5种食源性致病菌多重PCR检测方法的建立

本研究建立一种同时特异性地检测5种常见食源性致病菌的多重PCR方法。根据目前食品中常见病原菌副溶血弧菌Vibrio parahaemolyticus、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus、单核细胞增生性李斯特菌Listeria monocytogenes、肠炎沙门氏菌Salmonella enteritidis、福氏志贺氏菌Shigella flexneri的相关毒力基因,选择具有特异性的副溶血弧菌不耐热溶血毒素基因、金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因、单核细胞增生性李斯特菌编码溶血素O基因、沙门氏菌侵袭蛋白A基因及志贺氏菌侵袭性质粒抗原H基因,设计5对特异性引物进行多重PCR检测,对反应条件进行优化并评价了其特异性和灵敏度。通过对48份实际样品检测,验证了此多重PCR体系具有很好的可靠性和实用性。     

同步检测7种鱼类病毒的扩增子拯救多重PCR(Arm-PCR)方法的建立和应用

淋巴囊肿病毒(LCDV)、肿大细胞病毒属虹彩病毒(Mega)、赤点石斑鱼神经坏死病毒(RGNNV)、传染性造血器官坏死病毒(IHNV)、传染性胰脏坏死病毒(IPNV)、病毒性出血败血症病毒(VHSV)和传染性鲑鱼贫血症病毒(ISAV)是养殖鱼类主要的病毒性病原,危害巨大。为实现这7种病原的高通量、同步检测,本研究在分析这7种病毒基因序列的基础上,设计了9组扩增子拯救多重PCR(Arm-PCR)引物,并对扩增体系中的Taq酶、Mg2+、dNTP、Primer Mix浓度及退火温度等参数进行调整和优化,结合基因芯片检测技术,建立了同步检测7种鱼类病毒的Arm-PCR方法。优化后的Arm-PCR方法第一步PCR体系为：Taq酶(2.5 U/μl)1.0μl,10×PCR Buffer(含20 mmol/L的Mg2+)5μl,dNTP(各2.5 mmol/L)5μl,10×Primer Mix(各2μmol/L)9μl,模板1μl,ddH2O补足至50μl,退火温度为56℃。研究结果显示,该方法可以在1支反应管内对上述7种病毒的9个致病基因同步进行扩增和检测,检测灵敏度分别为101 copies/μl (RGNNV、VHSV、ISAV-NS、ISAV-MA)、102 copies/μl (LCDV、Mega、IHNV、IPNV)和103 copies/μl (大菱鲆红体病虹彩病毒,TRBIV)。该方法特异性强,与半滑舌鳎、石斑鱼、大菱鲆和牙鲆基因组DNA不产生交叉反应。本研究建立的可同步检测7种鱼类病毒的Arm-PCR方法具有高通量、高灵敏度、高准确性的优势,能有效提高工作效率,在鱼类病毒的筛查和流行病学调查领域有广泛的应用前景。     

对虾6种病毒多重PCR检测方法的建立

本研究针对养殖对虾6种病毒,包括白斑综合征病毒(WSSV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)、肝胰腺细小病毒(HPV)、桃拉综合征病毒(TSV)、对虾杆状病毒(BP)和传染性肌肉坏死病毒(IMNV),选择各自的基因分别设计特异性引物和探针,首先进行了单一病毒的PCR验证,在此基础上建立了同时特异性检测6种对虾病毒的多重PCR检测体系。对反应条件进行优化并进行特异性和灵敏度的验证。50μl反应体系,Mg2+的最佳浓度为5mmol/L,ExTaq酶最佳用量为3.75U,反应程序中最佳退火温度为55.5℃。6种病毒之间以及与对虾基因组都存在很好的特异性。最终经试验验证,该系统的检测灵敏度对WSSV可达104拷贝,IHHNV可达102拷贝,HPV可达104拷贝,TSV可达103拷贝,BP可达105拷贝,IMNV可达105拷贝。虽然该多重PCR方法灵敏度不如单一的PCR检测高,但是通过实际样品检测验证了该方法省时、消耗较少,又不失准确性,在实际应用中具有可靠性和应用价值。     

3种淡水鱼病原菌多重PCR检测方法的建立与应用

根据辽宁地区常见淡水鱼病原菌嗜水气单胞菌、迟钝爱德华氏菌、蜡样芽孢杆菌的相关毒力因子,选择特异性较强的嗜水气单胞菌的溶血素(hlyA)基因、迟钝爱德华氏菌的效应蛋白(eseD)基因、蜡样芽孢杆菌非溶血性肠毒素(nheA)基因为分子靶标,分别设计1对特异性引物,建立可同步检测3种菌的多重PCR检测体系。研究结果显示,在3个毒力基因引物浓度均为0.4μmol/L,模板质量浓度为2.5 ng/μL,dNTP和酶添加量分别为2.5μL和0.3μL,退火温度为55℃时,各目的片段均可较好地扩增。敏感性试验结果表明,建立的多重PCR对嗜水气单胞菌、迟钝爱德华氏菌和蜡样芽孢杆菌的最低检测量分别为4.8、3.0 ng和2.6 ng。对临床分离的菌株样本进行检测,与16S rDNA分子鉴定结果的符合率为100%。建立的多重PCR体系检测方法特异、灵敏、快速,可同步完成淡水鱼源的嗜水气单胞菌、迟钝爱德华氏菌和蜡样芽孢杆菌的检测。     

多重PCR在创伤弧菌快速检测中的应用

建立多重PCR方法检测水体及海产品中的创伤弧菌。针对创伤弧菌的gyrB基因的不同位点设计了3对引物,扩增片断的大小分别为481、702、1065bp。该方法的灵敏度为10^2cfu／ml。共对3种海产品进行了创伤弧菌的检测,结果在3种海产品中均能特异性地检测到创伤弧菌。该方法快速,灵敏度高,特异性强。为海产品及水体中的创伤弧菌的检测提供了有效的方法。     

致病性嗜水气单胞菌多重PCR检测方法的建立

致病性嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)是近年中国各地大规模流行的淡水养殖鱼类暴发性疾病的主要病原,本研究针对GenBank中登录的致病性嗜水气单胞菌的气溶素基因(hlyA)、溶血素基因(aerA)以及为气单胞菌属所特有的内参照基因16S rRNA保守区设计了3对特异性引物,通过进行多重PCR反应体系优化,多重PCR产物的测序鉴定与特异性和敏感性实验,试图建立一种检测致病性嗜水气单胞菌的多重PCR检测方法。对8株嗜水气单胞菌、16株相关菌株进行多重PCR检测,结果显示,非致病性分离株均未扩增出毒力基因hlyA和aerA,而致病性分离株则至少含有hlyA基因;对40份送检的水产动物样品进行多重PCR检测,结果与常规微生物学检测符合率为97.5%。多重PCR检测方法具有较高的敏感性与特异性,最低可检测模板量为10 ng的样品。该方法的建立对水产动物嗜水气单胞菌病的快速诊断和分子流行病学的调查有重要意义。     

噬菌体防控水产品中细菌生物膜污染的研究进展

我国2018 年水产品总产量达到 6.45766×107 t,水产品人均占有量达到46.28 kg[1].随着水产品消费量的提高,由细菌引发的水产品安全问题频繁发生[2].98％以上的细菌会黏附于有生命或无生命物体表面后,产生大量的多糖、脂类等多聚物基质包裹在自身菌体外,形成细菌生物膜保护细菌在恶劣条件下生存并转移到新...     

水产品中孔雀石绿检测方法研究进展

水产品的安全问题日益成为社会关注的焦点,近年来,我国出口的鳗鲡以及国内市场上的水产品都发现了孔雀石绿残留.国内各有关检测机构相继开展了水产品中孔雀石绿残留量的检测.本文对现有的各种检测方法的优点和局限性作一概述,以便研究者能在此基础上进一步改进和发展.     

同时检测两种对虾病毒和4种弧菌的同步PCR方法的建立

通过检索、多重比对、分析和筛选GenBank中对虾白斑综合征病毒(WSSV)、传染性皮下和造血器官坏死病毒(IHHNV)、副溶血孤菌、创伤弧菌、哈维氏弧菌和溶藻胶弧菌的基因序列,设计了10对特异性引物,以已知毒株和菌株的DNA为模板进行PCR,均能扩增出与实验设计相符合的DNA片段,对PCR扩增条件进行优化,建立了可同时检测鉴别WSSV、IHHNV、副溶血弧菌、创伤弧菌、哈维氏弧菌和溶藻胶弧菌,并且能同时区分WSSV不同地理毒株的同步PCR方法.研究结果表明,该方法检测特异性好,检测通量大,适合于对虾多种病原的同时检测.     

苍术和番石榴的不同炮制方法及部位对水产病原菌抑制效果的影响

采用微量稀释法,以溶珊瑚弧菌（Vibrio coralliilyticus）、哈维弧菌（旷harveyi）、美人鱼发光杆菌杀鱼亚种（Photobacterium damselae subsp piscicida）、副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）、摩氏摩根氏菌（Morganellafulton）、创伤弧菌（V.vulnificus）6种病原菌共7株为受试菌,研究苍术（Atractylodeslancea）不同炮制品和番石榴（Psidiumguajava）不同部位的抑菌作用,并进一步测定其最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）。结果显示,番石榴叶和枝果部位以及苍术不同炮制品对溶珊瑚弧菌、美人鱼发光杆菌杀鱼亚种和哈维弧菌抑菌效果较明显,MIC和MBC分别为10^-3g·mL^-1和10^-1g·mL^-1,抑菌效果由高至低依次为番石榴叶〉番石榴果〉番石榴枝,麸炒苍术〉盐炙苍术〉苍术〉醋炙苍术。     

剑尾鱼在检测细菌毒力方面的应用

用１８株从鱼类所分离的细菌攻毒剑尾鱼,结果显示细菌对剑尾鱼的毒力与回归感染或攻毒敏感鱼的毒力结果较为一致,另外,用剑尾鱼感染病原菌的适宜途径为背肌注射,与原代比较,近交高代剑尾鱼个体之间对病原菌的反应较为一致,感染后死亡时间相对集中。水生实验动物剑尾鱼在检测鱼类细菌的毒力方面有较好的应用前景。     

酶联免疫法快速检测水产品中硝基呋喃类代谢物、氯霉素及氟苯尼考

应用特异性强的间接酶联免疫法,同时检测4种硝基呋喃类代谢物、氯霉素(CAP)和氟苯尼考(FF),建立快速分析水产品中6种药物残留量的方法.样品用盐酸进行消化,再由乙酸乙酯提取,使用酶联免疫试剂盒进行检测.实验结果显示,6种分析物均在其线性范围内,线性系数均大于0.995.在加标浓度为0.1、0.5和1.5μg/kg的加...     

维生素C碳点对水产养殖主要病原菌的抗菌性能及其生物相容性

为了验证维生素C碳点对水生动物病原菌的抑制效率,实验采用3倍梯度稀释法检测了维生素C碳点对嗜水气单胞菌、副溶血性弧菌、灿烂弧菌、诺卡氏菌等12种常见水产病原菌的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC),在此基础上,测定了其对这12种水产病原菌的抑菌动力学曲线。此外,基于纳米材料可能存在的生物相容性等问题,实验采用MTT法检测了维生素C碳点对草鱼肾细胞的细胞毒性,并以斑马鱼胚胎为测试对象,测定其经维生素C碳点暴露后的胚胎毒性。结果显示,维生素C碳点对所监测的12种水产病原菌均有显著的抑制作用,MIC为20.6～61.7μg/mL,基本达到与抗生素氟苯尼考同等的抗菌作用。维生素C碳点在MIC范围内胚胎和细胞存活率可接近100%,与对照组无差异。研究表明,维生素C碳点对水产主要病原菌有良好的杀菌和抗菌效果,具有较好的生物相容性,在水产养殖细菌性病害防治上具有潜在的开发应用前景。     

水产品中多种激素残留测定的高效液相色谱法

类固醇激素在水产养殖中的使用会导致水产食品中的残留,具有一定危害.本文对罗非鱼肌肉组织中的加标激素己烯雌酚、雌二醇、睾酮、甲基睾酮、醋酸甲羟孕酮和孕酮进行提取后,经过液液萃取法纯化浓缩,用高效液相色谱法检测.该方法能同时定量检测6种激素.在0.1～10 μg/ml范围内,这6种激素呈现良好线性关系.通过回收率、相对标准偏差的评价,该方法对雌二醇、睾酮、甲基睾酮及孕酮的测定准确性可靠,回收率大于70 %,可以应用于实际检测.     

水产品中替米考星残留量检测的条件优化

文章探讨了用高效液相色谱（HPLC）测定水产品中替米考星残留量的方法。通过对分析条件的优化,确定了最佳检测参数,并从提取和净化2个方面确立了前处理的最佳步骤与条件。通过验证不同基质试样的加标回收试验,结果显示,在20～200μg·kg-1的添加水平下回收率为77．22％～93．25％,相对标准偏差（RSD）小于5％,定量检出限（LOQ）为20μg·kg-1。分析结果表明,所建立的方法灵敏度高、准确性好且应用范围广,可用于日常水产品中替米考星残留量的检测分析。     

水产品中镉的形态分析及其危害

镉是生物体非必需的微量有害元素之一。近年来,随着工业污染加剧,造成水生动物体内镉超标。镉残留时间长,能蓄积,可沿食物链转移,从而对人体健康造成威胁。水产品中的镉形态复杂,本文就镉污染来源、存在形态及不同形态对水产动物危害和其检测手段等做一综述。     

高效液相色谱-荧光检测法测定水产品中15种多环芳烃

建立了高效液相色谱荧光检测法同时测定水产品中15种多环芳烃（polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs）的方法。通过液相色谱柱、荧光激发和发射波长等条件的优化,实现了15种多环芳烃组分基线完全分离和荧光高灵敏度检测。在优化的试验条件下,检测的15种多环芳烃中萘、苊和芴的检出限为0．5μg·kg^-1,苯并[b]荧蒽、二苯并[a．h]蒽和苯并[g,h,i]茈的检出限为2．0μg·kg^-1,其余化合物的检出限为1．0μg·kg^-1;在检测的15种多环芳烃中,菲、蒽、芘、苯并[a]蒽、崫、苯并[a]芘、茚并[1,2,3-cd]芘在0．001～0．500mg·L^-1质量浓度范围,其余化合物在0．002～1．000mg·L^-1质量浓度范围,呈良好的线性相关,相关系数R^2〉0．995;样品加标水平分别为2．0μg·kg、10．0μg·kg^-1和100．0μg·kg^-1时回收率为71．1％-98．4％,相对标准偏差（RSD）〈10％。该检测方法重现性高,检测灵敏度和准确度均满足分析要求。     

水产品溯源技术研究进展

目前水产品生产中滥用抗生素、以次充好、以假乱真等现象时有发生。水产品溯源技术在保证水产品质量安全方面起着非常重要的作用,利用该技术可以在食品安全事件发生后,第一时间找到问题源头,从而对安全事件进行更好地分析,进而保护消费者的合法权益。文章主要从物理、化学、生物等3个方面对水产品溯源技术的研究进展进行归纳总结,并对水产品溯源技术未来的发展趋势进行了展望。     

世界主要渔业国家水产品生产与贸易特征分析

渔业不仅为人类提供大量优质动物蛋白,同时还关乎世界数亿人口的收入和生计问题。借助FAO统计数据,对2000～2009年世界主要渔业国家水产品生产发展趋势进行了分析,得出以下结论:(1)总体而言,全球水产品产量呈现增长率下降、年均增长量上升、产量与贸易结构稳定的态势;(2)在水产品产量位居前15位的国家中,一半以上国家的产量仍呈现增长趋势,其中产量居前六位的国家约占世界水产品总量的比重超过50%;(3)从不同结构来看,海洋捕捞水生动物产量呈现下降趋势,而养殖产量则呈现上升趋势,按照水产品进出口数量与价值的对应关系,认为日本和德国属于进口均衡型国家,而中国、挪威和西班牙属于水产品出口均衡型国家。