延缓叶片衰老ZmIPT2基因的玉米遗传转化及功能验证

从玉米自交系郑58中克隆Zm IPT2基因并构建单子叶植物表达载体,通过农杆菌侵染萌动胚方法将其转入玉米自交系K10中,对转基因后代进行分子检测和功能验证。结果表明,Zm IPT2基因c DNA全长969 bp,成功构建其单子叶植物表达载体p CAMBIA5300-ubi-Zm IPT2。农杆菌侵染萌动胚法共转化K10种子5 163粒,获得T0代PCR阳性幼苗48株,其中13株结实收获种子;获得的3个T2代株系PCR阳性率符合3∶1的分离比,且RT-PCR检测呈阳性;2个T2代转基因株系的成熟期叶绿素含量和细胞分裂素含量极显著高于对照,相对绿叶面积和叶面积持绿期极显著或显著高于对照,百粒重和小区产量显著高于对照。结果初步证明,Zm IPT2基因在玉米中的过表达可延缓叶片衰老,提高玉米产量。     

农杆菌介导法将高赖氨酸蛋白基因sb401导入玉米的研究

以玉米杂交组合PA×PB的胚性愈伤组织为材料,通过农杆菌介导法将高赖氨酸蛋白基因sb401导入到玉米中。经过双丙胺膦筛选,共获得70株再生植株,其中15株经PCR检测呈阳性,将部分PCR呈阳性的植株进行Southern杂交,结果表明,sb401基因已经整合到玉米基因组中。bar蛋白试纸条检测结果呈阳性,推测目的蛋白得到了表达。     

Allelic Analysis for bar Gene from Different Rice Transformation Events

Abstract

Mechanism(s) of gene transformation and integration in rice (Oryza sauva L.) is/are not currently well understood. This research was conducted to determine whether a transgene is inserted into the rice genome specifically or randomly. Seven homozygous transgenic Taipei (T) 309 and Nipponbare plants with the bar transgene from different rice transformation events were crossed. The segregation of F2 and F3 populations from a total of 21 crosses was studied in a greenhouse and field to determine if the genes were allelic or non-allelic. Five genomic locations appeared to be involved among the seven transgenic plants. An additional 20 homozygous transgenic T309 plants, with the bar transgene from different transformation events, were crossed reciprocally with the previous seven plants. One hundred and fifteen crosses made during 1999 and 2000 were analyzed for allelism. In some combinations, the genes were allelic, but most of them were non-allelic, with two or more pairs of genes being expressed. Twenty loci among the 27 transgenic plants were involved and some plants had several inserted genes expressed. Genes in nine out of 27 transformed plants were allelic. We concluded that the functional foreign (bar) gene was restrictively/preferentially inserted into the rice genome in some cases and was not completely randomly inserted and expressed in the rice genome. If the mechanism(s) for preferential insertion were identified, rice researchers could possibly control insertion sites of transgenes to optimize gene expression.     

转酸性蛋白酶pepB基因玉米的分子鉴定与农艺性状分析

通过分子生物学技术把酸性蛋白酶pepB基因转入受体玉米自交系基因组中,培育转酸性蛋白酶pepB基因玉米新品系。以耐盐基因badh作为筛选标记性基因,经过抗性筛选,对T1、T2、T3代转基因植株进行PCR检测,得到14个T1代转基因阳性植株,32个T2代转基因阳性植株和27个T3代转基因阳性植株。Southern杂交结果表明,外源酸性蛋白酶基因已经整合进玉米基因组中。RT-PCR结果表明,酸性蛋白酶基因在受体玉米中获得表达,获得外源酸性蛋白酶pepB基因遗传表达的T3代转基因玉米株系。通过对T2、T3代转基因玉米各品系农艺性状的分析结果表明,转基因玉米各品系在株高、茎粗、穗长等农艺性状上与受体亲本没有差异,但生育期均有不同程度的缩短。     

花粉管通道法将Bt-CPTI双价抗虫基因转入玉米自交系的研究

利用花粉管通道法将Bt-CPTI双价抗虫基因对优良玉米自交系进行遗传转化。采用组培和盆栽两种方法对大量t0代转基因种子进行卡那霉素抗性筛选,获得的卡那抗性植株进行PCR及PCR-Southern检测,初步证明外源目的基因已整合到玉米基因组中,PCR-Southern阳性率达到2.19%。     

转bar基因水稻除草剂抗性遗传研究及其应用

试验用３个恢复系－测６４,明恢６３和特青作母本分别与３个抗除草剂转ｂａｒ基因水稻品种－Ｂｅｎｇａｌ－Ｈｕ１０,Ｃｙｐｒｅｓｓ ＰＢ－６和Ｇｕｌｆｍｏｎｔ杂交,对其后代（Ｆ１,Ｆ２和ＢＣ１）进行遗传分析表明,除草剂的抗性是受一对显性核基因控制,通过杂交可将这种基因转育到恢复系,配出抗除草剂杂交组合,应用这项技术可放宽对不育系完全雄性不育的严格要求,有利于优良不育系的培育及高产、优质,多抗新组合的选配     

农杆菌介导法将抗草甘膦基因转入玉米自交系

利用农杆菌介导法将抗草甘膦基因(ssu-G₂-aroA)转入优良玉米自交系R18-599和齐319,侵染后的愈伤组织转至潮霉素浓度为10 mg/L的筛选培养基上,继代筛选3轮,每轮3周;得到的抗性愈伤组织在含有潮霉素浓度为3 mg/L的分化培养基上进行分化,R18-599获得30株再生植株,齐319获得18株再生植株。经PCR鉴定后共得到7株转化抗性植株(4株R18-599、3株齐319)。经PCR-Southern及RT-PCR检测结果表明,ssu-G₂-aroA基因已稳定整合到了玉米基因组中,并在RNA水平上得到表达。     

应用直接PCR技术快速筛查转基因玉米方法研究

以转CP4-epsps基因玉米为研究对象,用玉米内标准基因z SSIIb及3种常见转基因成分(Ca MV35S启动子、NOS终止子、CP4-epsps基因)为检测靶标,建立基于直接PCR技术的玉米转基因成分筛查方法。此方法不用提取纯化DNA,只需取直径约为0.5 mm的叶片加到PCR反应体系中进行扩增,与常规PCR方法相比,在保证结果准确性的同时,大大缩短检测时间,提高工作效率。此方法具有操作简便、结果可靠等优点,适用于玉米叶片中转基因成分的快速筛查。     

玉米花粉管通道法转化脱水素BDN1基因

通过花粉管通道法将脱水素基因BDN1转入玉米自交系合344中,并对转化后代进行PCR和RT-PCR分子检测以及耐盐性功能鉴定,筛选耐盐性较高的转基因玉米新种质.结果表明,实验共获得88株T0代除草剂抗性植株,其中31株PCR检测呈阳性,14株RT-PCR检测呈阳性,对T4代转基因株系苗期进行300 mmol/L NaCl溶液的盐胁迫处理, 2个转基因株系耐盐性比对照提高两个级别.     

利用RNAi方法构建MS26基因雄性不育植物表达载体及农杆菌介导玉米遗传转化研究

应用RNAi技术创制了花粉彻底败育的玉米雄性不育株系,为玉米杂交制种提供雄性不育的基础材料。构建玉米MS26 RNAi植物表达载体,其中,以玉米综31未成熟的幼胚组织为受体,利用农杆菌介导法将目的基因定向转入到玉米中,以甘露糖为选择剂进行筛选获得能够稳定遗传的转基因植株。通过Taqman探针法进行分子检测,获得18株单拷贝T0代转基因植株,碘-碘化钾染色分析结果显示,12株完全不育。在田间试验中,5个转化事件的所有T1代转基因植株在散粉期都表现雄性不育,且除此之外与野生型玉米对照植株之间没有其他形态不同。实时定量PCR结果显示,MS26 RNAi转基因玉米植株中MS26基因的表达量显著下调,由此可推断,MS26 RNAiT-DNA已经整合到玉米基因组中,并能引起完全的雄性不育。     

转异苞滨藜BADH基因玉米高世代株系苗期外源基因表达及耐盐性功能分析

以转来自耐盐植物异苞滨藜的甜菜碱醛脱氢酶基因(BADH)玉米T8代株系BZ-136及受体对照自交系郑58(耐盐)为试材,采用盆栽种植方法,分析转基因植株中外源基因的表达情况,检测耐盐相关生理指标。结果表明,转基因株系BZ-136中的BADH酶活性及甜菜碱含量显著高于受体对照,随着盐胁迫时间的延长,其表达量先增加后减少,在胁迫7 d时分别达到了最大值。转基因株系幼苗株高和干重从盐胁迫第3天开始显著高于对照,鲜重和含水量在胁迫第5天和第7天时转基因株系显著高于对照;转基因株系根总体积显著高于对照,直径和根尖数在胁迫第5天时显著高于对照;转基因株系电导率和丙二醛含量均低于对照,分别在胁迫第3天和第7天开始达显著差异,叶绿素含量高于受体对照,从第3天开始二者差异达显著水平。由于外源BADH基因的表达显著提高了基因株系的耐盐性。     

转抗除草剂基因小麦植株的筛选方法研究

为了降低小麦转bar基因时产生较高比例的假阳性植株,采用测定T0代转基因植株叶片释放NH4 浓度和对T1代植株喷施Basta除草剂等辅助筛选方法,建立了简便有效的转bar基因小麦筛选体系。研究结果表明,2叶期和5叶期叶片释放的NH4 浓度与bar基因PCR检测结果呈极显著相关,相关系数分别为0.86和0.75。对391株T0代再生植株进行叶片释放NH4 浓度测定,筛选到34株转基因植株,其中27株为bar基因的PCR检测所证实。用100 mg/L Basta除草剂对381株T0代植株的后代(3 800余株)进行喷施筛选,根据后代抗性分离筛选到13株T0代阳性植株,与PCR检测结果吻合度达到100%。这两种方法可用于以bar基因为选择标记基因的转基因植株的筛选。     

过量表达拟南芥GPX3基因提高玉米苗期抗旱性研究

通过农杆菌介导法将拟南芥抗旱基因AtGPX3导入玉米自交系郑58中,用PCR和RT-PCR法对转化玉米进行检测,在水分胁迫下对T₁代转基因玉米和非转基因玉米进行抗旱性分析。结果表明,共得到56株转化苗,检测获得9个株系的30株T₀代转基因阳性植株,抗性植株阳性率为53.6%。RT-PCR检测表明,T₁代有6个株系为稳定遗传阳性株系,并且AtGPX3基因在转基因玉米中表达量大幅度提高。耐旱性分析表明,非胁迫条件下,非转基因和转基因株系中游离脯氨酸（Pro）和丙二醛（MDA）的含量基本无显著差异。在干旱胁迫条件下,转基因玉米叶片的Pro含量高于非转基因玉米,比非转基因株系提高了46.2%;MDA含量低于非转基因玉米,比非转基因玉米下降了34%。通过导入AtGPX3基因,可以提高玉米苗期的耐旱性。     

TaCYP78A5基因过表达小麦的遗传和功能初步分析

为了验证小麦籽粒大小相关基因TaCYP78A5在小麦籽粒发育中的功能,对pINO启动子驱动的TaCYP78A5基因过表达的转基因小麦后代株系进行了鉴定,检测了T_0代植株目标基因拷贝数,定量分析了7个T_1代阳性植株的目标基因表达,并对其籽粒大小进行了统计。结果表明,利用Bar试纸条和目标基因特异PCR检测相结合的方法对21株转基因T_0代再生苗进行检测,共鉴定出14个阳性植株,除2个植株的目标基因拷贝数为3和1个植株为7外,其余11个T_0代转基因植株目标基因插入拷贝数均为1~2个,其中有6个单拷贝植株。与野生型相比,7个T_1代阳性植株目标基因表达量均极显著增加,粒厚和粒宽均有不同程度增加,粒重极显著增加。     

玉米茎节再生体系建立及AGPL基因遗传转化的研究

以玉米优良自交系郑58的子粒为材料,切取无菌苗的第1个茎节,上下各保留0.5 cm,接种于诱导培养基(1/2MS+0.3 mg/L NAA)培养,直接获得再生苗。腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)是玉米淀粉合成过程中的一个限速酶,AGPase酶大亚基(AGPL)是酶的调节中心,在玉米胞质中过表达能够提高玉米淀粉含量。利用农杆菌介导法将玉米AGPL基因导入郑58的茎节体系,转化后的茎节在含有3mg/L双丙氨膦的1/2 MS培养基上进行筛选培养,对筛选后的抗性苗进行PCR和PCR-Southern blot检测,获得了4株转基因植株。     

寒地冬小麦TaEXPB12同源基因在拟南芥中的遗传转化及功能分析

扩展蛋白（Expansin）是一类具有非水解活性的细胞壁松弛蛋白,参与调控植物的生长发育和胁迫抗性。为探究寒地冬小麦扩展蛋白基因TaEXPB12-A/B/D的功能,本研究将克隆自高抗寒冬小麦品种东农冬麦2号的TaEXPB12-A/B/D三个基因转化到拟南芥中,利用抗性筛选、PCR和Western-blot鉴定,分别获得了过表达TaEXPB12-A/B/D三个基因的转基因拟南芥植株。进一步对转基因拟南芥的生长情况进行观察,并测定低温胁迫下转基因拟南芥的存活率、体内抗氧化酶活性以及丙二醛（MDA）、脯氨酸（Pro）、可溶性糖的含量。结果显示,过表达TaEXPB12-A/B/D三个基因可促进拟南芥根的伸长以及根毛和侧根的生长,且转基因拟南芥的叶宽、叶片数目、株高均显著高于野生型;低温处理后转基因拟南芥体内超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）的活性以及可溶性糖、Pro的含量均维持在较高水平,且MDA的含量较低。以上结果表明,TaEXPB12-A/B/D三个基因的过表达显著促进了转基因拟南芥的生长,并提高了转基因植株在低温胁迫下的存活率。     

利用农杆菌介导合子胚转化法将Bar基因转入玉米自交系的研究

基于农杆菌介导的合子胚转化方法是一种具有自主知识产权的转基因新方法。利用该方法转化玉米合子胚,可直接获得转化种子。以东北春玉米区玉米自交系8902、Pa91、丹340作为转化受体,通过合子转化法进行抗草丁膦除草剂基因Bar的转基因研究。在获得的3 560份材料中,通过对T_1代种子苗叶面喷施草丁膦除草剂Basta,共获得153株抗性植株,抗性频率为4.3%。PCR鉴定阳性植株为102株,转化频率为2.87%。对PCR检测出的阳性植株进行自交获得T_2代,对材料继续进行抗性筛选,对抗除草剂表型的分离比率进行抗性遗传分析。     

应用多重荧光PCR快速筛查作物中转基因成分研究

通过对我国批准进口的和获得农业转基因生物安全证书的转基因玉米转化体的序列分析发现,除DAS40278-9和BLVA430101外,CaMV35s启动子、NOS终止子、CrylAb/Ac基因和pat基因覆盖了 21种玉米转基因转化体.通过引物组合筛选、反应体系优化、灵敏度测试、适用性测试等实验,建立了基于4个通用筛选元件...     

TaNAC14转基因小麦外源目标基因拷贝数及遗传稳定性分析

外源基因拷贝数是影响转基因植物遗传稳定性及其自身表达水平的重要因素。为了探析TaNAC14基因在小麦生长发育中的生物学功能,本研究通过农杆菌介导的遗传转化法获得了14个T0代TaNAC14转基因小麦植株,采用BASTA溶液涂抹和目标序列PCR检测相结合的方法,从14个转基因小麦植株中鉴定出9个阳性植株。通过TaqMan实时定量PCR方法,以小麦内源单拷贝基因Pinb为内参基因,对9个T0代转基因小麦阳性植株中外源目标基因拷贝数进行检测,结果表明,T0代转基因小麦再生植株中有5株为单拷贝,4株为双拷贝,其中单拷贝插入整合的比率接近55.6%。选取单拷贝转基因植株收获的种子进行种植,根据BASTA溶液涂抹鉴定对T0:1代小麦株系遗传情况进行分析,结果表明目标基因TaNAC14是可遗传的。此外,还对T1代转基因小麦目标基因表达水平进行测定,结果表明,与野生型JW1相比,各转基因小麦植株目的基因TaNAC14表达量均极显著增加。该研究结果为后续TaNAC14基因的功能研究奠定了基础。     

Overexpression of a Maize SPS Gene Improves Yield Characters of Potato under Field Conditions

Abstract

We analyzed the yield characters of field-grown transgenic potato plants (Solanum tuberosum) carrying a maize gene for sucrose-phosphate synthase (SPS), the key enzyme in sucrose synthesis. The SPS activity in the leaves of transgenic plants (line Ag1203) was 2 times that of the control (cv. May Queen). There was no difference in the photosynthetic CO₂ uptake rates between Ag1203 and May Queen plants, and the leaf starch content of Ag1203 was lower. These observations indicate that the introduction of a foreign SPS gene improved the supply of photosynthate from source (leaves) to sink (tubers). Additionally, leaf senescence of the transgenic potato plants was delayed relative to that of May Queen. The average tuber weight and total yield of Ag1203 plants were at least 20% higher, and the tuber sucrose content, which is related to eating quality, was also higher. Increased translocation of photosynthate and longer period of photosynthetic activity in the leaves may have increased the yield of Ag1203. These results suggest that introduction of the SPS gene improved the yield characters and quality of potato tubers under field conditions.