宿主域扩大的重组救活昆虫杆状病毒表达载体的构建及外源基因的表达

通过克隆的家蚕核多角体病毒解旋酶基因DNA与重组救活可线性化的苜蓿尺蠖核多角体病毒基因工程载体病毒 (BacPAK6 )DNA在昆虫细胞中发生重组 ,经累代筛选获得了既可感染家蚕又可感染秋粘虫细胞Sf 2 1的宿主域扩大的昆虫杆状病毒表达载体 (HyBacPAK6 )。HyBacPAK6DNA经Bsu36Ⅰ酶切后与含植酸酶基因的转移载体pVL1393 phy在家蚕细胞中重组后 ,通过蓝白斑筛选发现重组率可达 90 %以上。然而以杂交病毒为载体的外源基因表达量仅为以BmNPV为载体病毒的表达量的 2 0 %左右。分析认为HyBacPAK6可用于表达一些对蚕体有害的外源基因。     

家蚕肠液对昆虫杆状病毒感染性的影响

用电击法取 5龄第 4天的家蚕肠液 ,加入家蚕核多角体病毒 (BombyxmoriNucleopolyhedrosisVirus)和宿主域扩大的苜蓿尺蠖核多角体病毒 (HybridAutographacalifornicaNucleopolyhedrosisVirus)的多角体或游离病毒粒子 ,分别作用 70min和 4 0min后 ,感染家蚕细胞Bm 5和秋粘虫细胞Sf 2 1,发现病毒粒子已经被家蚕肠液灭活。进一步用BmNPV多角体喂饲 2龄蚕后 ,收集 2 4h内的蚕粪 ,用培养基浸泡后 ,抽提液中亦不含有具感染性的病毒粒子。上述结果说明家蚕肠液对昆虫杆状病毒的病毒粒子具有很好的灭活作用。因而 ,在家蚕核多角体病毒病预防上 ,提高蚕的健康水平、注意起蚕处理和饲养密度、及早发现和隔离病蚕是有效的防治措施。     

体外培养蓖麻蚕蛹精巢组织细胞对核型多角体病毒的敏感性分析

为开展核型多角体病毒与宿主互作关系的研究,建立蓖麻蚕(Philosamia cynthia ricini)细胞体外扩增体系,分析其对不同核型多角体病毒的敏感性差异。采用剪切分离后的蓖麻蚕蛹精巢组织材料,将分散的细胞在TNM-FH培养基中经数月换液培养后,获得了扩增的蓖麻蚕蛹精巢细胞系(BMC1)。BMC1的倍增时间约为65h。病毒的感染性实验表明:BMC1细胞对苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)比较敏感,在感染的细胞中可以明显地观察到多角体;家蚕核型多角体病毒(BmNPV)的多角体蛋白基因启动子可以在BMC1细胞中表达,但难以观察到多角体形成和细胞的病变,提示BMC1可以作为BmNPV的稳定化表达受体;而蓖麻蚕核型多角体病毒(PcrNPV)单独感染BMC1细胞时,无明显病变,只有在与AcNPV混合感染时可观察到PcrNPV多角体形成。BMC1细胞对不同核型多角体病毒的敏感性具有差异,不同核型多角体病毒的感染性差异的机制有待深入解析。     

苜蓿尺蠖核多角体病毒对家蚕核多角体病毒在蚕体内复制的干扰

昆虫杆状病毒具有相对狭窄的宿主域.虽然苜蓿尺蠖核型多角体病毒(AcMNPV)和家蚕核型多角体病毒(BmNPV)两者DNA序列的同源性在95%左右,但AcMNPV不能在家蚕细胞中很好的复制,对家蚕幼虫不具有致病能力,但其基因组中个别基因可在被接种该病毒的家蚕幼虫体内表达.这些基因的表达可能对共感染的优势病毒BmNPV复制所需原料蛋白及转录因子形成竞争,进而抑制BmNPV在家蚕幼虫体内的复制表达.     

家蚕血液型脓病的发生规律及防治方法

1家蚕血液型脓病的病原 家蚕血液型脓病是一种病毒病,是由于家蚕感染了核型多角体病毒而引起的。该病原属于杆状病毒科（Baculoviridae）,家蚕核型多角体病毒属（bombxy mori nucleopolyhedrovirus virus,简称家蚕NPV）。杆状病毒（Baculovirus）是一类专门寄生节肢动物的病原微生物,是囊膜包被的双链环状DNA病毒,病毒粒子呈杆状,基因组大小介于80～180kb之间。     

基于DNA载体的RNAi抑制家蚕核型多角体病毒复制

基于DNA载体的RNA i技术可以较长时间高效地抑制基因的活性。利用家蚕核型多角体病毒ie-1基因启动子,构建了在细胞内能转录形成与ie-1基因+19~+446区域互补同源的发夹状dsRNA的RNA i DNA载体。研究结果表明,该载体DNA在体外、体内均能较好地抑制家蚕核型多角体病毒在细胞中的复制。     

化学诱变的BmNPV对家蚕细胞和虫体感染性的初步研究

前文报道化学诱变剂对家蚕核型多角体病毒 (BmNPV)多角体形态有明显的诱变作用 ,诱变的BmNPV基因组对某些限制性内切酶的酶切电泳谱发生变化。本文研究进一步表明 :诱变BmNPV感染家蚕Bm N细胞的病变特征与对照相比没有明显不同 ,但形成不定形超大多角体的空斑时间延迟2～ 3d;诱变BmNPV感染家蚕幼虫后 ,病蚕体内各组织病变损害的感染程度 (易感性 )与对照基本相同。研究结果提示 ,诱变的BmNPV对家蚕培养细胞、虫体组织的感染性无显著变化     

利用RNAi技术培育家蚕核型多角体病毒抗性品种的研究进展

家蚕核型多角体病毒属于杆状病毒科,包涵体亚科,它引起的家蚕核型多角体病是蚕业生产上的主要病害,培育家蚕核型多角体病毒抗性品种是防治该病的有效措施,而RNAi技术为家蚕核型多角体病毒抗性品种的培育提供了新的方法。本文综述了近年来利用RNAi技术培育家蚕核型多角体病毒抗性品种的研究进展。     

国外蚕业文摘

1家蚕核型多角体病毒基因组的序列分析(Sumiko Gomi等,Journal of General Virology,1999(80),1323-1337)家蚕的致病性核型多角体病毒(NPV)(T3 strain)基因组被测序和分析。家蚕核型多角体病毒基因组是一个有128413核苷酸长的、鸟嘌呤 胞嘧啶含量占40%而且包括编码预测蛋白的全部60个氨基酸的136个开放读码框(ORF)。虽然表型不同,家蚕核型多角体     

从野桑蚕分离的NPV与BmNPV、ApNPV间的RAPD分析

将野外收集的野桑蚕核型多角体病毒(w-BmNPV)进行空斑筛选,纯化后的病毒通过碱裂解法抽提基因组DNA,以家蚕核型多角体病毒(BmNPV)和柞蚕核型多角体病毒(ApNPV)的基因组DNA为对照,用随机引物进行PCR扩增。结果表明:野桑蚕分离的NPV和BmNPV、ApNPV间存在较大的差异性,通过版本为1.3b的Treecomw软件分析,野桑蚕体内的NPV和BmNPV的同源关系较近,而与ApNPV的同源关系较远。     

家蚕核多角体病毒DNA聚合酶基因的克隆

从家蚕核多角体病毒（ＢｍＮＰＶ）基因组中克隆了完整的ＢｍＮＰＶＤＮＡ聚合酶基因。详细的限制性内切酶酶谱分析表明：ＢｍＮＰＶＤＮＡ聚合酶基因的限制性内切酶图谱与苜蓿尺蠖核多角体病毒（ＡｃＭ－ＮＰＶ）ＤＮＡ的聚合酶基因图谱完全一致，且在基因组中的位置亦相似。ＤＮＡ聚合酶基因的部分测序结果显示：ＢｍＮＰＶ与ＡｃＭＮＰＶ的ＤＮＡ聚合酶有高度的同源性，远高于ＡｃＭＮＰＶ和舞毒蛾核多角体病毒（ＬｄＭＮＰＶ）两者的ＤＮＡ聚合酶间的同源性，说明ＡｃＭＮＰＶ和ＢｍＮＰＶ间的亲缘关系比ＬｄＭＮＰＶ要近，从分子进化的角度来看，用表型性状进行杆状病毒科属以下的分类似乎并不适宜。     

蓖麻蚕核型多角体病毒的电镜观察

报道了蓖麻蚕核型多角体病毒 (PhilosamiacynthiariciniNuclearPolyhedrosisVirus)的超微结构的观察方法及观察结果 ,并对该病毒的超微结构进行了描述。病毒多角体为 12面体和多面体结构 ,大小不一 ,平均直径为 2 4μm ;多角体碱解后释放出杆状的病毒束 ,大小为 32 0～ 4 17nm× 83～ 2 2 7nm ,核衣壳大小比较均一 ,约为 32 0nm× 83nm。通过多角体超薄切片的横切面观察 ,囊膜内包被的核衣壳数变动于 1～ 10之间 ,只包被 1个核衣壳的数目最多 ,约占总数的 80 4 % ,病毒束在排列图式上存在差异。     

两广二号一代杂交种对NPV的抗性研究

家蚕血液性脓病是夏季养蚕极难控制的毁灭性蚕病,通过开展两广二号一代杂交种对NPV的抗性研究试验,得出结论:两广二号品种对NPV多角体病原具有很强的抗性,是陕南地区当前最适合饲养的夏用品种。     

苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒在家蚕蛹体内的复制及重组病毒外源基因的表达

家蚕蛹在复眼着色期,经4℃冷藏24小时后,可被Ac NPV(苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒)感染。在蛹体内复制出的多角体大小差异较大,且比在昆虫Sf—21细胞中繁殖的Ac NPV和在蚕蛹体内形成的Bm NPV多角体小。在蛹体内繁殖的Ac NPV的游离病毒可以回返感染Sf—21细胞。由蚕蛹内分离的Ac NPV基因组DNA的限制性内切酶图谱与野生型的Ac NPV相同。以上结果证明Ac NPV可以在蚕蛹体内复制。含HBsAg基因(人乙肝表面抗原)的重组Ac NPV亦可感染家蚕蛹,并能正确表达外源基因。此外,还发现化蛹后第2天的家蚕蛹被注射约5×10~5PFU的Ac NPV,可诱导“人工滞育蛹”现象的发生,在25℃经过30天后蛹仍存活,发育停滞在复眼着色前阶段。     

家蚕核型多角体病毒成纤维细胞生长因子基因的表达和定位

为了解杆状病毒基因组中成纤维细胞生长因子基因(fgf)的功能,分离纯化了BmNPV DNA,采用PCR方法获得了BmNPV的fgf基因,并克隆至原核表达载体pET28 a,构建了高效原核表达质粒pET28 af-gf。通过IPTG诱导表达后,经SDS-PAGE检测证实了在27 kD左右有一特异条带,与预测的蛋白质分子量大小一致,并通过N i2+-NTA离子交换树脂亲和纯化了目的蛋白。同时构建了融合GFP的真核表达载体pCDNA3.1-gfp-fgf,通过脂质体转染进入COS-7细胞进行表达和定位观察。fgf基因产物定位于细胞核。     

柞蚕血淋巴超氧化物歧化酶(SOD)活性的变化

柞蚕 (Antheraeapernyi)血淋巴超氧化物歧化酶 (SuperoxideDismutase,SOD)的活性随蚕的生长发育呈有规律的动态变化 ;SOD活性在 1～ 4龄随龄递减 ,5龄高于前 4龄 ,蛹期高于幼虫期。同一龄期内 ,以初、末期较高 ,将眠时较低。化蛹后 ,SOD活性迅速升高 ,至蛹中期达峰值 ,随后下降直至羽化。不同性别间SOD活性以雌性较高。不同品种间SOD活性存在较大差异。接种柞蚕核型多角体病毒 (AntheraeapernyiNuclearPolyhedrosisVirus,ApNPV)后 ,血淋巴SOD活性发生显著变化。研究认为 ,柞蚕血淋巴SOD活性与蚕的生长发育、体内代谢密切相关     

家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)侵染草地贪夜蛾卵巢细胞(Sf21)体系的建立

家蚕微孢子虫(Nosemabombycis,简称N.b)经KOH处理后,接种于草地贪夜蛾卵巢细胞(Sf21),建立家蚕微孢子感染增殖体系,同时,对孢子与宿主细胞在感染增殖过程中的形态变化进行了跟踪观察。KOH处理的孢子发芽率约为67%,Sf21细胞的初期感染率约为4.3%,接种24h内,细胞感染率变化不明显,但随后逐渐增加,到接种后的第7天达76.9%。接种后第12天起,细胞内充满不同发育阶段的孢子,并可见大量的胞外游动孢子。随后,大量细胞破裂,孢子逸出后,破裂的细胞内出现大量囊泡,且有合胞体(巨型多核融合细胞)出现。另外,将感染孢子的家蚕中肠组织和丝腺组织用胰蛋白酶处理后直接接种Sf21细胞,不经发芽处理,细胞也能感染。     

BmNPV半胱氨酸蛋白酶基因的核苷酸序列研究

对家蚕核型多角体病毒苏州株（BmNPVsu）光胱氨酸蛋白酶基因（CP）的序列分析表明,该基因读码框为972个核苷酸,编码323个氨基酸。同源性分析表明,BmNPVsu的CP与首蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（AcNPV）、美国白蛾核型多角体病毒（HcNPV）、云杉卷叶蛾核型多角体病毒（CfNPV）、黄杉毒蛾核型多角体病毒（OpNPV）、舞毒蛾核型多角体病毒（Ld-NPV）在DNA水平上的同源性分别为96.5％、76.2％、74.9％、72.7％、62.9％;在氨基酸水平上的同源性分别为96.9％、77.1％、79.3％、77.1％、65.6％。BmNPV CP的氨基酸序列与不同来源的木瓜蛋白酶超家族的CP也具有较高的同源性,特别与 Trpanosoma brucei的CP具有较高的一致性,达32％。在组织蛋白酶B、H、L、S以及木瓜蛋白酶的36个保守氨基酸残基中有31种出现在BmNPVsu的CP中,BmNPVsu CP同其它杆状病毒CP一样,可看作木瓜蛋白酶超家族成员。     

家蚕胚胎细胞系(BmE-SWU2)同工酶的研究

以新建的家蚕胚胎细胞系(BmE-SWU2)细胞为材料,应用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Active-PAGE)不连续系统,进行α-酯酶(α-EST)、β-酯酶(β-EST)、乳酸脱氢酶(LDH)和苹果酸脱氢酶(MDH)的同工酶研究,观察了在建系过程中同工酶的表达情况,比较了BmE-SWU2细胞系与其源胚胎的同工酶差异。结果显示,在第10代和第25代之间,尚未有明显的表达差异。该细胞系和源胚胎同工酶的比较发现,二者的同工酶表达谱具有很高的相似性。