种鉴定获得了沼泽红假单胞菌、胶质红假单胞菌、球形红假单胞菌和绿色红假单胞菌４株净化养鱼池水质较为理想的菌株。１试验材料和方法１．１富集用培养基NH４Cl１克，MgCl２０．２克，酵母膏０．１克，K２HPO４０．５克，NaCl２克，水９００毫升，灭菌。经过滤灭菌的NaHCO３５克／５０毫升水；５０毫升经过滤灭菌的酒精、戌醇或４％的丙氨酸，用过滤灭菌的０．１摩／升H３PO４调pH值至７．０。…     

草鱼呼肠孤病毒湖州分离株的分离及鉴定

2008年6月从湖州某患病草鱼池塘采集草鱼出血病疑似病样,将除菌过滤后的患病鱼肝、脾、肾组织滤液,注射健康的8～10 cm的草鱼鱼种.5d后草鱼开始发病,且症状与原发病症状一样,死亡率为57%,对照组未有死亡.将无菌处理的病样滤液接种草鱼肾细胞(CIK),连续接5代均出现明显的细胞病变(CPE),并与草鱼呼肠孤病毒参考株所产生的CPE一致.该株病毒的TCID50为10-8/0.1ml.内脏组织经超薄切片,电子显微镜观察,发现组织内有大量的病毒颗粒,大小均一,近似球形,直径约70～75 nm.理化鉴定表明,氯仿、乙醚处理组病毒的感染力和对照组相比并没有多大变化,说明该株病毒对氯仿和乙醚有一定的抗性.经草鱼呼肠孤病毒特异性的RT-PCR检测,获得阳性的目的片段,测序的结果与草鱼呼肠孤病毒相应序列的同源性达99%以上.上述鉴定结果表明所分离的病毒为草鱼呼肠孤病毒,将其命名为HZ2008.     

广西鸡巨型艾美尔球虫的分离鉴定

为了了解广西鸡球虫病的流行种类,对一起疑似鸡巨型艾美耳球虫病例进行了临床诊断和实验室检测,并对分离到的球虫卵囊进行鉴定,从病例的病理变化和球虫卵囊形态特征等鉴定为鸡巨型艾美耳球虫。     

Effects of dried fairy shrimp Streptocephalus sirindhornae meal on pigmentation and carotenoid deposition in flowerhorn cichlid; Amphilophus citrinellus (Günther, 1864) × Cichlasoma trimaculatum (Günther, 1867)

We investigated the effects of dried fairy shrimp Streptocephalus sirindhornae meal (FS) on skin pigmentation and carotenoid deposition in flowerhorn cichlid. Six experimental diets including three treatments of FS at 10% (FS10), 20% (FS20) and 30% (FS30), two dried Spirulina sp. meal (SP) at 6% (SP6) and 12% (SP12), and a control diet (a basal diet without FS or SP) were offered for 90 days. The results demonstrate an increase in the flowerhorn cichlid skin pigmentation from alternative carotenoid feeding. Fish fed the FS diet displayed higher (P ≤ 0.05) chroma and redness values than those fed with a SP diet. The hue value (measure for skin pigmentation) was high when fish were fed with FS20 for 30 and 60 days (P ≤ 0.01). However, fish also showed high hue values when fed for 90 days with FS10 (P ≤ 0.01). The FS20 treatment gave better results than other treatments in terms of total carotenoid, canthaxanthin, astaxanthin and β‐carotene concentration in the skin and musculature. The optimum level of FS in flowerhorn cichlid diets for achieving the highest skin pigmentation was 20%.     

凡纳滨对虾中发光坎氏弧菌的分离、鉴定及致病性

为研究凡纳滨对虾死亡的致病机理,实验采用TCBS培养基从濒死凡纳滨对虾肝胰腺分离到浅绿色、直径3～7 mm的发荧光菌落;革兰氏染色为阴性短杆菌;经API 20E鉴定,分离株PvL-1与坎氏弧菌参考菌株CAIM249相似度为90％;fitZ序列与坎氏弧菌CP020076相似度为99.31％;gapA序列与坎氏弧菌EF59...     

鳜肤孢虫新种的分离和鉴定

为准确鉴定鳜肤孢虫病的病原,实验基于形态学比较,结合寄生特征分析和分子系统学方法开展研究,并观察超微结构。形态学观察结果显示,纺锤形或哑铃形白色孢囊,长约1.9～6.8 mm,寄生于鳍条、皮肤、口腔、鳃盖内外表面和鳃丝;圆形内生孢子,直径约(9.8±1.8)(7.3～13.8)μm;孢子内环状细胞质和直径约(6.5±1.2)(3.9～8.3)μm的圆形折光体,鉴定其为肤孢虫。该物种测量值区别于其他肤孢虫,与寄生于鳜鳃的未定种(HB)测量值基本一致;与广东省和河南省的鳜源鳗鲡肤孢虫(GD和HN)以及HB寄生于相似部位。分子序列比对和系统发育结果显示,该物种与GD、HN、芬兰肤孢虫、鲑肤孢虫和寄生美洲鳗鲡的鳗鲡肤孢虫序列的一致性大于99%;与GD和HN的亲缘关系最近,与鲑肤孢虫次之,与芬兰肤孢虫和鳗鲡肤孢虫的亲缘关系较远。综上,该物种与已报道的寄生与鳜的肤孢虫为同种,并修订寄生鳜的鳗鲡肤孢虫的GD和HN分离株记录;将本研究肤孢虫和HB、GD和HN分离株一同命名为鳜肤孢虫(Dermocystidium sinipercae sp. n.),新种。鳜肤孢虫种内形态差异可能与采样时间和发育阶段有...     

鳜脑神经元的原代培养与鉴定

目前鱼类神经细胞模型极少,物种间的差异性使鳜在细胞水平上的研究具有极大的局限性,为建立一种简单易行的鳜脑神经元细胞模型进一步研究鳜神经系统,本实验取3月龄鳜,联合胶原酶消化法和机械吹打法分离出鳜脑细胞,用含20%FBS的L15培养液制成细胞悬液接种在细胞培养瓶内,于28°C无CO₂培养箱中培养,3 d后更换培养基,待细胞贴壁长满瓶底后进行传代培养;采用Neu-N和β-tubulin免疫荧光细胞化学技术鉴定鳜脑细胞神经元纯度。结果显示,鳜脑细胞分离培养2 d后贴壁状态较好,随着时间延长,贴壁细胞增多,细胞突起相互连接,培养5 d后神经元胞体丰满,细胞数量明显增多,突起相互间形成了明显的神经网络。经Neu-N和β-tubulin免疫荧光细胞化学技术鉴定鳜脑神经元细胞纯度可达95%以上。研究表明,该鳜脑细胞的分离培养方法简单易行,且可获得高纯度的鳜脑神经元细胞。     

Effect of dietary lipid on growth,expression of canthaxanthin‐based coloration,digestive enzymes activities and immunity in blood parrot cichlid Amphilophus citrinellus × Paraneetroplus synspilus

A 42‐day experiment was carried out to evaluate the effects of four different lipid containing diets (lipid 74.0, 105.3, 135.0, 168.1 g/kg diet) on growth, digestive enzymes activities, immunology and expression of canthaxanthin‐based coloration in parrot cichlid (Amphilophus citrinellus × Paraneetroplus synspilus). Each diet contained canthaxanthin 0.05 g/kg diet. Two hundred and eighty‐eight fish were randomly stocked into 12 glass aquaria to form four triplicate groups. Fish were fed one of four diets daily at 20 g/kg of their total body weight. Growth, digestive enzymes activities, immunology and body colour parameters were measured at the end of experiment. Based on the polynomial regression of dietary lipid level and specific growth rate, the dietary lipid level inclusion was calculated as 117.2 g/kg for the highest specific growth rate of these animals. The polynomial regression of skin colour parameters and dietary lipid levels indicated the critical threshold lipid inclusions in diet: 113.7 g/kg for the best expression of lightness, 112.1 g/kg for redness, 127.5 g/kg for yellowness and 125.3 g/kg for chroma of fish's skin. Considering redness, lightness and specific growth rate are most important variables, a diet containing lipid 115.0 g/kg can be recommended for blood parrot cichlid.     

罗非鱼维氏气单胞菌的分离鉴定和药敏实验

从患病罗非鱼(Oreochromis niloticus)鱼苗的病灶处分离到1株细菌GDZ1,人工感染试验显示,该分离株具有较强毒力。经ATB 32E细菌鉴定系统鉴定、补充生化鉴定和16SrRNA基因序列分析,确定该病原菌为维氏气单胞菌(Aeromonas veronii);药敏实验结果显示,29种药物中,米诺环素等15种化学试剂对该病原菌具有较强的抑菌作用。     

虹鳟源嗜冷黄杆菌的分离鉴定及致病性研究

为确定患病虹鳟的病原,本实验从患病鱼溃烂肌肉中分离到2株细菌,分别命名为CH06和CH07,经回归感染证实分离菌株为导致此次虹鳟患病的病原菌,并进一步对其形态特征、理化特性、分子特征、血清型及耐药性进行分析。结果显示,CH06和CH07株在TYES琼脂平板上呈煎蛋状外观,产黄色素,氧化酶和过氧化氢酶呈阳性,能水解明胶和酪蛋白,不能水解淀粉,不能利用果糖、半乳糖和七叶苷等。16S rRNA比对结果显示,CH06和CH07株与嗜冷黄杆菌模式株NBRC 15942的同源性分别为99.35%和99.42%。综合菌株理化和分子特性确定CH06和CH07株为嗜冷黄杆菌。利用多重PCR方法鉴定CH06和CH07株的血清型均为1型(Fd型);多位点序列分型(MLST)分析表明,CH06和CH07株的基因型分别为ST-12和ST-78型,且均属于CC-ST10克隆型。人工感染结果显示,CH06和CH07株对虹鳟幼鱼具有较高致病性,其半致死浓度(LD₅₀)分别为7.1×10⁵和1.1×10⁵ CFU/mL,攻毒剂量与临床病症出现时间呈反比,从人工感染实验鱼的肌肉、脾脏等组织中可重新分离到嗜冷黄杆菌。组织病理变化显示,病鱼肝细胞肿胀,空泡变性,部分肝细胞溶解坏死,细胞核溶解消失;脾脏充血、出血,淋巴细胞减少,红细胞和含铁血黄素增多;肌纤维间隙增宽、断裂、弯曲不齐,部分肌细胞肌浆溶解呈蜂窝状。CH06和CH07株对10种抗菌药物的耐药谱略有不同,均对氨苄西林和甲氧苄啶-磺胺甲噁唑敏感;CH06株对恩诺沙星、氟苯尼考等耐药,而CH07株对恩诺沙星和氟苯尼考中度敏感。本研究首次报道了我国虹鳟源嗜冷黄杆菌的分离鉴定及生物学特性,以期为虹鳟细菌性冷水病的防控提供科学依据。