猪传染性胸膜肺炎PCR诊断方法的建立与应用

为调查猪传染性胸膜肺炎的流行状况,本试验建立了检测胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneaumoniae, App）的PCR方法。对186份病死猪病变组织及545份无临床症状健康猪鼻拭子进行了App的PCR检测。结果186份病料中App阳性率占43.0%（80/186）,545份猪鼻拭子中App阳性占9.4%（51/545）。该PCR方法可作为App临床诊断的重要手段之一。通过调查表明,聊城地区存在猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的隐性感染及流行。     

猪胸膜肺炎放线杆菌PCR检测方法的建立

根据已经发表的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(App)dsbE-like基因的序列,设计了一对可扩增374bp目的片段的特异性引物。经PCR扩增,App1-4和6-10型标准菌株均能扩出约374bp的片段,而对大肠埃希菌(K88)、巴氏杆菌(5:A)和链球菌(Ⅱ)的扩增结果均为阴性。用建立的方法来检测分离菌株MC、ME和MH,结果表明,该方法能用于临床分离株的检测。灵敏性试验表明本方法对App菌液最低检出浓度为71cfu/mL。建立的PCR检测App的方法可用于临床上对App的检测。     

猪胸膜肺炎放线杆菌PCR检测方法的建立

根据猪胸膜肺炎放线杆菌(APP)外膜脂蛋白基因序列，设计合成了1对特异性引物。经PCR扩增，APP1～10标准血清型菌株均能扩增出大小为980bp的DNA片段，而大肠埃希氏茵、猪多杀性巴氏杆菌、猪链球菌、猪肺炎霉形体和葡萄球菌等的扩增结果均为阴性。该方法检测APP DNA的敏感性可达2pg。表明，此PCR方法特异性好，敏感性高，可用于猪传染性胸膜肺炎的快速诊断。     

猪传染性胸膜肺炎快速PCR诊断

根据GenBank中猪胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropeumoniae，App）外膜蛋白（oml）基因序列，设计合成1对特异性引物，进行PCR检测。时App1、2、3、4、5a、5b、6、7、9型参考株均扩增出大小为1010bp左右的片段，而时马链球菌兽疫亚种、多杀性巴氏杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、副猪嗜血杆菌、产肠毒素大肠杆菌等均未扩增出任何条带。用相应的限制性内切酶分别酶切PCR扩增产物，均得到与预期一致的结果；PCR检测的敏感度迭10CFU。将建立的PCR方法初步应用于6头人工发病猪的鼻拭子和痛死猪的肺组织．均得到较好的检测结果．     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌PCR检测方法的建立及应用

猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌引起猪的一种高度接触性呼吸道传染病,该病可给养猪业造成巨大的经济损失。为有效控制和确诊该病,根据报道的猪胸膜肺炎放线杆菌APXIV毒株的基因序列,合成了2对可扩增长度分别为442 bp和378 bp的特异引物,建立检测胸膜肺炎放线杆菌的巢式PCR方法。利用合成的引物在扩增猪肺疫巴氏杆菌、猪链球菌、副猪嗜血杆菌和大肠杆菌等细菌DNA时,结果均为阴性。用引物检测猪胸膜肺炎放线杆菌的标准菌株可扩增出442 bp和378 bp的特异性条带。表明运用PCR法检测猪胸膜肺炎放线杆菌的特异性和灵敏性均较高,可作为猪传染性胸膜肺炎的快速诊断和流行病学调查的手段。     

猪胸膜肺炎放线杆菌PCR诊断方法的建立与应用

根据胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣ基因设计1对引物，扩增特异的650bp棱酸片段，建立了应用PCR检测猪胸膜肺炎放线杆菌的方法。特异性试验结果表明，12个血清型的放线杆菌参考菌株均能扩增出650bp特异性的核酸片段，而大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、猪肺炎支原体、伤寒沙门氏菌和支气管败血性波氏杆菌的扩增结果均为阴性。敏感性试验结果表明，PCR的最低检出限量为500个放线杆菌。利用建立的PCR检测方法对22株从山东省不同地区分离的疑似胸膜肺炎放线杆菌菌株进行检测．结果14株为阳性。对感染猪病变组织的检测结果表明，病变部位不同，胸膜肺炎放线杆菌的检出率不同，其中以扁桃体的检出率最高。     

猪胸膜肺炎放线杆菌PCR检测方法的建立及临床应用

为建立直接检测可疑病料中胸膜肺炎放线杆菌（APP）的PCR诊断方法，对用以扩增apxⅣA毒力基因3’端长约442bp的核苷酸片段的引物、模板、Taq DNA聚合酶、dNTPs的最适剂量及退火温度进行了优化筛选，并进行了特异性及重复性试验；以筛选出的优化条件，对临床可疑病料进行了PCR检测。结果，在25μL体系中，以5pmol／μL引物、0．25μL Taq DNA聚合酶、2mmol／L dNTPs、56℃退火温度对APP标准菌株apxⅣA毒力基因的扩增效果最好，重复性和稳定性高；而对类症菌株的扩增结果则为阴性，表明其特异性强。对分离到APP的病料PCR阳性率为100％（5／5）；未分离到APP的纤维渗出性病料中，新鲜与陈旧病料PCR阳性率分别为70．59％（12／17）、50．00％（4／8），而非纤维渗出性病料的PCR结果均为阴性（0／45、0／9）。结果表明，建立的PCR方法特异、快速、稳定、敏感，优于细菌学方法，它可作为APP可疑病料的理想诊断方法。     

猪胸膜肺炎放线杆菌快速PCR检测方法的建立

根据猪胸膜肺炎放线杆菌 (Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)的 apx A基因序列设计了 1对可扩增 1个4 2 2 bp片段的特异性引物 ,成功地建立了一种检测 APP的快速 PCR方法 ,并确定了其特异性和灵敏性。对血清 1～ 13型等 13个 APP标准株均能扩增出预期 4 2 2 bp的特异性条带 ;对猪副嗜血杆菌、多杀性巴氏杆菌、支气管败血波氏杆菌、大肠杆菌、葡萄球菌、链球菌的扩增结果为阴性。对 APP菌液最低检出浓度为 6 8CFU/ m L(D6 0 0 为 0 .0 0 3)。 12株临床分离菌的 PCR扩增结果与生化鉴定结果是一致的。该方法能从病料中分离培养 8h的混合菌群中快速检测APP,可用于 APP的快速诊断和流行病学的调查。     

猪传染性胸膜肺炎病例报告

为了确诊猪场1例疑似猪传染性胸膜肺炎的病例,本试验首先对该猪死亡前的临床症状进行了解,然后对死亡猪进行剖检并利用收集的病料进行细菌分离培养、质谱分析、PCR检测和组织病理学等实验室诊断。结果显示,该猪死亡前表现出体温升高、呼吸窘迫和鼻内流出血色样泡沫分泌物等临床症状,剖检发现胸腔积液、肺脏出血和肿大等病理变化。实验室诊断结果显示,胸腔积液、血液和肺脏等病料中分离获得的菌株为血清型7型胸膜肺炎放线杆菌。组织病理学观察结果显示,肺脏组织表现为出血性纤维素性肺炎,肺泡渗出液中可见蓝染的菌团;心脏、肾脏、淋巴结、肝脏和脾脏等其他脏器均有不同程度的出血、淤血、水肿和淋巴细胞浸润等组织病理学变化。综合以上诊断结果,确诊该猪为猪胸膜肺炎放线杆菌感染。     

猪传染性胸膜肺炎诊断与防治

猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌(Actino baci llus pkumpneumon泌．App)引起猪的一种严重呼吸系统传染病。该病在我国感染率、发病率日益增高，损失重大。尤其在一些高密度饲养、管理不当、环境较差的猪场更容易发生。为此，笔者对我县某猪场发生该病的诊断与防治的经验总结一下，供广大的养猪者及同行借鉴。     

猪胸膜肺炎放线杆菌、猪多杀性巴氏杆菌、副猪嗜血杆菌复合PCR检测方法的建立

在已经建立的猪胸膜肺炎放线杆菌(APP)、猪多杀性巴氏杆菌(PM)、副猪嗜血杆菌(HPS)的单项PCR诊断方法的基础上,通过对扩增条件的筛选,成功地建立了APP、PM、HPS复合PCR诊断方法,并应用于临床。利用一次PCR反应,即可同时扩增APP的342bp、PM的457bp和HPS的821bp的特异性片段。该方法的建立对临床上进行这3种疾病的鉴别诊断和混合感染的检测都具有重要意义。     

胸膜肺炎放线杆菌血清学分型多重PCR方法的建立

10株胸膜肺炎放线杆菌参考菌株,经过纯化、扩增、提取基因组DNA,设计一套特异性引物,运用多重PCR技术,对外毒素基因apxⅠ、apxⅡ和apxⅢ进行扩增,产物经1.6%琼脂糖凝胶电泳,可将10株参考菌株分为5个血清群。血清Ⅰ群由259(血清1型)、263(血清5型)、267(血清9型)组成。血清Ⅱ群由260(血清2型)、262(血清4型)、264(血清6型)、266(血清8型)组成。血清Ⅲ群、血清Ⅳ群和血清Ⅴ群分别由261(血清3型)、265(血清7型)和268(血清10型)单独组成。对于血清Ⅰ群和血清Ⅱ群,通过apxⅣ进行扩增,结果259(血清1型)、263(血清5型)和267(血清9型)分别扩出2.4kb、2.8kb和1.6kb片段;262(血清4型)、264(血清6型)、260(血清2型)或266(血清8型)分别扩出1.6kb、2.0kb、2.8kb片段。     

猪胸膜肺炎放线杆菌的分离及PCR诊断方法的建立

APXⅣA基因是新发现的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP)的RTX毒素基因,本文通过PCR方法从APP标准血清1型及临床分离到的3株野毒株中扩增出长为442 bp的部分APXⅣA基因,而从其它引起猪呼吸道疾病的细菌中无法扩增出此片段.通过玻板凝集试验鉴定这三株野毒株为血清1型APP.所建立的PCR方法能检测的DNA量最高敏感度为28pg.表明本文所建立的对猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的PCR诊断方法具有较高的特异性和敏感性.     

胸膜肺炎放线杆菌PCR检测方法的建立及临床应用

为建立检测可疑病料中猪胸膜肺炎放线杆菌(App)的方法,针对App的RTX毒素(ApxⅣA毒素)毒力基因长约449 bp的片段设计引物,以App 10个血清型的基因组分别作为模板,对PCR扩增条件进行优化筛选,并进行了特异性及重复性试验。对副猪嗜血杆菌、马链球菌兽疫亚种、多杀性巴氏杆菌的扩增结果为阴性,表明该PCR方法特异性强,建立了该菌的种属特异性PCR方法。以筛选出的优化条件,对22份临床可疑病料进行了检测。结果表明,建立的PCR方法特异、快速、稳定、敏感,优于传统的细菌学方法,可作为App可疑病料的检测方法。     

猪胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌复合PCR检测方法的建立

目的建立可以同时检测猪胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌的快速而可靠的PCR检测方法。方法和结果根据胸膜肺炎放线杆菌的Apx-VIA基因序列、多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌的16SrRNA基因序列设计5条引物。猪胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌模板的PCR扩增产物大小分别为342bp,485bp和1258bp。复合PCR对1～12型猪胸膜肺炎放线杆菌标准株,6株多杀性巴氏杆菌标准株,1～15型副猪嗜血杆菌以及25株经生化鉴定确认为上述三种细菌的分离株的基因组DNA作为模板进行检测,均获得预期大小的扩增产物。以猪放线杆菌、吲哚放线杆菌等14种常见细菌作为阴性对照进行PCR检测,结果仅有支气管败血波氏杆菌产生了可以和上述三个特异性条带明显区分的PCR产物。复合PCR针对胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌的敏感性分别为14pg、34pg和37pg。结论本研究建立的复合PCR特异性好,敏感性高,可以用于猪胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌的快速检测。     

胸膜肺炎放线杆菌的实时荧光PCR检测

猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP）引起的危害养猪业的五大疾病之一。至目前为止App共报道有2个生物型15个血清型。所有型都可能致病，但有显著差异。使用血清学方法监测猪传染性胸膜肺炎有其局限。一些猪细菌分离培养阳性，但血清反应仍为阴性，对这些猪群只能使用病原分离进行确诊。亚临床感染及处于潜伏期的动物，     

胸膜肺炎放线杆菌对四环素类抗生素的耐药分析及相关基因检测

四环素类药物是在兽医临床中常用的一类抗生素,为了解胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae, APP)对四环素类抗生素的耐药情况,本研究对从临床分离鉴定的85株APP进行了四环素类抗生素临床耐药情况和相关基因的分析和检测。应用药敏纸片法进行药敏试验,结果:APP对四环素的耐药率较高为76.5%,其次为金霉素54.1%、美他环素48.2%、多西环素45.9%、土霉素28.2%、米诺霉素25.9%、替加环素22.3%。采用PCR方法对四环素类10种耐药基因tetA、tetB、tetC、tetD、tetE、tetG、tetH、tet1、tetL1和tetL2进行检测,结果:tetA、tetB、tetC、tetD、tetE、tetG、tetH、tet1、tetL2、tetL1耐药基因的扩增阳性率分别为78.8%、41.2%、15.3%、8.2%、21.2%、15.3%、43.5%、24.7%和30.6%,而tetL1扩增则全部阴性,未检出其耐药基因。本研究结果为四环素类抗生素在猪传染性胸膜肺炎临床上的应用和新药研发提供了一定的理论依据。     

套式PCR和实时荧光PCR在检测胸膜肺炎放线杆菌上的应用

应用胸膜肺炎放线杆菌套式PCR和实时荧光PCR检测方法分别检测了不同来源的猪鼻拭子、肺、扁桃体等494份样品。套式PCR 77份阳性,实时荧光PCR 62份阳性,前者的阳性完全覆盖了后者的阳性,两者符合率为97%(479/494)。2种方法均可应用于猪传染性胸膜肺炎的诊断和监测。