高简并引物小温度范围不规则降落PCR在庞大基因家族扩增中的应用

[目的]探讨高简并性引物扩增庞大基因家族基因的特殊方法。[方法]采用高简并引物对鲤鱼基因组DNA分别进行了常规PCR扩增、常规降落PCR扩增以及优化后的小温度范围不规则跳跃降落PCR扩增。[结果]采用常规PCR仅得1条明显条带,得到的基因较少;采用常规降落PCR仅得到弥散性扩增,无明显条带出现;而采用小温度范围不规则跳跃降落PCR则得到了3条明显条带和多个基因,扩增结果理想。[结论]为庞大基因家族扩增条件的优化与选择提供了理论依据。     

简并寡核苷酸引物PCR扩增单细胞基因组的影响因素研究

[目的]研究影响简并寡核苷酸引物聚合酶链反应(degenerate oligonucleotide primed PCR,DOP-PCR)扩增单细胞全基因组的因素。[方法]以单个人外周血淋巴细胞为材料,进行DOP-PCR,研究新鲜细胞与冷藏细胞及采用新鲜和冻存的细胞裂解物为模板对扩增产物的均匀性及特异性的影响。[结果]以新鲜的淋巴细胞为模板与以冷藏的淋巴细胞为模板相比,扩增产物的均匀性相当,特异性上新鲜细胞较好。细胞裂解后立即进行扩增的效果在产物的均匀性及特异性方面均明显优于冻存的细胞裂解物。[结论]对单细胞应用DOP-PCR方法进行全基因组扩增时,应尽量选取新鲜细胞进行裂解,裂解后避免冻存以保证扩增的均匀性及特异性。     

四引物扩增受阻突变体系PCR及其在水稻遗传育种研究中的应用

介绍了四引物扩增受阻突变体系PCR技术,阐述了该SNP基因分型技术的引物设计和反应体系优化方法,综述了该技术在水稻遗传育种研究中的应用,旨在推广这一简单、高效SNP基因分型技术。     

新疆肠道传播的非甲非乙型肝炎（戊型）病毒（ET—HEV）核酸特异片段的PCR扩增

本研究建立了自患者粪便中直接进行ＥＴ－ＨＥＶ核酸特异片段扩增的方法．即便经反转录反应后的ＰＣＲ放大法。ＰＣＲ流程为：变性：９４℃９０ｓ，退火：４０℃９０ｓ，延伸；７３℃１２０ｓ，共２５个循环。所用引物为ＥＴ－ＨＥＶ特异．从而决定了ＰＣＲ产物的特异性．该产物已用于制备ＥＴ－ＨＥＶＲＮＡ持异的诊断探针．     

高效TAIL—PCR的改良及在洋葱中的应用

高效TAIL—PCR是一种完全依赖PCR的方法,它利用5’端带尾巴的高简并倍数的LAD引物在未知序列上创造结合位点;LAID引物是LAD系列简并引物5’端的部分序列,利用其可以保证PCR扩增中结合未知序列端的引物浓度;利用巢式PCR可提高扩增产物特异性。本研究将该技术应用于洋葱的未知侧翼序列分离,建立了洋葱的高效TAIL—PCR技术体系。     

基于DPO引物的多重PCR在检测单增李斯特菌中的应用

根据单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)的hly、prfA和iap基因设计了3对常规引物和DPO(Dual priming oligonucleotide)引物,采用多重PCR的方法,建立了单增李斯特菌的快速检测体系,并比较了常规引物和DPO引物的优劣,结果表明DPO引物的特异性强,能够快速准确地检测单增李斯特菌。     

扩增内标在副溶血弧菌多重PCR检测方法中的应用

建立扩增内标存在下同时检测副溶血弧菌tlh基因和trh基因的多重PCR方法。以细菌16SrDNA片段为扩增内标对照(internal amplification control,IAC),副溶血弧菌不耐热溶血毒素(thermolabile hemolysin,TLH)基因tlh和相对耐热直接溶血毒素(thermostable related hemolysin,TRH)基因trh为检测基因,设计引物,并优化多重PCR体系。特异性及灵敏度试验结果表明:该多重PCR体系检测致病性副溶血弧菌表现出极好的特异性。纯培养条件下,扩增内标存在时tlh基因和致病基因trh的检测灵敏度分别为1.3×102 cfu.mL-1和1.3×103 cfu.mL-1;人工污染牡蛎样品,不经富集培养,扩增内标存在时tlh基因和致病基因trh的检测灵敏度分别为2.6×103 cfu.mL-1和2.6×104 cfu.mL-1;经过6h的富集培养,tlh基因和trh基因的检测限均能达到2.6×102 cfu.mL-1。该检测体系特异性强、灵敏度高,并且扩增内标的存在可排除PCR检测致病性副溶血弧菌可能导致的假阴性结果,可提高检测的速度和精准度。     

巢式PCR（Nested—PCR）在植原体检测中的应用

通过直接PCR(Direct-PCR)和巢式PCR(Nested-PCR)技术,利用植原体16S rDNA通用引物对泡桐丛枝和小麦蓝矮两种植原体病害不同发病时期进行了检测研究,结果表明:夏季采集的泡桐丛枝的叶片和枝干、及接种2周显症小麦均可扩增出1.4kb和L 2kb的特异条带,而冬季采集的泡桐丛枝中未扩增出特异条带;接种1周的小麦通过直接PCR扩增未见特异条带,但对其进行巢式PCR扩增便可获得1.2kb的特异条带.说明巢式PCR在植原体病害的检测中是一种灵敏、准确、快速的方法.     

八倍体小偃麦（中1－中7）的高分子量麦谷蛋白亚基及其在品质育种中的应用

异源八倍体小偃麦中１－中７在国内外被广泛用做三锈、黄矮病的抗原材料．但其品质上的优异特性一直没有被搞清并加以利用．利用ＳＤＳ—ＰＡＧＥ分析了中１－中７的ＨＭＷ麦谷蛋白亚基组成和它们的染色体组构成，并探讨了中１－中７在优质麦育种过程中的应用和后代的选择方法．     

利用梯度PCR和降落PCR扩增CIRP基因的比较

提取SD大鼠总RNA,同时应用降落PCR和梯度PCR在常规PCR反应体系和低模板浓度PCR反应体系中扩增CIRP基因片段,对两种方法的扩增效果进行比较。结果表明：降落PCR法可以通过一次反应即顺利扩增出CIRP基因特异性条带,并且在模板浓度降低后也能扩增出产物;梯度PCR法扩增结果不稳定,不但有非特异性条带出现而且不能...     

二甲基亚砜对高GC含量小单孢菌基因组DNAPCR扩增的影响

研究了不同浓度二甲基亚砜对小单孢菌基因组DNA PCR扩增的影响,结果表明,在以小单孢菌基因组DNA为模板的PCR扩增体系中,加入终浓度为2.5%或4.0%的二甲基亚砜(DMSO)有利于PCR扩增.     

利用降落PCR扩增KS基因

通过优化SDS法提取链霉菌(Streptomyces spiramyceticus)和2株由生物技术与资源利用国家民委——教育部重点实验室分离获得的放线菌D8和D18基因组DNA,同时应用降落PCR和普通PCR扩增酮基合酶基因(ketosynthase,KS)。结果表明,扩增出的特异性条带与目的基因片段长度一致,降落PCR法较普通PCR法扩增KS基因特异性更高。使用普通Taq酶,降落PCR程序能明显提高PCR的特异性,它可用于扩增普通PCR难以扩增的基因片段,或在假阳性难以去除的情况下提高PCR的特异性。     

牛CD18编码全基因特异引物设计与PCR扩增

为了获得牛整合素CDl8亚单位编码全基因序列以进行牛白细胞粘附缺陷病(BLAD)相关研究,采用DNAstar引物设计软件对网上牛CDl8mRNA编码全基因序列及其限制性内切酶酶切位点进行分析,设计一对PCR扩增引物,经PCR扩增条件优化后,获得含有CD18编码全基因序列的2350bpPCR产物。     

小麦淀粉合成酶基因实时荧光定量PCR检测方法的建立及其应用

利用荧光定量PCR技术,对小麦淀粉合成酶基因(AGPase1、GBSSI、SSSIII、SBEI)进行了定量检测,分别建立了这4种淀粉合成酶基因和内参基因18s的Ct值与模板量之间的标准曲线和线性回归方程。运用所建立的方法对小麦籽粒4种淀粉合成酶基因在灌浆期间的表达变化情况进行了定量分析。     

鲜切马铃薯实时荧光定量PCR分析中内参基因的选择

[目的]选择鲜切马铃薯实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析中合适的内参基因。[方法]以受到高温、光照等胁迫的鲜切马铃薯为材料,应用qRT-PCR技术,分析18S rRNA、GAPDH、Actin和EF1a 4个常用内参基因的表达情况。[结果]经GeNorm软件分析发现,当利用qRT-PCR分析比较鲜切马铃薯中的基因表达差异时,可选择Actin作为校正内参基因。[结论]该研究为进一步开展鲜切马铃薯分子生物学研究奠定了方法学基础。     

高G +C含量模板进行PCR扩增的高效缓冲液体系的建立

高G C含量模板进行PCR扩增时,往往通过添加增强剂如甘油、DMSO、甲酰胺等来提高扩增效率,但是目前研究单个增强剂对PCR影响的较多,而研究增强剂组合的不多,而且关于增强剂对聚合酶保真度的影响的研究也不够充分。本研究通过正交试验对不同增强剂组合的效应进行了探讨,建立了3个对高G C含量模板进行PCR扩增的高效缓冲液体系,并且对其中2个进行研究发现它们可以提高Taq聚合酶扩增的保真度,因而具有较广的应用前景。     

伞滑刃线虫属 4个种rDNA的PCR扩增

 从161份病松树样本中分离、鉴定出拟松材线虫（Bursaphelenchus mucronatus）、霍夫曼伞滑刃线虫（B.hofmanni）和赫列尼库斯伞滑刃线虫（B.hellenicus）3个种,其中后二者是中国新记录种,华山松和云南松分别是这两个种的世界新寄主记录。本试验以松材线虫(B.xylophilus)为对照,用伞滑刃属线虫rDNA相关引物对这4种伞滑刃线虫进行PCR扩增,进一步印证形态鉴定的可靠性。试验结果表明,霍夫曼伞滑刃线虫、赫列尼库斯伞滑刃线虫与松材线虫、拟松材线虫,均扩增到约800 bp的分子片段,为霍夫曼伞滑刃线虫和赫列尼库斯伞滑刃线虫的鉴定从分子生物学角度提供了一定依据。