传染性法氏囊病病毒VP2基因的克隆及其重组鸡痘病毒转移载…

根据已发表的ＩＢＤＶ基因组序列设计并合成一对特异扩增ＩＢＤＶ ＶＰ２ｃＤＮＡ的引物，以纯化的ＩＢＤＶ－Ｄ７８弱毒疫苗株基因组为模板，利用ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增出约１．５ｋｂ产物。将ＰＣＲ产物克隆到ｐＵＣ１９的Ｓｍａｌ位点，经酶切图谱分析等方法鉴定出重组ＶＰ２ｃＤＮＡ质粒（ｐＶＰ２）。将ＶＰ２基因正向插入ＦＰＶ启动子ＬＰ２３Ｐ２下游，连同痘苗病毒启动子Ｐ１１启动的ＬａｃＺ报告基因盒插入ＦＰＶ转移载体中     

陕甘宁地区根瘤菌的16S rDNA PCR-RFLP分析

数值分类、全细胞蛋白电泳和ＤＮＡ同源性研究表明,分离自陕甘宁地区的２２株极瘤菌构成４个独立的新种群。在此基础上,进行了１６ＳｒＤＮＡ ＰＣＲ－ＲＦＬＰ分析,扩增产物经４种限制性内切酶酶切后,所得到的ＲＦＬＰ电泳图谱存在在的差异,ＲｓａＩ,ＨｉｎｆＩ,ＭｓｐＩ和ＨａｅⅢ的酶切图谱类型分别为１７、１６,２２和１８种。以ＵＰＧＭＡ法对１６Ｓ ｒＤＮＡ ＰＣＲ－ＲＦＬＰ普进行聚类,在９０％的相似性水平上４     

猪基因组AFLP指纹图谱的构建

摘要：对猪（Sus scrofa）基因组AFLP指纹图谱构建的各项条件进行了优化,包括双酶切消化、接头连接、预扩增和选择性扩增、凝胶电泳银染技术及荧光标记检测法等,建立了稳定的猪基因组DNA的AFLP指纹图谱构建方法,采用E32/T32引物组合在45个猪种基因组混合DNA中检测到28个多态标记。     

PCR技术在快生型大豆根瘤菌菌株鉴别上的应用

以基因外重复的回文因子（ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅｅｘｔｒａｇｅｎｉｃｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ，ＲＥＰ）和肠杆菌基因间重复一致序列（ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｌｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃｃｏｎｓｅｎｓｕｓ，ＥＲＩＣ）的碱基顺序设计出的引物为引物，用ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）技术分别扩增了８株快生型大豆根瘤菌（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）的总ＤＮＡ，得出了具有菌株特异性的扩增产物电泳图谱，称ＲＥＰ－ＥＲＩＣＰＣＲ指纹图谱，将所得图谱进行性状编码后，用计算机数值分类系统进行平均连锁聚类分析，得出这８个菌株的聚类树状图。这一聚类结果与用其它方法聚类结果基本一致，说明ＲＥＰ－ＥＲＩＣＰＣＲ是一种鉴别快生型大豆根瘤菌菌株的经济、快速而又可靠的新方法。     

苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因cry218的克隆和表达

从对棉铃虫高毒力的苏云金芽胞杆菌２１８菌株中克隆到杀虫晶体蛋白基因ｃｒｙ２１８，限制性内切酶图谱表明该基因属于ｃｒｙ１Ａｃ基因。改造了两个质粒载体，并以此将ｃｒｙ２１８基因克隆到Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０３和苏云金芽胞杆菌无晶体突变株Ｂｔｉ７８／１１中，重组菌均表达１３０ｋＤ蛋白质，对小菜蛾的杀虫率在稀释１０００倍和３０００倍时可分别达到９０％以上和８０％以上。     

甜菜坏死黄脉病毒新疆分离物外壳蛋白基因的序列分析

用根据国外已报道的甜菜坏死黄脉病毒（ＢＮＹＶＶ）的ＲＮＡ２的序列合成的两个引物，通过对ＢＮＹＶＶ新疆分离物的ＲＮＡ逆转录获得了ＢＮＹＶＶ的外壳蛋白基因的ｃＤＮＡ，经ＰＣＲ扩增后用Ｔ４聚合酶补平两端，克隆到ｐＧＥＭ－７Ｚｆ（＋）质粒的ＳｍａＩ位点，转化大肠杆菌ＤＨ５α，经筛选得到正向插入的重组质粒ｐＧＥＢ３。用ＰＣＲ扩增和酶切均得到５９０ｂｐ的ＤＮＡ片段。用ＡＢＩ３７０Ａ型ＤＮＡ全自动序列仪测出该ｃ     

应用反转录聚合酶链反应扩增新城疫病毒副合蛋白基因

本研究根据已发表的新城疫病毒核苷酸序列资料，设计了一对大小为２８ｂｐ的融合蛋白基因上，下游引物，以提纯的ＮＤＶ Ｆ４８Ｅ８株，Ｌａｓｏｔａ株和Ｕｌｓｔｅｒ株的基因组ＲＮＡ为模板，在禽反转录酶和Ｆ基因上游引物作用下，合成单链ｃＤＮＡ。再以ｃＤＮＡ为模板，由聚合酶链反应扩增了三毒株的Ｆ基因。     

烟草24kD PR蛋白基因的克隆及序列分析

烟草２４ｋＤＰＲ蛋白裂解晚疫病菌（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａｉｎｆｅｓｔａｎｓ）孢子囊并抑制其菌丝生长，是马铃薯晚疫遗传工程所需要的核心元件，我们以烟草（ＮｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍＸａｎｘｉ－ｎｃＮＮ）基因组ＤＮＡ为模板，通过事成５′－端及３′－端的一对特异引物，利用多聚酶锭反应（ＰＣＲ）扩增到得缺失３′－端ＣＴＰＰ的２４ｋＤ蛋白基因，并克隆到Ｅ．ｃｏｌｉ质粒上，序列分析表明，我们得到的２４ｋ     

蜂毒溶血肽（melittin）基因的克隆及序列分析

本项研究已克隆在λｇｔ１１载体上的编码蜂毒溶血肽２６个氨基酸的基因经酶切后，亚克隆到大肠杆菌Ｅ．ｃｏｌｉ的质粒ｐＵＣ １８的ＥｃｏＲＩ和ＰｓＩ位点上，构建成重组质粒ｐＵＭ１８，然后转化感受态的大肠杆菌ＪＭ１０１之中。经对转化子中重组ｐＵＭ１８上蜂窝溶血肽基因的ＰＣＲ扩增检测和序列分析，表明克隆成功。     

大肠杆菌猪水肿毒素B亚单位基因的克隆与鉴定

根据已知大肠杆菌志贺氏菌样毒素Ⅱ型变异体Ｂ亚单位（ＳＬＴ－ＩＩｖＢ）基因序列,设计并合成３条２对引物,以大肠杆菌Ｏ１３８基因组为模板,通过聚合酶链式反应（ＰＣＲ）分别扩增出２０４ ｂｐ的基因序列及包含一段信号肽的２６１ ｂｐ基因序列。将这两段ＤＮＡ分别克隆进表达性载体质粒ＰＹＡ３３３４的ＥｃｏＲⅠ和ＢａｍＨⅠ位点之间,经地高辛标记探针进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交和酶切分析鉴定,并对两条扩增片段进行序列     

弗氏中华根瘤菌基因文库的构建及与耐盐有关DNA片段的分离

以耐盐的弗氏中华根瘤菌ＲＴ１９菌株为材料，制备其总ＤＮＡ，经过限制性内切酶ＥｃｏＲＩ的部分酶解，利用电洗脱方法回收得到１５￣２５ｋｂ大小的ＤＮＡ片段。用ＱＩＡＧＥＮ－ｔｉｐ１００试剂盒方法，提取并纯化质粒ｐＬＡＦＲＩ，用ＥｃｏＲＩ将其切成线状。然后用Ｔ４ＤＮＡ连接酶将回收片段与线性载体连接，并利用包装蛋白进行包装，感染大肠杆菌ＳＰ１７．１，构建了ＲＴ１９的基因文库。以固体亚硝基胍作为诱变剂，在０．     

鸡生长激素受体基因的克隆与部分序列分析

利用高盐法从鸡血中提取高分子量ＤＮＡ，以λＥＭＢＬ３为载体构建了鸡染色体文库，用鸡生长激素受体ｃＤＮＡ基因的部分序列作探针，从文库中筛选得到３个阳性克隆。通过对阳性克隆Ｉ插入片段的酶切和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析，表明它含有全长的鸡生长激素受体基因，建立了该基因的限制性酶切图谱。将插入片段亚克隆到ｐＧＥＭ－７Ｚｆ（＋）质粒上，对含有基因５’端序列的２．５ｋｂＥｃｏＲＩ酶切片段进行了序列分析。     

盐单胞菌C6与耐盐有关DNA片段的克隆和序列分析

提取盐单胸菌（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ）Ｃ６的总ＤＮＡ,用Ｓｑｕ３ＡⅠ部分酶切,回收１５－３０ｋｂ的ＤＮＡ片段,以ｐＬＡＦＲ３为载体在大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α中构了该菌的基因文库。以Ｃ６的基因文库为供体,以费氏中华根瘤菌（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｆｒｅｄｉｉ）盐敏感菌株ＲＣ３－３＇为受体,在辅助质凿ｐＲＫ２０１３的协助下进行三亲本杂交,在选择培养基上筛选到接合子ＲＷＨ１５和ＲＷＨ１７。质粒检     

鼠伤寒沙门氏菌I相鞭毛蛋白基因fliC^i的克隆,鉴定

以提纯的鼠伤寒沙门氏菌８７０５染色体ＤＮＡ为材料，经ＥｃｏＲ Ｉ消化，过柱（ＳｅｐｈａｒｃｙｌＳ－４００），得到大于４００ｂｐ的酶切片段；然后随机克隆到质粒ｐＧＥＭ－３Ｚｆ（－）中，转化大肠杆菌ＬＣ２ａ（ｈａｇ＾－，ｒｅｃＡ＾－）；在氨苄青霉素平板上共得到６０１３个转化子，从中筛选出１个有动力的克隆，小量制备质粒ＤＮＡ，经酶切电泳鉴定，该克隆的外源片段大小为１５．３ｋｂ，将其命名为ｐＧＩ４０１５。     

镰刀菌rDNA ITS区 RFLPs分析

本实验采用PCR-RFLP技术分析了镰刀菌菌种间的多态性。运用SDS碱裂解法抽提了采自于山西省不同地区的11株镰刀菌（Fusarium）基因组DNA，并用一对特异性引物对其rDNA ITS区段进行扩增，选用4种限制性内切酶（TaqⅠ AluⅠ HaeⅢ EcoRⅠ）酶切PCR扩增产物，共得到16条多态性片段，其中特异性条带8条，分子量大约在70-900bp之间。利用NTSYS-PC(2.1)软件包分析各菌株间的DNA限制性片段多态性，总共可以分为５大组，与传统分类一致，说明该方法可以用于镰刀菌菌株间的多态性分析。     

大麦核糖体失活蛋白基因的克隆及序列分析

大麦核糖体失活蛋白属于Ｉ型核糖体失活蛋白，具有抗真菌特性。我们以大麦基因组ＤＮＡ为模板，通过合成５’－端及３’－端的一对特异引物，利用多聚酶链式反应（ＰＣＲ）扩增出了大麦核糖体失活蛋白编码序列，随后将其克隆到Ｅ．ｃｏｌｉ质粒上，序列分析表明，大麦核糖体失活蛋白基因由８４６个核苷酸组成，编码由２８１个氨基酸残基组合的多肽，与发表序列相比较，核苷酸序列及推导的氨基酸序理的同源性分别为９３．１％和９２％     

Gateway^TM系统快速构建番木瓜环斑病毒CP基因反向重复序列表达载体

设计含有attB侧翼序列的引物,用于番木瓜环斑病毒(Papaya ringspot virus)的外壳蛋白基因(CP)基因的PCR扩增.在BP重组酶的作用下,将CP基因与受体载体pDONRTM221发生重组反应,产生入门克隆.在LR重组酶作用下,将入门克隆与目的载体pHellsgate12发生重组反应,再进行平板培养筛选及PCR扩增和酶切反应.结果证明,用限制性内切酶Xho I酶切消化后,琼脂糖凝胶电泳获得了预期长度为1700 bp的重组片段;以启动子和外壳蛋白基因及外壳蛋白基因和终止子序列为基础,分别设计2对引物,经PCR扩增分别获得582和773 bp片段.结果表明,获得了含有内含子的CP基因反向重复结构的表达载体.     

高能重离子辐射诱导水稻半矮生突变株系的RFLP分析

本用限制性内切酶片段长度多态性分析技术，选用９７个已定位的水稻基因组同克隆为探针，分析了广东地方品种边皮占，香占及其种子经高能氩离子辐照后诱导产生的稳定半矮生害变株系Ａｒ－１０和氩香１号在ＤＮＡ水平上的变异。结果表明，边皮占和Ａｒ－１０之间位点变异率为５．１５％，香占和氩香１号之间位点变异率为６．３９％。研究显示，高能重离子辐射诱导的变异主要是ＤＮＡ分子较大的改变，而非点突变，用Ａｒ－１０与边坡     

刺芹侧耳(P1eurotus eryngii)rDNA的IGS2多样性分析

对8个刺芹侧耳（Pfeumfus eryngit）菌株进行了转录单位间隔区2（IGS2）分析,结果表明不同菌株的存在长度异质性和数量多态性。应用BsuRⅠ、Hin6Ⅰ、HpaⅡ和RsaⅠ限制性内切酶,对IGS2扩增产物进行酶切（IGS2-RFLP）,不同菌株的酶切位点不同,电泳后产生多样性丰富的图谱,成为菌株特有的DNA指纹,实验应用的4个限制性内切酶中的任何一个都可有效地将供试菌株加以鉴别。这一方法的结果重复性和稳定性良好,IGS2-RFLP有望作为刺芹侧耳菌株鉴定和鉴别的分子标记。     

核酸探针检测人工感染猪及死胎的猪繁殖与呼吸综合症病毒

利用反转录－聚合酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）技术扩增出猪繁殖与呼吸综合症病毒（ＰＲＲＳＶ）美洲株ＡＴＣＣ ＶＲ－２３３２ＯＲＦ６及部分ＯＲＦ７５８６ｂｐ的ｃＤＮＡ。将ＰＣＲ产物连接进线状克隆载体ｐＧＥＭ－Ｔｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ后获阳性重组质粒。用ＥｃｏＲＩ及ＳｍａＩ双酶切阳性重组质粒ＤＮＡ,回收４６３ｂｐ的小片段并以此制备出地高辛标记的核酸探针。应用该探针对４头鼻内人工感染ＡＴＣＣＶＲ－２３３２的