珍稀濒危龙血竭基源植物——龙血树

介绍了几种国内外龙血竭基源龙血树的资源状况和濒危的原因,建议龙血树的开发与保护要兼顾,确保龙血竭资源的可持续利用。     

基于DNA条形码技术的海南龙血树和剑叶龙血树分子鉴定

海南龙血树(Dracaena cambodiana)和剑叶龙血树(Dracaena cochinchinensis)是传统名贵中药血竭在中国的重要基源植物,但其在苗期至成株期之间难以用传统分类学进行鉴定,而DNA条形码技术为这一科学问题的解决提供了可能。本研究利用已经通过形态学鉴定的海南龙血树和剑叶龙血树叶片开发了两种龙血树的DNA条形码,发现ITS2具有较大的变异度,可与来自叶绿体的trnL-trnF作为鉴定的分子标记,并基于变异最大范围构建了分子标记的示意图。为探究龙血树的分子生态学上的进化地位,基于两种龙血树的ITS2序列与其同源的41个物种的ITS2序列构建了分子进化树,发现龙血树属植物与龙舌兰科、百合科组成分支的亲缘关系近于含有天门冬科的分支,此结果为海南龙血树和剑叶龙血树的种质资源鉴定提供了分子标记,并为龙血树属在百合纲确切分类地位的确定提供了理论和技术支持。     

低锌与正常供锌条件下玉米基因表达差异的研究

利用抑制差减杂交(Suppression subtractive hybridization,SSH)技术分离玉米低锌与正常供锌条件下表达有差异的cDNA片段.以低锌培养的玉米幼苗为试验方,正常供锌的玉米幼苗为对照方,建立正向差减文库;以正常供锌的玉米幼苗为试验方,以低锌诱导培养的玉米幼苗为对照方,建立反向差减文库.正、反向文库分别收集低锌和正常供锌条件下特异表达的cDNA片段.在2个文库中,各随机挑选30个克隆进行测序.序列分析表明,在正向差减文库中,分离得到的基因多与抗病防御、信号转导、细胞生长与分裂等方面相关;在反向差减文库中,分离得到的基因多与细胞组织发生及代谢等方面有关.     

黏类小麦育性相关基因SSH文库的构建

为了深入研究黏类小麦雄性不育的分子遗传机制, 利用抑制差减杂交技术构建了黏类小麦育性相关基因的cDNA文库。文库质量检测表明, 差减杂交效率较高, 质量较好。在不育和可育cDNA文库中随机挑选120个阳性克隆进行测序, 获得100余条高质量的表达序列标签(EST)。对序列进行BLAST比对及功能注释, 比较了不育和可育cDNA文库的基因表达谱, 发现在可育cDNA文库中参与能量代谢的基因出现频率较高, 在不育cDNA文库中检测到了与花发育调控相关的MADS-box转录因子、细胞凋亡相关的泛素结合酶及阻遏淀粉合成的腺苷二磷酸葡萄糖磷酸化酶等相关基因。这些基因很可能与育性相关。     

小麦大粒突变体的SSH文库构建及分析

为了获得控制小麦籽粒大小的相关基因,本研究以小麦大粒突变体8008和烟农15为材料,利用抑制消减杂交技术,构建抑制消减cDNA文库。在双向库中随机挑取20个阳性克隆进行测序,共获得24条EST序列。在GenBank数据库中进行Blast比对和功能分析,12条EST与已知功能基因高度同源,主要包括光合作用相关基因、物质代谢相关基因、RNA功能相关基因等;5条EST序列与未知功能的禾本科作物cDNA片段高度同源,7条EST未能找到同源性匹配。     

杉木木质化过程特异表达基因文库的构建与分析

研究木质部木质化过程及其生物学特性对于了解木本植物水分和矿物质的吸收及运输机制、木材形成的遗传控制、改良材性及提高木材生长量具有十分重要的意义。为了获得杉木木质化过程中特异表达的基因,本研究利用抑制差减杂交技术,以杉木突变体独干杉无性系为测试方(Tester),正常的句容0号无性系为驱动方(Driver),构建了正向和反向两个差减文库,分别获得了618和409个克隆。利用通用引物T7和SP6进行PCR及EcoRⅠ酶切鉴定文库重组子,结果证明所构建的文库符合要求,具有代表性。该文库的成功构建为获得杉木木质化过程中特异表达的基因及深入了解木本植物木质化的机理奠定了基础。     

香蕉果实采后抑制差减文库的构建与鉴定

抑制差减杂交技术(suppression subtracfive hybridization,SSH),是抑制PCR与差减杂交技术相结合而产生的。其优点是在差减杂交过程中使不同丰度cDNA的拷贝数差异趋于均衡,因此不同丰度的差异表达基因都能得到有效克隆,能有效分离低丰度的差异表达基因,避免了表达序列标签分析中高丰度基因重复测序的缺点。因此SSH技术被应用于植物差异表达基因的分离。香蕉果实采后成熟过程中发生一系列复杂的生理变化,这些变化涉及到许多基因的表达。为了研究香蕉果实采后与采前在基因表达上的差异,我们首次采用抑制缩减文库的方法,以分离香蕉果实在采后表达的基因。以采后0h的香蕉果实cDNA为驱动子,对香蕉果实采后48h果实cDNA为待测子,进行抑制缩减杂交,抑制缩减杂交产物与pGEM—TEasy Vecter连接,转化E．coli DH5α,构建了抑制缩减文库。该文库共包含312个克隆,采用PCR方法对文库进行了重组子的鉴定,共有302个重组子。该文库的构建成功为深入研究香蕉果实采后基因的表达奠定了基础,为研究香蕉果实采后成熟的分子生物学机理提供了一个新的思路。     

抑制性差减杂交(SSH)技术在分离植物差异表达基因中的应用

抑制性差减杂交技术（SSH）是基于抑制PCR作用的cDNA差减杂交，是在转录水平上研究差异基因表达的技术。该技术在一个循环过程中完成差异表达基因丰度的均等化及目标群体和对照群体中相同基因的去除，从而实现差异表达基因的高度富集。一个典型的SSH过程，可在一个差减杂交过程中将稀有基因序列富集上千倍。本文通过详细分析该技术在植物差异表达基因分离中的应用发现：SSH技术主要用于分离组织特异性表达和诱导型表达的基因。首先，SSH技术广泛应用在分离植物发育过程中不同发育阶段和不同组织器官中的组织特异性表达的基因，为揭示植物生长发育过程的分子机理提供了有效手段；另外，在不同植物中，该技术被大量应用于分离各种生物及非生物胁迫条件下诱导表达的抗性相关基因，可以揭示植物抗逆的分子机理。目前，SSH技术己开始应用于分离与次生代谢产物合成相关的基因。SSH技术是分离植物差异表达基因，揭示植物复杂生命现象分子机理的有效方法，将在植物差异表达基因研究中得到更广泛的应用。     

富集小麦磷胁迫响应基因的cDNA差减文库构建和部分ESTs的功能鉴定

植物在形态学和生化代谢水平上对低磷胁迫逆境的响应,是特异表达基因在时空上精细协同作用的结果.以前期工作中鉴定的磷高效小麦品种石新828为材料.构建了富集不同低磷处理时间点特异表达基因的根系cDNA差减抑制杂交文库.获得的克隆总数为2 682个.对随机选取的文库克隆研究发现,克隆中插入的片段长度为250～750 bp.测序结果和功能比对发现,具有功能比对结果的克隆比例为70%,其中部分分别与小麦、大麦、水稻、玉米和拟南芥等植物种属高度同源,参与转录调控、蛋白质合成和代谢等多个生物学过程.该富集低磷胁迫响应基因文库为进一步鉴定小麦响应磷胁迫逆境的基因调控网络和克隆重要的磷高效相关基因奠定了坚实的基础.     

海南龙血树基因组DNA提取方法比较

摘 要：为选择一种简单、快速、有效的海南龙血树总DNA的提取方法,分别采用CTAB法、SDS法、SDS-CTAB法和改良CTAB法提取海南龙血树嫩叶片的总DNA,用琼脂糖凝胶电泳、紫外分光光度计和ISSR对所提取的总DNA进行检测。结果表明,改良CTAB法提取的DNA A260/A280在1.7-1.9之间,纯度高、杂质少、DNA完整性好。以该方法提取的总DNA为模板进行ISSR扩增,谱带清晰,多态性、稳定性、重复性好。该法提取的总DNA适用于PCR扩增和其他分子生物学研究是有效提取海南龙血树基因组的方法。     

不同年龄三七根皂甙合成相关基因的差减cDNA文库构建

本研究以三七3年生根和1年生根为材料,利用抑制消减杂交技术构建三七根在不同年龄阶段皂甙合成相关基因的差减cDNA文库,正向文库(3年生文库)和反向文库(1年生文库)分别包括2000个和500个cDNA克隆,重组率在95%以上;外源片段的长度分布在200～900bp,平均片段长度约500bp;差减效率检测表明:消减前后基因的拷贝数相差32000倍,差异表达的基因得到了充分的富集。结果表明所构建的cDNA文库符合SSH文库的质量标准,能够满足下一步的实验要求,为研究差异表达基因,探讨皂甙生物合成的分子机理,提高三七皂甙产量产量和质量奠定基础。     

木质素生物合成途径中关键酶基因的分子特征

本文主要对苯丙氨酸裂解酶（phenylalanine ammonia-lyase,PAL）基因、4-香豆酸辅酶A连接酶（4-coumarate-CoA ligase,4CL）基因、肉桂醇脱氢酶（cinnamyl alcohol dehydrogenase,CAD）基因、过氧化物酶（peroxidase,POX）基因、漆酶（laccase,LAC）基因、dirigent（DIR）蛋白基因等木质素生物合成途径中关键酶基因的克隆、表达、调控等研究进展进行综述,旨在揭示上述木质素生物合成途径中关键酶基因的分子特征,为通过转基因技术来调控植物体中木质素的含量及其化学组成从而得到改良的新植物资源提供思路。     

甘蓝型油菜脯氨酸合成相关同源基因的进化和差异表达分析

以异源四倍体甘蓝型油菜(Brassica napus)及其二倍体祖先白菜(B.rapa)和甘蓝(B.oleracea)为对象,研究了脯氨酸合成途径关键酶基因P5CS和OAT的进化命运以及各自不同祖先来源的同源基因的差异表达情况。序列比对和进化分析表明,甘蓝型油菜中P5CS基因和OAT基因和其二倍体祖先的相对应基因高度同源;进化上,和二倍体亲本相比甘蓝型油菜P5CS2基因发生了1个拷贝的丢失,而OAT基因没有基因丢失现象;半定量RT-PCR结果表明,甘蓝型油菜中来自二倍体亲本白菜和甘蓝的P5CS2和OAT同源基因在所有检测器官中均表达,没有发生基因沉默;但是它们可能发生了亚功能化,不同祖先来源的2个P5CS2同源基因存在较弱的偏向性表达,不同器官的同源基因表达模式稍有不同;而OAT基因明显偏向于表达来自于甘蓝祖先的同源基因,OAT的2个同源基因的不同器官表达模式基本一致;盐胁迫处理后,来自于甘蓝的BnaC.P5CS1.d表达量显著高于来自于白菜的Bna A.P5CS1.a,表明盐处理条件下甘蓝型油菜偏向性表达BnaC.P5CS1.d。甘蓝型油菜的脯氨酸合成基因Bna A.P5CS1.a、BnaC.P5CS1.d及Bna A.P5CS2.a、BnaC.P5CS2.c的盐诱导表达模式均基本保持了亲本来源基因的特征。以上结果表明,与二倍体祖先相比,甘蓝型油菜中脯氨酸合成基因序列和表达模式均存在高度保守性,这可能说明了脯氨酸积累在进化上对植物的有利性。     

植物类胡萝卜素生物合成相关基因的表达调控及其在植物基因工程中的应用

类胡萝卜素是人类饮食结构中不可缺少的重要成分,具有多种重要的保健功能,尤其是有些类胡萝卜素,如β-胡萝卜素是合成维生素A的前体,具有抗癌和提高免疫力等功效。类胡萝卜素还广泛用于医药和化妆品工业。迄今为止,自然界中发现的大多数类胡萝卜素都是微量的中间产物,很难直接利用。本文概述了高等植物类胡萝卜素生物合成途径、类胡萝卜素生物合成关键酶基因的克隆,如异戊烯焦磷酸异构酶、牻牛儿牻牛儿基焦磷酸合成酶、八氢番茄红素合成酶、八氢番茄红素脱氢酶、ζ-胡萝卜素脱氢酶、!-番茄红素环化酶、ε-番茄红素环化酶,并对这些关键酶基因的功能进行鉴定。以水稻、油菜、马铃薯和番茄为例,阐明了类胡萝卜素合成关键酶基因在植物基因工程中的应用。将黄水仙的Psy和Lcy-b以及噬夏孢欧文氏菌(Eriwiniauredovora)CrtI基因同时转入水稻,水稻种子内胚乳类胡萝卜素含量得到提高。另外,在油菜、马铃薯和番茄中转入与类胡萝卜素合成相关的基因,类胡萝卜素含量也发生不同程度的提高,基因表达水平也发生变化。阐述了通过基因操作技术只能得到极少量的类胡萝卜素,只有进一步弄清类胡萝卜素代谢途径,提高外源基因在植物中的特异表达,才能合成大量类胡萝卜素,使类胡萝卜素遗传操作技术成功运用于作物品质改良。     

大果水晶梨褐色果皮突变体木质素合成相关基因的组织特异性表达分析

为研究木质素合成相关基因(PAL1、PAL2、CAD、POD、4CL)在大果水晶梨褐色果皮突变体中的表达特性,并为研究梨褐色果皮形成机制奠定基础。按照RNA试剂盒法提取果皮、花、叶片、果肉、枝条韧皮部中总RNA;利用DNAMAN和Primer 5.0软件设计特异引物;使用实时荧光定量PCR技术研究基因的表达。结果表明,PAL1、PAL2、CAD、POD、4CL的最高相对表达量均出现在果皮中;果皮和果肉中POD的相对表达量极显著高于其他基因,花、叶片和枝条韧皮部中CAD的相对表达量极显著高于其他基因。综上所述,大果水晶梨褐色果皮突变体木质素合成相关的5个酶基因在果皮、果肉、叶片、花和枝条韧皮部中的表达具有明显的组织特异性,这些基因可能与大果水晶梨褐色果皮的形成关系密切。     

油菜素内酯合成和信号转导基因在马铃薯块茎贮藏期间的表达变化及对萌芽的影响

为探明油菜素内酯BR在块茎萌芽中的作用,建立更有效的种薯催芽调控体系,选择了休眠期不同的3个品种,利用q RT-PCR分析与BR合成、信号转导、调控有关的9个基因在贮藏期间及抑芽处理下的表达模式;同时检测BR类似物24-表油菜素内酯(24-e BL)及其与赤霉素GA3对块茎萌芽的影响。结果表明,涉及BR合成的4个基因表达量均随贮藏时间延长升高,短休眠品种升高的时间点早于中、长休眠品种;信号转导及调控基因中BRI1和CYCD3的变化与合成基因相似,BSK和TCH4的表达量则在中、长休眠期品种中保持恒定。抑芽处理在贮藏前期能刺激这些基因的表达升高,但之后都迅速下降并保持低水平。转录因子BZR1在各品种中以及抑芽处理下均没有明显变化。24-e BL利于块茎解除休眠,但不促进芽的伸长生长,与GA3互配效果更佳,单株块茎增重37.92%~98.41%。结论表明,BR合成和信号转导是块茎从休眠向萌芽转变的必经生理过程,它与GA3互配用于催芽更利于种薯萌芽的整齐、健壮并促进块茎形成。