毛果杨腺苷酸合成酶基因ACS-1的克隆和酶学分析

乙酰辅酶A连接酶(ACS)属于腺苷酸合成酶超基因家族,与4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL)有着紧密的进化关系。通过对毛果杨数据库中4CL基因的同源检索,克隆获得了毛果杨基因Prt4CL8的序列(命名ACS-1,Genebank登录号XM_002329288.1)。序列分析表明,ACS-1具有ACS的关键残基以及C端末尾的PTS1序列;而4CL的高度保守结构域box Ⅰ和box Ⅱ在该蛋白中不保守。利用PCR技术克隆序列,构建表达载体pET30a,转化大肠杆菌并表达重组蛋白。对其进行酶学活性分析,结果证明该蛋白不能催化4CL常见底物,而对ACS底物乙酸钠具有明显催化活性:K_m为(0.25±0.02)mmol·L^-1;V_m为(8.63±0.63)mmol·L^-1。结果表明,ACS-1是ACS家族成员,为腺苷酸合成酶超基因家族成员的鉴定与功能分析提供了一定的理论基础。     

毛果杨丝氨酸蛋白酶抑制剂基因PtrSPI的克隆及真核表达

利用PCR技术从毛果杨(Populus trichocarpa)中分离得到1条丝氨酸蛋白酶抑制剂基因PtrSPI,该基因cDNA编码区全长为1176 bp,可编码391个氨基酸。BlastP预测结果显示,该丝氨酸蛋白酶抑制剂属于SERPIN超家族。多序列比对结果表明,毛果杨PtrSPI基因的氨基酸序列与已报道的胡杨(P.euphratica)丝氨酸蛋白酶抑制剂氨基酸序列XP_011030699同源性最高,相似性为92%,且蛋白的C端氨基酸序列都含有高度保守的反应中心环(RCL)。在此基础上,成功构建了PtrSPI基因的重组真核表达载体pPICK-PtrSPI并获得了重组毕赤酵母菌株GS115-PtrSPI。利用终质量分数为0.5%甲醇诱导重组真核蛋白表达,SDS-PAGE电泳结果显示,在42648.45处出现了重组蛋白,与预期值一致。     

毛果杨多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白家族PtPGIP的生物信息学分析

植物多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白（Polygalacturonase-inhibiting protein,PGIP）可特异性识别病原菌分泌的多聚半乳糖醛酸酶,从而抑制病原菌对植物细胞壁重要成分——果胶的降解,以增强植物病原菌抗性。为探明模式树种杨树PGIP抗病机制,对毛果杨PGIP(PtPGIP)家族成员进行鉴定,以及对蛋白质理化性质和结构、系统进化、基因表达模式进行分析。结果表明,毛果杨基因组中鉴定到4个PtPGIP基因,其中,PtPGIP1和PtPGI2位于6号染色体串联重复,PtPGIP3和PtPGIP4位于16号染色体串联重复;PtPGIP1是假基因,PtPGIP2、PtPGIP3、PtPGIP4具有完整的PGIP蛋白结构域。PtPGIP均为疏水蛋白,具有良好的脂溶性,且具有3～7个N-糖基化位点。亚细胞定位预测表明,其可能定位于细胞外。除PtPGIP1以外,PtPGIP2、PtPGIP3、PtPGIP4蛋白均包含10个LRR片段,LRR中的保守序列xxLxLxx及蛋白质分子对接均表现出差异性。PtPGIP基因的表达具有组织特异性,PtPGIP1基因在各个组织部位的表达水平均较低...     

毛果杨半胱氨酸蛋白酶基因PtCP2和PtCP4原核表达及蛋白纯化

【目的】对毛果杨半胱氨酸蛋白酶基因Pt CP_2和Pt CP4进行原核表达及重组蛋白纯化,为进一步研究该基因的酶学特征和生理功能打下基础。【方法】从毛果杨中克隆两个半胱氨酸蛋白酶基因Pt CP_2和Pt CP4,构建其原核表达载体p ET-30a-Pt CP_2及p ET-30a-Pt CP4,并在转入大肠杆菌后在体外诱导表达重组蛋白,采用包涵体洗涤法对目的蛋白进行纯化。【结果】Pt CP_2基因CDS序列全长1107 bp,编码368个氨基酸;Pt CP4基因CDS序列全长1104 bp,编码367个氨基酸。Pt CP_2和Pt CP4基因编码的蛋白均属于RD19A-like类型木瓜蛋白酶。Pt CP_2和Pt CP4基因在毛果杨根、茎、叶中均有表达,其中Pt CP_2在叶中表达量最高,Pt CP4在根中表达量最高。通过包涵体洗涤法在体外得到了高表达量、单一的重组蛋白Pt CP_2和Pt CP4,切除信号肽后蛋白酶大小分别为38.151和38.069 k D。【结论】原核表达获得的纯化重组蛋白Pt CP_2和Pt CP4可用于进一步研究毛果杨半胱氨酸蛋白酶的酶学特征和生理功能。     

毛果杨PtAREB1基因启动子的克隆及功能

为了研究杨树ABF2同源基因的表达规律,从毛果杨基因组DNA中克隆出Pt AREB1基因上游一段1 800 bp序列。序列分析结果表明,该序列含有逆境胁迫响应元件TC-rich repeats、ABA应答元件ABRE和茉莉酸甲酯(Methyl Jasmonate,Me JA)应答元件TGACG-motif等胁迫相关元件。在序列分析的基础上,构建了Pt AREB1基因启动子驱动GUS报告基因的植物表达载体,利用农杆菌介导的花粉管通道法获得转基因拟南芥。结果表明Pt AREB1启动子可以在干旱、ABA、盐、Me JA和SA胁迫下,驱动GUS基因在转基因拟南芥的根、茎和叶中表达。说明Pt AREB1基因可能与干旱、高盐等胁迫应答紧密相关。     

毛果杨 RAV/PLC 基因生物信息学分析

【目的】利用生物信息学手段,对毛果杨(Populus trichocarpa)RAV/PLC基因编码蛋白质结构和特征进行预测。【方法】以PLC(Phospholipases C)为关键字在Phytozome数据库搜索毛果杨磷脂酶C基因序列,以RAV/PLC基因及其蛋白质序列为研究对象,利用多种生物信息学分析工具对其基因结构及蛋白功能进行分析。【结果】在毛果杨PLC编码基因中发现了一个可编码RAV和PLC结构域的特殊基因,该基因在Phytozome数据库中编号为Potri.018G109200,ORF区域长度为1 650 bp,编码549个氨基酸,预测分子量为62.72338 ku,理论等电点为9.16;该基因在茎中表达量最高,芽中表达量其次之根和叶中表达量较低。其编码蛋白包含1个AP2结构域、1个B3结构域和1个PLC-X结构域,AP2/B3结构域和PLC-X结构域之间可能存在一个跨膜区;启动子元件分析表明,RAV/PLC基因可能与光应答及激素应答相关;String软件预测RAV/PLC基因可能与MYB103、WRKY49、ABI5、DXS2存在功能关联;KEGG分析表明,该基因主要与RAV转录因子信号通路有关;同时利用同源建模方法获得了RAV/PLC的完整三维模型。【结论】通过对RAV/PLC基因结构和蛋白功能预测,为该基因克隆及参与信号通路分析提供参考。     

毛果杨ZHD家族全基因组水平鉴定及在干旱胁迫下的表达分析

  目的  对毛果杨Populus trichocarpa ZHD (PtrZHD)家族进行生物信息学以及干旱胁迫下表达特性分析,为研究PtrZHD在干旱胁迫中的功能提供参考。  方法  利用生物信息学方法从全基因组水平鉴定出毛果杨ZHD家族全部成员,并对其进化、理化性质、基因结构、保守基序、启动子顺式作用元件和表达特性进行分析。  结果  毛果杨ZHD家族包括21个成员,可分为7个亚家族;有8对同源基因,且非同义替换率(K_a)/同义替换率(K_s)值远小于1。该家族成员理化性质存在差异,但其结构较为保守,均含有Motif 1;启动子区含有数量不等的激素和非生物胁迫响应元件,不同基因之间响应元件的种类存在差异。在毛果杨PtrZHDs中,分别有1、7和13个基因在根、茎和叶组织中具有偏好性表达特征;PtrZHD家族成员对干旱胁迫的响应具有组织和时间表达特异性,在根、茎和叶部组织中各成员的表达量不同,但随着干旱胁迫时间的增加均呈先上升后下降的趋势。  结论  PtrZHD家族基因对干旱胁迫有不同程度的响应,可调控毛果杨对干旱胁迫的应答。图6表2参27     

毛果杨HDAC基因家族序列及其表达分析

【目的】研究毛果杨组蛋白去乙酰化酶（HDAC）基因家族序列及其对脱落酸（ABA）的应答反应,为HDAC家族基因的功能研究奠定基础。【方法】采用生物信息学方法对毛果杨HDAC家族的16种蛋白进行系统分析;采用实时荧光定量 PCR方法,分析了100 μmol/L ABA叶面喷洒处理后6和24 h毛果杨叶片HDAC家族16个基因的表达情况。【结果】HDAC家族蛋白分析显示,毛果杨HDAC可分为3个亚家族,即RPD3/HDA1、HD2和SIR2亚家族,与拟南芥HDAC蛋白的亲缘关系较近。HDAC家族大多数成员为亲水性蛋白质（HDA912属于疏水性蛋白）,其等电点呈酸性（除了HDA912和SIR2亚家族）。HDAC家族蛋白受磷酸化调节,磷酸化位点主要发生在丝氨酸残基上。绝大部分HDAC蛋白都有不同数目的跨膜螺旋和不同的跨膜方向,而在HD2蛋白中没有发现跨膜区。二级结构分析显示,RPD3/HDA1和SIR2亚家族成员均含有不同比例的α-螺旋、β-折叠片和无规则卷曲,其中无规则卷曲比例达到50%以上（HDA912除外）;而HD2亚家族成员不含有α-螺旋,其二级结构主要以无规则卷曲为主,比例高达80%左右。HDAC家族蛋白主要定位于细胞核内,在细胞质、细胞器及其他膜结构中也有分布,HD2蛋白几乎都定位于细胞核内。RPD3/HDA1和SIR2亚家族成员的三级结构可分为6种类型,预示其生物学功能也可能存在差异。实时荧光定量 PCR分析结果表明,ABA处理6 h显著提高了毛果杨-HDA901、HDA903和HDT-901基因的表达,而ABA处理24 h则会显著降低-HDA907和HDT-901基因的表达。【结论】作为植物特有的一类组蛋白去乙酰化酶,毛果杨HD2亚家族蛋白在序列和结构等多个方面与其他2个亚家族不同。ABA能够调节杨树HDAC家族基因的表达,HDAC家族基因不同成员对ABA的应答反应不同。     

毛果杨VOZ基因家族的生物信息学分析（英文）

为探究毛果杨VOZ基因家族的生物学特征,运用生物信息学方法对毛果杨VOZ基因家族4个成员的核苷酸序列、蛋白质序列和基因的组织表达进行分析。结果表明：毛果杨的4个PtVOZ基因均匀的分布在4条染色体上;编码蛋白的长度和分子质量都相差不大,亚细胞定位都位于细胞核内,属于不稳定的酸性亲水非脂溶性蛋白;基因结构都是4个外显子和3个内含子的结构模式;PtVOZ转录因子二级结构各组分所占比例顺序为：无规则卷曲>α螺旋>延伸链>β折叠,三级结构在空间构象上非常相似。系统进化树分析表明,毛果杨与同属双子叶植物的VOZ转录因子亲缘关系更近;毛果杨的4个PtVOZ基因在幼苗和不同组织中均有表达且其表达量存在差异。本研究为进一步挖掘PtVOZ基因的分子生物学功能提供了必要的理论基础。     

毛果杨基因PtNRT2.7的功能初步鉴定与分析

本研究从毛果杨基因组中克隆一个NRT2家族的新基因PtNRT2.7。生物信息学分析显示,其编码的蛋白不存在信号肽及切割位点,属于非分泌蛋白;具有11个跨膜结构域,亲水区与输水区交替分布,主要分布于细胞膜,而且该基因的亚细胞定位分析显示该蛋白定位于细胞膜,综合以上结果可判断此蛋白为膜蛋白。对其在毛果杨的表达特征分析显示,PtNRT2.7基因主要在叶片中表达,其中成熟叶中的表达量最高;PtNRT2.7基因受硝酸盐诱导并在1 h时达到表达峰值;SA、JA、GA或IAA激素处理可诱导PtNRT2.7基因表达,而在Eth、ABA或NaCl处理下该基因的表达受抑制。利用农杆菌花序侵染法转化野生型拟南芥和突变体(nrt2.7),显示在KNO3浓度大于0.1 mmol/L时,PtNRT2.7过表达株系相比较拟南芥野生型和突变体株系促进了根的生长,而atnrt2.7突变体在KNO3浓度大于1 mmol/L的条件下抑制了根的生长,且PtNRT2.7过表达atnrt2.7突变体株系可恢复正常生长。研究结果表明,PtNRT2.7可以由硝酸盐和激素诱导并增强植物根系的生长,提高氮素的吸收利用。      

毛果杨（Populus trichocarpa）中ZINC-INDUCED FACILITATOR1（ZIF1）同源基因的生物信息学分析

以拟南芥ZIF1基因序列为基础,利用生物信息学软件及网站,找出毛果杨中ZIF1基因同源序列,对其进行生物信息学分析,并与其他物种中ZIF1同源基因序列进行多重比对与进化分析,使用实时荧光定量PCR技术验证毛果杨中ZIF1同源基因在锌胁迫条件下,根和叶中该基因的表达情况。结果预测出4个符合ZIF1基因基本结构特征,且具有与该基因相同保守功能结构域的毛果杨ZIF1同源基因,这4个基因属于稳定蛋白,可能具有信号肽,明显疏水区和典型跨膜区,基因定位在质膜上,实时荧光定量PCR结果表明,锌过量存在时,这4个基因表达上调,且根中最为显著。以上分析为进一步研究林木中ZIF1同源基因奠定了理论和实践基础。     

毛白杨4CL-like基因的克隆与原核表达分析

为得到毛白杨4CL-like基因并对其原核表达特性进行分析,利用毛白杨叶片的总RNA反转录得到的总cDNA为模板,利用PCR技术克隆得到毛白杨4CL-like基因(登录号:XP_002315339.1).利用MEGA软件对4CL-like基因及其他9个来自不同物种的4CL基因进行进化树分析.最后通过构建pET30-4CL-like原核表达载体对该基因进行原核表达分析.结果显示,克隆得到的4CL-like基因CDS区全长为1 758 bp,编码585个氨基酸.系统进化分析表明,该基因与葡萄中的4CL-like5有很高的同源性.另外,SDS-PAGE分析表明,4CL-like基因在大肠杆菌BL21中成功表达,所表达融合蛋白的分子量约为60 ku.     

杨树磷酸肌醇特异性磷脂酶C基因家族鉴定与分析

为了对已测序杨树Populus trichocarpa Torr.Gray中磷酸肌醇特异性磷脂酶C(phosphoinositidespecific phospholipase C,PI-PLC)家族基因进行系统分析,利用杨树基因组数据库,通过生物信息学手段,鉴定杨树PI-PLC家族基因的基因结构、染色体定位和编码蛋白,通过蛋白序列比对进行进化和分类分析。结果表明,杨树中含有7个PI-PLC家族基因,含有8~10个外显子,分布于杨树的4条染色体上。MEME和Pfam保守结构域分析显示,杨树PI-PLC蛋白均含有4个保守的EF、X、Y和C2结构域。蛋白质进化树分析结果表明PI-PLC可分为2个亚家族。     

毛果杨富含谷氨酸蛋白PtrGARP1基因启动子特性

为了研究PtrGARP1与杨树木质化生长的相关性,明确木材发育及形成的分子机制,以毛果杨幼树为材料,提取各组织的cDNA进行PCR扩增,并构建植物表达载体在模式植物拟南芥中进行PtrGARP1组织表达分析。结果显示,PtrGARP1基因在毛果杨木质化组织内高丰度表达,且表达水平与幼茎木质化程度同步增加;用Gateway技术构建该基因启动子融合报告基因GUS的ProPtrGARP1::GUS植物表达载体,转化野生型拟南芥获得5个稳定表达的转基因株系;GUS活性染色分析显示,PtrGARP1基因启动子活性集中在转基因植株发达的维管组织内。这个结果暗示着PtrGARP1与杨树木质化生长相关,可能参与木材发育及形成。     

欧美杨PdPP2C基因的克隆与功能分析

欧美杨是中纬度地区最适合的短轮伐期工业用材集约经营树种之一,然而盐渍、干旱和低温严重影响了欧美杨的生长发育和产量。本文利用RT-PCR等技术克隆出欧美杨PP2C基因并进行了序列分析。PdPP2C基因开放阅读框为1 320 bp,编码439个氨基酸。蛋白质序列分析表明,PP2C蛋白N端保守性不强,C端有保守的蛋白磷酸酶区域。荧光定量PCR分析表明,该基因在欧美杨根、成熟叶、顶端叶和茎中都有表达且根中表达量最高。逆境胁迫分析表明,该基因受NaCl、ABA和干旱等诱导表达。干旱和盐胁迫处理下转PdPP2C基因拟南芥与野生型相比生长受到较少抑制,且叶绿素含量上升,丙二醛含量下降,表明PdPP2C基因作为一种蛋白磷酸酶提高了拟南芥的抗逆性。