猪繁殖与呼吸综合征病毒SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank中已登录的美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)在Nsp7基因中的保守区域设计合成了1对特异性引物,通过反应条件的优化,建立了检测美洲型PRRSV的SYBR Green Ⅰ实时定量PCR检测方法,同时与商品化荧光定量PCR试剂盒进行比对分析。结果表明,该方法特异性强,灵敏度高,能很好的区分美洲型猪繁殖与呼吸道综合征病毒和其他病毒。使用该方法对14份临床样品进行检测,阳性率85.7%,与商品化试剂盒符合率100%。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒4型双重SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立

分别靶向PRRSV ORF7基因和PCV4 ORF2基因的高度保守区,设计了2对特异性引物,建立了同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪圆环病毒4型(PCV4)的SYBR GreenⅠ-based双重实时荧光定量PCR方法。PRRSV和PCV4在同一样品中的区别在于它们独特的熔解温度(Tm),PRRSV为84.5℃,PCV4为79.0℃,而对其他非靶向的猪常见病毒没有显示特定的熔解峰,且检测极限分别为PRRSV的81.5 copies/μL和PCV4的41.1 copies/μL。采用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR和常规PCR方法对30例有呼吸和繁殖衰竭症状的猪临床样本进行检测,检测结果显示,PRRSV阳性率为20.0%(6/30),PCV4阳性率53.3%(16/30),且PRRSV阳性样品中PCV4检出率为50.0%(3/6),较常规PCR检测更灵敏。该方法可能是检测PRRSV和PCV4共感染的一种快速、灵敏和可靠的方法。     

SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测PRRSV方法的建立

根据编码PRRSV M蛋白的基因序列设计用于SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR扩增的引物,通过温度梯度法优化反应体系;以不同科属常见猪致病性RNA病毒疫苗验证该检测方法的特异性,参考国内PRRSV分子流行病学特征,选择基因型代表性的2株疫苗株验证该检测方法的稳定性;以10倍梯度稀释的质粒为标准品扩增并构建标准曲线,探究该检测方法的灵敏度,随机挑取10份保存的PRRSV阳性病料和10份阴性病料同时使用农业部推荐的PRRSV RT-PCR检疫标准方法和建立的方法进行检测,以确定2种方法检测的符合率。结果显示,使用建立的方法可以在54.4℃80min内完成对PRRSV的检测,该检测方法具有特异性和稳定性;检测灵敏度为6.8×10拷贝/μL;以Ct值为横坐标,扩增序列拷贝浓度的对数值为纵坐标,得到标准曲线,方程为y=-3.411 x+39.002,R2=0.999;对随机挑取的10份PRRSV阳性病料和10份阴性病料进行检测,结果2种方法检测结果的符合率100%。结果表明,成功建立了PRRSV SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR快速检测方法,为临床提供了一种很好的检测手段。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒实时荧光定量PCR方法的建立

根据GenBank中的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(He-PRRSV)基因组序列设计1对特异性引物,建立一种基于SYBR Green I实时PCR检测HP-PRRSV的方法.结果表明,该方法能够检测到HP-RRSV的存在,不与其它猪源病毒发生非特异性反应,标准曲线线性范围为1011拷贝/反应～102拷贝/反应.与常规PCR方法相比,两者的符合率100%.该方法具有快速、简便、敏感等优点,具有重要的实用价值.     

实时荧光定量PCR方法检测猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒

根据GenBank发表的猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的保守区域的序列分别设计了2对特异性引物。建立了一种快速检测CSFV和PRRSV的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,并用该方法检测采集的临床疑似病料。结果表明,建立的CSFV、PRRSV-SYBR GreenⅠPCR有较好的特异性,敏感性和重复性,可以用于CSFV和PRRSV的检测。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank公布的24株高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒毒株和5株PRRSV经典毒株的保守区基因序列,使用PrimerExpress 3.0软件设计并合成实时荧光定量PCR（Real-timeFluorescent Quantitative PCR,Real-time FQ-PCR）用引物和探针,建立了Real-time FQ-PCR检测方法以鉴别检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒。用建立的检测方法对已定量的10倍倍比稀释的质粒pGET-258为标准品进行检测,并与常规PCR进行比较。结果显示,该Real-time FQ-PCR方法敏感度可达1.5个拷贝,比常规PCR敏感度高100倍,且批内和批间重复性检测结果的变异系数均小于2%。用该方法与常规PCR方法及病毒分离方法对18份临床样品进行对比检测,显示该方法灵敏度高、成本低,并且能够对样品中病毒进行定量,为高致病性猪繁殖与呼吸综合征的快速鉴别诊断提供了有效的技术手段。     

实时荧光定量PCR技术检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的研究进展

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染引起的一种高度接触性传染病,尤其是对母猪,该病毒严重影响其繁殖性能。实时荧光定量PCR以其快速、可靠的诊断技术,为检测和诊断PRRSV开辟了新方法。文内对国内外实时荧光定量PCR技术在PRRSV研究中的应用作了综述。     

NADC30-like谱系猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为定量检测NADC30-like谱系猪繁殖与呼吸综合征病毒(NADC30-likePRRSV),本研究针对NADC30PRRSV株的ORF6基因保守区域设计1对特异性引物,通过优化反应条件,建立了一种灵敏度高、耗时短、操作简便且可量化的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法.建立的标准曲线结果显示:Ct值与质粒...     

变异型猪繁殖与呼吸综合征病毒TaqMan荧光定量RT-PCR方法的建立与初步应用

参照GenBank的变异型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)与普通PRRSV的Nsp2段基因序列,设计并合成1对引物和TaqMan探针。通过对反应条件优化,标准质粒构建,建立了TaqMan荧光定量RT-PCR诊断变异型PRRSV方法。结果表明,该方法具有特异性强,敏感性高等特点,能够检测出264个拷贝数的标准质粒品,0.562 3TICD50的病毒量,比RT-PCR敏感10倍。对22份病料样品进行检测,结果有8份为阳性,阳性率为36.4%。由于该方法具有定量、快速、准确、敏感等优点,适用于对猪群感染变异型猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)早、中、晚期的诊断,对有效诊断及防治高致病性PRRS的发生起到重要作用。     

基于Taq Man探针的猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光定量PCR检测方法的研究

通过条件优化,以定量的10倍系列稀释的质粒pMD-ORF7为标准品进行荧光定量PCR扩增并制作标准曲线建立了PRRSV的荧光定量RT-PCR检测方法.结果表明,该方法检测灵敏度可达1.0×100拷贝/μL;用该方法对6份不同的组织样品进行重复性检测.结果显示具有良好的重复性和重现性.对阳性组织病料的检测表明该方法与常规RT-PCR阳性符合率为100%.但检测灵敏度高出常规RT-PCR 100倍.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒TaqMan-MGB实时荧光定量RT-PCR方法的建立及应用

为了快速、准确地检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRSV),本研究根据PRRSV基因序列设计特异性引物和探针,建立了一种可同时检测PRRSV经典毒株、高致病性变异毒株以及近几年中国新出现的NADC30-like毒株的TaqMan-MGB实时荧光定量方法,并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行验证,同时用建立的实时荧光定量方法与常规PCR方法对临床收集的120份疑似PRRSV样品进行检测。结果表明,该方法特异性良好,对PRRSV的经典毒株、高致病性变异毒株及NADC30-like毒株均有良好的扩增,但对猪瘟病毒(CSFV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(RV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒2型(PCV2)的检测结果均为阴性,无交叉反应;模板浓度在101～108拷贝/μL范围内具有良好的线性关系,标准曲线结果显示其扩增的相关系数为0.9999,扩增效率为93%;敏感性高,约是常规PCR方法的100倍,最低可以检测到101拷贝/μL的模板;重复性好,批内和批间重复性试验变异系数分别为0.17%～0.90%和0.65%～2.34%;用本研究所建立的实时荧光定量检测方法对120份临床样品进行检测,PRRSV阳性检出率为59.2%(71/120),而常规PCR方法的PRRSV阳性检出率为44.2%(53/120)。该方法的建立为PRRSV的实验室诊断、流行病学调查,以及预防和控制中国PRRSV的流行提供了快速、准确的检测手段。     

羊传染性脓疱病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法的建立

根据GenBank已经发表的CEV参考毒株(登录号:AF097215)F1L基因序列,利用Primer Express 3.0软件设计合成1对特异性引物,以pMD19-T-63bp重组阳性质粒作为标准品,建立了羊传染性脓疱病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法。经过反应条件的优化,建立的羊传染性脓疱病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR的线性关系良好,标准曲线的相关系数R2=0.99,扩增效率E=1.18。该方法敏感性高且特异性强,最低检出下限为65.47拷贝/μL,与羊痘和口蹄疫病毒均不发生交叉反应,重复性好,组内和组间变异系数分别为0.17%~0.59%和0.74%~1.25%。运用该方法对2例羊传染性脓疱病例进行检测,结果均为阳性。因此,可将该方法应用于临床诊断,具有准确、高效、快捷、灵敏的特点。     

SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测猪细小病毒方法的建立及初步应用

根据GenBank登录的猪细小病毒株NADL-2(NC001718)的VP2基因序列设计1对特异性引物,经PCR扩增出431bp的目的片段。回收产物与pMD18-T vector连接后转化到基因工程菌DH5α中,提取重组质粒,经PCR及测序鉴定后,作为标准模板建立SYBR GreenⅠ荧光定量PCR标准曲线,并进行敏感性试验、特异性试验和重复性试验。结果表明,标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,R2=0.997 6,产物Tm为82.3～82.9℃,检测灵敏度为72.1拷贝/μL,特异性和重复性良好。本试验所建立的检测PPV VP2基因的SYBR GreenⅠ实时定量PCR方法,为该病毒的致病机制研究、临床早期诊断及定量分析PPV感染程度奠定了基础。     

羊口疮病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR法的建立

为建立快速、灵敏、特异的检测羊口疮病毒(ORFV)的方法,基于羊口疮病毒保守序列B2L基因合成一对用于建立SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR的特异性引物,将ORFV B2L全长基因和pMD19-T质粒载体连接,构建重组阳性质粒,以构建的重组质粒DNA作为模板,建立ORFV SYBR Green I实时荧光定量P...     

猪流行性腹泻病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立高效、灵敏的猪流行性腹泻病毒(PEDV)检测方法,本研究从GenBank数据库中获取PEDV N基因序列,扩增出PEDV N基因标准质粒,并在N基因的保守区域内设计了一对特异性荧光定量引物,成功建立了SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法。经过一系列试验表明,该检测方法线性关系良好,R²值为0.99;特异性强,敏感性高,最低可检测至2.23 copies/μL,比普通PCR灵敏约100倍;重复性好,组内变异系数为0.25%～0.43%,组间变异系数为0.67%～0.97%;对于各地区96份临床样品检测出PEDV阳性率为25%。本研究建立的实时荧光定量PCR检测方法为PEDV的临床诊断、流行病学调查以及定量研究提供了有效的检测工具。     

同时检测猪瘟病毒和北美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的复合荧光定量RT-PCR方法的建立

应用猪瘟病毒（CSFV）及北美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）特异性引物和TaqMan水解探针,建立一种同时检测CSFV和PRRSV的复合荧光定量RT—PCR方法。该方法可检测到3．2TCID50的CSFV和1．8TCID50的北美洲型PRRSV,比常规PCR方法敏感性高50倍以上。用复合荧光定量RT—PCR方法对155份现地样品进行检测,结果73份为PRRSV阳性,16份为CSFV阳性,13份为CSFV和PRRSV混合感染,与常规RT—PCR的符合率高达99．4％。该复合荧光定量RT—PCR方法敏感、特异、重复性好。     

犬瘟热病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立犬瘟热病毒(CDV)SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法,采用RTPCR扩增CDV F基因269bp片段,并克隆入pMD18-T载体中,以纯化的重组质粒为模板作荧光定量PCR扩增,建立了CDV荧光定量PCR检测方法。该方法检测灵敏度可达1.6×101拷贝/μL,与犬细小病毒(CPV)、犬腺病毒(CAV-1)、犬冠状病毒(CCV)、犬副流感病毒(CPIV)均不发生交叉反应,具有很好的特异性和重复性。结果表明:建立的CDV实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床犬瘟热(CD)的检测。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒TaqMan荧光定量RT-PCR方法的建立与应用

为快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),本研究针对PRRSV的N蛋白基因保守序列,设计特异性引物和TaqMan探针,以体外转录的RNA作为标准品,设计并优化了检测PRRSV的TaqMan荧光定量PCR方法。应用该方法检测其它主要猪病病原,结果均呈阴性;针对PRRSV阳性RNA的检测灵敏度可以达到10拷贝,比常规PCR灵敏10倍～100倍;结果表明,本实验建立的PRRSV TaqMan荧光定量PCR方法具有良好的特异性、敏感性和重复性。应用建立的方法测定攻毒猪血清中病毒的含量,免疫攻毒组和非免疫攻毒组在第7 d血清中病毒的载量差异不显著,而在第14 d差异显著,免疫攻毒组猪血清中病毒载量明显低于未免疫组。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒双重TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立

本研究根据PRRSV GL膜蛋白基因和CSFV多聚蛋白基因,分别设计2对特异性引物和1条TaqMan探针,建立了同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒的双重TaqMan荧光定量RT-PCR方法。结果表明,该方法只对猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒特异性良好,不与非洲猪瘟、猪圆环病毒Ⅱ型、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒等常发猪病存在交叉反应;PRRSV和CSFV的检出下限分别为1.41拷贝/μL和1.6拷贝/μL;组内和组间Ct值变异系数都小于1.3%。对175份临床采集的样品检测,PRRSV单一阳性样品27份,CSFV单一阳性样品16份,检测双阳性样品24份。本方法敏感高、特异强,可以用于猪场的快速检测与诊断。     

鸡传染性贫血病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立鸡传染性贫血病毒(chicken infectious anemia virus,CIAV)的实时荧光定量PCR检测方法,本试验通过CIAV基因组保守区域设计1对扩增片段大小为180bp的特异性引物,构建pGM-T-CIAV重组质粒,制备阳性标准品,建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR标准曲线,并进行敏感性试验、特异性试验和重复性试验。结果显示,CIAV的Ct阈值与标准品浓度在5.33×108至5.33×103拷贝/μL间呈良好的线性关系,相关系数R2=0.998,斜率为-3.443,产物Tm值在86℃左右。该方法与网状内皮组织增生病病毒(REV)、禽白血病病毒(ALV)J亚型、马立克氏病病毒(MDV)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)基因组均无交叉反应,敏感性为5.33拷贝/μL,比普通PCR高1 000倍,批内和批间重复试验变异系数均小于3%。结果表明,本试验建立的CIAV SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法可实现对鸡传染性贫血病的早期诊断及感染程度的定量分析的检测。