植物几丁质酶在抗真菌病害基因工程中的应用

植物几丁质酶因能水解真菌细胞壁的主要成分几丁质 ,在抗植物真菌病害反应中发挥了重要的作用。本文对植物几丁质酶的特性、分类、基因的诱导表达及其基因在抗真菌病害基因工程中的应用等进行了阐述 ,指出植物几丁质酶在抗真菌病害基因工程中的巨大应用前景     

真菌源几丁质酶在植物抗真菌病害中的应用

几丁质酶可以降解大多数真菌细胞壁,阻止或中断真菌在植物体内的侵染、定殖和扩展,在抗真菌病害的研究方面受到广泛关注。本文综述了真菌源几丁质酶的特性,对真菌的抑制作用机制,转几丁质酶基因植株的抗性评价,产几丁质酶菌株和相关制剂在生物防治方面的应用,并对其在生产上的发展前景进行了展望。     

几丁质酶在植物保护中的研究与应用进展

随着越来越多的几丁质酶基因被克隆 ,目前几丁质酶在植物保护上的应用日益受到重视 ,利用几丁质酶基因培育抗真菌基因工程植物新品种正逐渐成为植物防御真菌病害的一种有效途径。本文概括了几丁质酶的抗菌活性、诱导表达特性及其在植物抗真菌病害中的应用等方面的研究进展     

产几丁质酶菌的分离鉴定及其抑菌作用的初步研

从北京地区的土样、砂样和水样中分离并纯化了产生几丁质酶的菌株，其中CT14含几丁质酶活性最高，经对其细胞形态、菌落特征的观察和生化特性检测，证明该菌株是环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)。其几丁质酶粗提液能抑制多种植物病原真菌的生长，表明它对植物病原真菌的拮抗作用具有广谱性。     

产几丁质酶菌的分离鉴定及其抑菌作用的初步研究

从北就地区的土样、砂样和水样中分离并纯化了产生几丁质酶的菌株，其中CT14含几丁质酶活性最高，经对其细胞形态、菌落特征的观察和生化特性检测，证明该菌株是环状芽孢杆菌（Bacillus circulans）。其几丁质酶粗提液能抑制多种植物病原真菌的生长，表明它对植物病原真菌的拮抗作用具有广谱性。     

豇豆几丁质酶纯酶液对不同真菌的作用

几丁质酶(EC 3.2.1.14)广泛存在于植物中,当受到病原菌侵染或其它诱导因子诱导时,植物体内几丁质酶活性显著提高。菜豆纯几丁质酶具抗Trichoderma viridae活性,转菜豆几丁质酶基因的烟草植株增强了对Rhizoctonia solani的抗性。作者研究了经诱导、提纯的豇豆几丁质酶对不同真菌的作用,为开展抗真菌病基因工程研究奠定了基础。 1 材料与方法     

链霉菌769与百日草黑斑病病菌诱导百日草几丁质酶基因的表达差异

以百日草为试验材料,利用同源基因克隆法克隆到百日草几丁质酶基因片段和actin基因片段,分别用链霉菌769发酵液和百日草黑斑病病菌悬浮液处理百日草植株,通过半定量RT-PCR检测了不同处理的几丁质酶基因表达量的差异.结果表明,链霉菌769发酵液和百日草黑斑病病菌悬浮液均能诱导百日草几丁质酶基因的表达,其最大表达量分别在接种后24 h和6h.百日草黑斑病病菌优先诱导植株体内几丁质酶的表达,而链霉菌769的诱导滞后.当用病原菌处理36 h后喷施链霉菌769发酵液,链霉菌769对几丁质酶基因的诱导表达高峰出现在喷施后的36 h,比单独喷施的诱导表达推迟了12h,暗示了生防菌链霉菌769可以诱导植物的系统诱导抗性,且和百日草黑斑病病菌引发了不同的信号转导通路,以减轻由病原菌侵染引发的植物病害.     

通过染色体整合几丁质酶基因提高伯克氏菌生防能力

为了提高伯克氏菌Burkholderia vietnamiensis的生防能力,通过Tn5转座子介导,将其携带的来自枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis的几丁质酶基因整合到野生伯克氏菌B418染色体DNA上,获得工程菌株B418-37。对获得的转化子进行Southern杂交和几丁质酶活性检测,结果证实几丁质酶编码基因已整合到伯克氏菌B418-37染色体DNA上并能表达几丁质酶。生物学特性研究发现几丁质酶基因整合到伯克氏菌染色体中,没有影响野生菌的解磷、解钾、固氮及其在植物根际的定殖能力。平板抑菌试验和温室盆栽试验显示,与野生型相比,该工程菌株对多种病原真菌的抑菌效果增强,说明几丁质酶在植物病害的防治中具有重要作用。上述结果说明通过染色体整合几丁质酶基因是获得多功能生防工程菌的有效途径之一。     

木霉几丁质酶及其基因的研究进展

现已报道8种木霉的39个几丁质酶基因,其中22个为42kD内切酶基因.这些42kD内切酶基因的核苷酸序列及其编码的前体蛋白的氨基酸序列极为相似.42kD几丁质酶基因开放阅读框一般有3个内含子,前体蛋白一般有约22AA的信号序列,引导输出.成熟蛋白具有催化域、磷酸化域和耱基化域.基因的表达是诱导型的,受几丁质及真菌几丁质细胞壁的强诱导,受代谢物阻遏.转入植物的木霉几丁质酶基因可正确表达.本文就木霉生防菌株几丁质酶及其基因克隆、几丁质酶基因结构和功能、几丁质酶基因的表达和调控,以及木霉几亍质酶的生防应用前景等几方面进行了综述.     

具分泌几丁质酶活性的生防细菌的筛选鉴定及其几丁质酶基因的克隆和表达

 本研究通过平板透明圈法筛选获得一株具有几丁质酶活性的生防细菌CAB-1,该菌株对番茄灰霉病菌等多种病原真菌表现较强的拮抗活性。通过生理生化、16S rDNA和gyrB基因序列测定,将菌株CAB-1鉴定为萎缩芽胞杆菌（Bacillus atrophaeus）。对菌株CAB-1全基因组序列进行分析和功能预测,发现该菌株存在2个几丁质酶编码基因chit1和chit2。通过PCR技术从菌株CAB-1中克隆出这两个几丁质酶的编码基因并在大肠杆菌中表达,其原核表达产物均表现几丁质酶活性,其中chit1的原核表达产物能够显著抑制灰霉菌分生孢子的萌发。对其原核表达条件进行优化,发现在30℃下振荡培养24 h,IPTG浓度为0.2~1.0 mmol/L时,其蛋白表达量最高。     

烟草拮抗链霉菌FT05W基因组测序与几丁质酶家族基因鉴定

链霉菌FT05W是一株对烟草黑胫病等土传真菌病害具有良好拮抗作用的生防放线菌。本研究利用Miseq PE300高通量测序平台对链霉菌FT05W基因组进行序列测定，共获得6914188个reads，通过SPAdes软件对序列进行拼接共得1836个contigs，其基因组全长为7699129 bp，GC比为71%，其中编码基因序列长度为6037181 bp，预测出7434个蛋白编码基因（GenBank登录号：NZ_QGMR00000000），预测编码7323个蛋白。获得的基因注释信息为今后深入开展其在烟草上的生物防治机理研究奠定了重要的基础，有助于推动烟草生防链霉菌功能基因的挖掘与利用，为烟草生防链霉菌FT05W的进一步开发与应用提供理论依据。利用MEGA 6.06构建链霉菌FT05W的几丁质酶家族基因系统发育树，共鉴定出7个几丁质酶家族基因，其中6个为18家族几丁质酶基因，1个为19家族基因。     

拟康宁木霉Hailin产几丁质酶条件优化及其抑菌能力评价

采用透明圈法测定了拟康宁木霉(Trichoderma koningiopsis) Hailin菌株是否产几丁质酶,并通过单因素和正交试验对Hailin菌株产几丁质酶的发酵条件进行优化;用对峙培养和培养基中添加几丁质的方法检测Hailin菌株及其几丁质酶粗酶液对7种植物病原真菌的拮抗能力。结果表明,Hailin菌株在胶体几丁质的诱导下可以产生明显的透明圈,即可产生几丁质酶。Hailin菌株产几丁质酶的优化条件为葡萄糖5.0 g/L、硝酸钾10.0 g/L、Mn~(2+)0.08 mol/L、Mg~(2+)0.05 mol/L、初始pH为4、装液量为50 mL/150 mL。优化条件下,Hailin菌株产几丁质酶活性可达到0.784 U/mL,较优化前几丁质酶活性相比提高了2.57倍。Hailin菌株对7种植物病原真菌均有抑菌效果,抑菌率在44.44%～85.71%之间;Hailin菌株几丁质粗酶液对7种植物病原菌中的6种具有抑菌效果,抑菌率为5.88%～71.52%。Hailin菌株分泌的几丁质酶在Hailin菌株抑制不同病原菌过程中发挥的抑菌作用存在显著差异。     

木霉几丁质酶及其对植物病原真菌的拮抗作用

 木霉(Trichoderma spp.)作为重要的植病生防因子(biocontrol agents)一直受到普遍关注。木霉菌株产生的包括几丁质酶在内的细胞壁降解酶,在木霉重寄生中起重要作用。本文论述木霉几丁质酶的种类、诱导产生、理化特性及其对植物病原真菌的拮抗作用,并对木霉几丁质酶及其基因的生防应用进行讨论。     

寄生于南方根结线虫卵的长梗木霉几丁质酶基因TlChi46的克隆

为进一步筛选高效寄生线虫真菌和阐明其寄生线虫卵的机理,本研究从湖北省烟草南方根结线虫雌虫分离到1株具高效生防潜力的菌株HBF1。形态学、rDNA-ITS和翻译延长因子tef1-α序列分析鉴定该菌为长梗木霉菌Trichoderma longibrachiatum,其对南方根结线虫卵第10 d寄生率为80.45%。通过简并引物设计和RACE技术克隆其几丁质酶基因,分析该基因序列及与其他几丁质酶的同源性。该菌是1株可以产生几丁质酶的南方根结线虫卵寄生真菌,第10 d几丁质酶的活性达到高峰,为24.88μmol/h/mL。本研究首次从长梗木霉HBF1菌株中克隆到1个几丁质酶基因TlChi46,该基因DNA全长1 793 bp,含3个内含子和1个1 272 bp的开放阅读框,编码423个氨基酸,理论分子量45.9 kDa,等电点5.23。同源性比对表明和昆虫寄生菌几丁质酶的亲缘关系较远。从长梗木霉HBF1中克隆得到的几丁质酶基因编码的几丁质酶的功能域可供进一步研究,高效产几丁质酶并有效寄生南方根结线虫卵的长梗木霉对南方根结线虫具有良好的生防潜力。     

粉红螺旋聚孢霉高效生防菌株的筛选与评价

粉红螺旋聚孢霉Clonostachys rosea是一种重要的植物病原生防真菌。本研究测定了不同地理来源的42株粉红螺旋聚孢霉菌株对核盘菌Sclerotinia sclerotiorum菌核的寄生能力,以及菌株几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶的活性,同时测定了不同菌株对番茄灰霉病菌Botrytis cinerea的拮抗作用以及对番茄果实灰霉病的防治效果。结果表明,不同来源的粉红螺旋聚孢霉菌株对核盘菌菌核均有一定的寄生能力,45.2%的菌株寄生能力达到4级,β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶活性与其寄生能力呈极显著正相关。研究发现,粉红螺旋聚孢霉菌株对番茄灰霉病菌有一定的拮抗作用,抑制率最高可达78.4%;HN-56、STG-21-1、GS6-1等菌株对离体番茄果实灰霉病的防效达到75%以上,显示出良好的生防潜力。本研究为丰富植物真菌病害生防资源和高效粉红螺旋聚孢霉生防制剂的研发奠定了基础。     

植物抗病基因工程研究进展（Ⅰ）──植物抗病毒基因工程

植物病原真菌、细菌、病毒常年危害农作物，给农业生产带来巨大损失，而防治病害的最有效措施是抗病育种。生物技术的发展给抗病育种开辟了新途径。本文分三大部分综述了国内外抗病毒病害、抗细菌病害、抗真菌病害基因工程的研究进展，包括转病毒基因成分（ＣＰ基因、复制酶基因、反义ＲＮＡ、ｓａｔＲＮＡ），转植物抗生物质编码基因和转核酶基因的抗病毒病植株；转溶菌酶基因、转抗菌肽基因、转解除细菌毒素基因的抗细菌病害植株；转芪合成酶基因、转植保素和木质素的关键合成酶基因、转几丁质酶基因、转葡聚糖基因、转ＲＩＰ基因的抗真菌病害植株等研究所取得的成果。     

几丁质酶基因在球孢白僵菌中的超表达提高其对马尾松毛虫的毒力

几丁质酶在虫生真菌穿透寄主体壁的过程中起一定作用,但其与真菌毒力的关系尚不清楚。本研究通过几丁质酶基因在球孢白僵菌Beauveria bassiana中的超表达以及超表达菌株的毒力变化研究了该基因与毒力的关系。将几丁质酶基因Bbchit1通过芽生孢子转入野生型球孢白僵菌中,获得多拷贝的转化子;转化菌株在胶体几丁质诱导培养基中酶活最大值高于出发株4.2倍,表明该几丁质酶基因在转化菌株中得到超表达。毒力测定发现转化子对马尾松毛虫Dendrolimus punctatus的致死中浓度比出发株降低84.5%,在2.5×107孢子/ml浓度下的致死中量减少84.5%,致死中时缩短0.7d,因此毒力大大提高。第2~9d感病死虫数与转化子第1~8d酶活呈极显著正相关（P〈0.01）,而与出发株不相关（P〉0.05）。这些证据表明,几丁质酶与毒力的关系是复杂的,在分泌达到一定阈值后与毒力才有明显的相关关系。     

植物病原真菌对甾醇生物合成抑制剂类(SBIs)杀菌剂的抗药性研究进展

甾醇生物合成抑制剂类(SBIs)杀菌剂通过抑制植物病原真菌甾醇生物合成途径中不同环节的酶,干扰或阻断病原菌麦角甾醇生物合成而发挥抗真菌作用。综述了植物病原真菌对SBIs杀菌剂的抗药性发生现状、遗传机制、生理生化机制、分子机制及治理策略等方面的最新研究进展。室内及田间有关SBIs杀菌剂抗药性的研究结果表明,植物病原菌对该类杀菌剂的抗药性可能是由1种或多种机制共同作用的结果。ABC和MFS运输蛋白基因及CYP51蛋白基因是植物病原真菌对SBIs杀菌剂产生抗药性的主要分子机制。其中ABC运输蛋白基因能够通过翻转酶将药剂从膜内层转移至外层而排出细胞体外;MFS运输蛋白基因的超表达和本底表达则是导致病原菌产生抗药性的关键因素;而CYP51蛋白基因与药剂作用时易在病原菌体内发生基因点突变或基因超表达,造成编码蛋白与药剂亲和力下降,导致病原菌产生抗药性。随着分子生物学的迅速发展,可从基因水平上寻找出与抗药性直接相关的基因、蛋白及调控途径等信息,同时与其他学科结合,合理设计新的、多作用位点的高效甾醇生物合成抑制剂,从而延长该类杀菌剂的使用寿命。     

球孢白僵菌SJ-05几丁质酶基因的克隆与序列分析

几丁质酶在昆虫真菌侵染寄主过程中起着重要的作用。本文对采自内蒙古准格尔旗沙棘木蠹蛾的球孢白僵菌菌株SJ-05进行了几丁质酶的基因分析,从中克隆了几丁质酶Bbchit基因,得到了重组质粒pMD19-T/chit。测序结果表明,Bbchit基因核苷酸序列阅读框架全长为1047 bp,编码348个氨基酸,推测分子量为36.924 ku,等电点为5.94。氨基酸序列比对结果表明,与球孢白僵菌Bb0062菌株（AAN41259.1）的氨基酸序列相似性最高,为99.71%。     

拮抗农业致病菌放线菌的分离、筛选与鉴定

采用梯度稀释法从土壤中分离出放线菌G5。该菌株对苹果轮纹病菌、油菜菌核病菌等多种农业致病真菌有很强的抑制作用。用16SrDNA序列分析法对G5进行序列分析,该菌株16SrDNA序列与链霉菌属的13个放线菌的同源性为99％。用传统细菌学的方法对G5菌株进行鉴定,其形态特征和生理生化特性与链霉菌的特征和特性相一致,表明该菌株属于链霉菌。