绵羊STMN1基因的克隆、序列分析及其组织表达

为阐明STMN1功能及其对绵羊肌肉生长发育的影响,本研究克隆了绵羊STMN1基因序列,对该基因编码蛋白质的理化性质进行预测,分析其在绵羊不同组织及不同发育时期背最长肌和股二头肌的表达特性。结果表明,克隆得到绵羊STMN1基因CDS区长450 bp,编码149个氨基酸,蛋白质分子量为17 302.51 D,等电点为5.75;绵羊STMN1氨基酸序列与山羊、牛、猪、小鼠和人的相似性达到90%以上;系统进化树分析表明,绵羊STMN1基因与山羊的亲缘关系最近。STMN1在绵羊睾丸中表达量最高,心和脾表达量次之,肝、肺、肾、背最长肌和股二头肌表达量较低。STMN1在不同发育阶段的绵羊背最长肌和股二头肌中均有表达,在绵羊背最长肌中,24月龄绵羊中STMN1高表达,0、2、5、12月龄中度表达;在绵羊股二头肌中,5月龄绵羊中STMN1高表达,2月龄中度表达,0、12、24月龄低表达。本研究结果为进一步阐明STMN1基因在绵羊中的生物学功能奠定了理论基础。     

肉鸡IFN-alpha基因的克隆、序列分析以及在大肠杆菌中的表达

干扰素（ＩＦＮ）是一种具有广谱抗病毒、抗肿瘤以及免疫调节等活性的细胞因子。本研究通过ＰＣＲ从ＡＡ肉鸡基因组ＤＮＡ中克隆了ＩＦＮ－α（ＣｈＩＦＮ－α）基因,测序分析,并将该基因与表达载体ｐＱＥ３０相连,构建重组表达质粒ｐＱＥ３０／ＣｈＩＦＮ－α,以ＩＰＴＧ诱导在Ｍ１５中进行表达。测序结果表明ＣｈＩＦＮ－α的开放阅读框（ＯＲＦ）是由４８６个核苷酸编码的,成熟蛋白为１６２个氨基酸,有４个糖基化位点,推测     

家蚕bcl-2基因的克隆、序列分析及其表达模式

为了研究家蚕耐氟中毒分子机理,本文采用荧光差异显示技术分析了家蚕对氟化物耐性品系441和感性品系440添氟后的基因表达的差异,获得差异表达cDNA片段A14-6,数据库分析为编码抗凋亡基因bcl-2 (AB008449)。BmBCL-2编码965个氨基酸,分子量为108.800 kD,等电点为6.370。结构分析无C末端疏水跨膜结构,含有19个外显子和18个内含子,剪切信号符合GT/AG规则。蛋白质同源性分析表明BmBCL-2与BCL-2家族蛋白一样均有BH1、BH2、BH3和BH4功能域,用ClustalX1.83、MEGA3.1等软件分析氨基酸序列和得到系统进化树,结果表明BmBCL-2与其它物种BCL-2蛋白保守性较低。RT-PCR结果表明,bcl-2在家蚕耐氟品系441和感性品系440五龄第48h五个组织均有表达,在441DZ（耐氟品系）中表达丰度明显高于440DZ（敏感品系）,并且在脂肪体表达量相对较高。200mg•L-1氟化钠和清水对照处理家蚕后48h,bcl-2在41DZ和440DZ中肠的转录水平没有显著变化,但在添氟后,耐氟品系441F表达水平相对高于440F品系。以上结果暗示该基因可能与家蚕的耐氟性有关。     

猫白介素-18基因的克隆、序列分析及其表达

用猫白介素18(interleukin,IL-18)基因特异性引物对刀豆蛋白(ConA)刺激后猫外周血单核细胞(PBMCf)总RNA进行了RT-PCR扩增,并将扩增产物纯化后克隆入pMD18-T中进行核苷酸序列测定。结果该基因全长579bp,编码192个氨基酸(GenBank登录号:DQ100372)。在推导的猫IL-18氨基酸序列中,无信号肽序列和潜在的N-联糖基化位点,但存在4个Cys残基。与不同物种IL-18相比,猫IL-18与犬、羊、牛和猪IL-18核苷酸序列有较高的同源性,分别为89.8%、88.6%、88.4%和88.1%,但与小鼠和鸡IL-18有明显的种属差异。将目的基因片段进一步亚克隆到大肠杆菌(Escherichia coli)表达载体pET28a中构建了重组质粒pETIL-18,转化大肠杆菌BL21(DE3),并用IPTG诱导。结果重组菌菌体裂解物经SDS-PAGE电泳可检测到分子量为27.5kD的重组目的蛋白。经凝胶薄层扫描,目的蛋白表达量可占菌体蛋白的13.6%。     

家蚕谷胱甘肽转移酶基因的克隆、序列分析及其表达模式

谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)是昆虫体内重要的解毒酶系,在对外源和内源化合物解毒代谢中起着重要的作用。以GenBank中已知的昆虫GST的氨基酸序列在家蚕(Bombyx mori)基因组序列中作TBLASTN检索,获得了多个可能的家蚕GST同源基因。对其中的一个GST新基因进行了EST分析和克隆,结果表明,该基因编码区全长663bp。以该基因推导的氨基酸序列与其它物种的GSTs进行相似性比较和系统发育分析,发现此基因为delta家族的成员,并命名为BmGSTd3。RT-PCR结果表明,BmGSTd3基因在家蚕5龄第3天的8个组织中都有表达,中肠和表皮的表达丰度较高。在辛硫磷处理家蚕后的72h内,BmGSTd3基因的转录水平与对照组相比没有显著的变化。对BmGSTd3基因的5'侧翼区的调控序列进行了预测,共发现12个可能与内源和外源物代谢以及抗氧化相关的转录调控元件。     

绵羊脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白基因(FABP4)cDNA的克隆、表达及其结构模拟分析

为探讨绵羊脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白(FABP4)在不同生长阶段背最长肌中的表达特性,本实验以成年小尾寒羊(Ovis aries)皮下脂肪组织总RNA为实验材料,在脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白基因(FABP4)cDNA保守区域设计1对引物Ff和Fr,采用RT-PCR方法克隆了绵羊FABP4全编码序列,并运用生物软件对FABP4蛋白空间结构进行分析.同时运用实时荧光定量PCR法,对FABP4在皮下脂肪和背最长肌中的表达以及不同日龄在背最长肌中的表达量与背最长肌肌内脂肪含量的相关性进行了初步研究.结果表明:绵羊FABP4基因cDNA长度为464bp,包含1个由399 bp组成的开放阅读框,编码132个氨基酸.生物信息学分析表明,不同物种间FABP4氨基酸序列具有较强的保守性,蛋白质空间结构呈2个α螺旋和10个β折叠围绕的桶状构型.实时荧光定量PCR试验表明,FABP4基因在160和200日龄绵羊背最长肌中的表达量明显高于90日龄背最长肌的表达量(P＜0.05);且在90、120、160和200日龄绵羊背最长肌中的表达量与相应日龄的背最长肌肌内脂肪含量呈正相关(R2=0.7196,P＜0.01).本研究结果表明,调控FABP4基因在背最长肌的表达是改善绵羊肉质的潜在途径.     

香鱼抗凝血酶基因(AT)cDNA的克隆、序列分析及组织表达特征

抗凝血酶(antithrombin,AT)主要抑制凝血酶(thrombin)及其它凝血因子的活性,并具有重要的抗炎活性。本实验从香鱼(Plecoglossus altivelis)肝组织cDNA文库中成功获得了香鱼AT基因的cDNA全序列(EMBL登录号:FN429980)。测序结果表明,香鱼AT基因cDNA全长1487个核苷酸,包含1个大的开放阅读框(ORF),推测编码1个由453个氨基酸组成的蛋白,N端23个氨基酸为信号肽序列。成熟AT具有与哺乳动物AT相似的特征结构,包括:羧基末端附近的丝氨酸蛋白酶活性中心、6个保守的Cys残基形成的3个二硫键结构和4个N-糖基化位点。氨基酸序列分析表明,香鱼AT与大西洋鲑(Salmo salar)AT氨基酸序列同源性最高,为81%。系统进化树分析表明,物种AT的进化关系与目前接受的物种分类关系基本一致,香鱼AT位于鱼类AT簇中,与大西洋鲑、红鳍东方豚(Takifugu rubripes)和斑马鱼(Danio rerio)AT进化相关性最高。AT mRNA在健康香鱼的肝组织中表达量最大,在脾、肾和脑中表达量较低。实时荧光定量PCR结果表明,在鳗利斯顿氏菌(Listone...     

绵羊甘露聚糖结合凝集素基因(MBL)全长DNA序列克隆及生物信息学分析

绵羊甘露聚糖结合凝集素(MBL)是肌体天然免疫系统的重要组成部分。根据人(Homo sapiens)和牛(Bos taurus)的MBL基因序列的同源保守区域,分段设计9对特异性引物,以中国美利奴羊(Ovis aries)血液基因组DNA为模板,经扩增、测序、拼接,首次克隆到长为4462bp的绵羊MBL基因组DNA序列,包括了该基因的启动子区、4个外显子和3个内含子,编码249个氨基酸;BLAST分析其与牛MBL-C编码的氨基酸同源性最高为96.39%,判定其为MBL-C型基因,并将该序列提交至GenBank(Accession No.FJ977629);通过Expasy网站预测其蛋白结构功能特征,1～19氨基酸为绵羊MBL基因信号肽区域,外显子1编码N-端富含胱氨酸区和8个Gly-X-Y重复序列的胶原样区,外显子2含有12个Gly-X-Y的胶原样区,外显子4编码的碳水化合物识别域(CRD)具有C型凝集素CRD的共同特征。本研究为国内首次报道绵羊MBL基因比较完整基因组DNA序列,为深入研究MBL的结构与功能以及MBL缺损的分子机制提供基础数据。     

SOX9基因在绵羊不同组织中的表达及其在睾丸中的定位

SRY-盒包含蛋白9(sex determining region Y-box 9,SOX9)基因在哺乳动物个体发育中扮演重要角色,广泛存在于各种组织,但主要在睾丸组织表达,参与调控睾丸细胞的增殖与分化.本研究采用qRT-PCR方法检测了6月龄小尾寒羊(Ovis aries)体组织及其0、2、6、12和24月龄睾丸组织SOX9mRNA的表达规律,并运用Western blot、免疫组织化学技术对不同发育期睾丸SOX9蛋白进行表达与定位研究.结果显示,在体组织中SOX9 mRNA表达无组织特异性,但垂体表达量最高,下丘脑和睾丸次之,肌肉组织9背最长肌和股二头肌)几乎无表达;随着月龄的增加,SOX9 mRNA在睾丸中的表达量先降低后上升,其中6月龄睾丸表达量显著高于0和2月龄(P＜0.05),但显著低于12和24月龄(P＜0.05).SOX9蛋白表达趋势与mRNA基本一致,0、2和6月龄睾丸中表达较低,少量支持细胞和间质细胞呈免疫阳性反应;12和24月龄睾丸中表达较高且呈增加趋势,支持细胞、部分间质细胞、极少量初级精母细胞和次级精母细胞呈免疫阳性反应.研究结果表明,SOX9基因在绵羊不同体组织中广泛表达,在下丘脑-垂体-睾丸生殖轴中发挥重要作用,并与睾丸细胞的增殖及分化过程有密切的关系.     

绵羊GlyCAM-1基因克隆、核苷酸变异及其组织表达分析

糖基化依赖细胞粘附分子(GlyCAM-1)是粘液素(mucin)糖蛋白家族的成员,是乳腺细胞合成的一种乳脂球膜蛋白(MFGMPs)的重要组成部分。GlyCAM-1在乳腺发育和泌乳中发挥着重要作用,为探究该基因的序列特征、核苷酸序列变异和表达特征,以高泌乳量的小尾寒羊(泌乳高峰期和空怀期)和低泌乳量的甘肃高山细毛羊(泌乳高峰期)的乳腺组织为研究对象,利用克隆测序、RT-qPCR、生物信息学等方法克隆绵羊GlyCAM-1基因的编码区,分析GlyCAM-1的理化性质和蛋白质结构,并检测GlyCAM-1基因的组织表达特性。结果表明,绵羊的GlyCAM-1基因CDS区全长465 bp,编码154个氨基酸。测序结果表明,在该基因CDS区检测到7个SNPs,其中2个为同义突变,5个为错义突变。GlyCAM-1二级结构主要以α-螺旋和无规则卷曲为主,延伸链则散布于整个蛋白质结构中。String分析结果表明,GlyCAM-1蛋白与CD34、MadCAM-1都作为L-选择素(L-selectin)的配体发挥作用;RT-qPCR结果表明,GlyCAM-1基因表达具有组织特异性、品种特异性和时空特异性,乳腺、心脏、肝脏、肺脏、脾脏、肾脏、卵巢和背最长肌8个组织中,GlyCAM-1基因只在乳腺和肺脏组织中表达,在其余6个组织中均不表达,其中乳腺中的表达量最高;在泌乳高峰期的乳腺组织中,GlyCAM-1在高泌乳量的小尾寒羊中的表达量显著高于甘肃高山细毛羊(P<0.05);在小尾寒羊的乳腺组织中,GlyCAM-1在泌乳高峰期的表达量极显著高于空怀期(P<0.01)。本研究结果丰富了绵羊基因组数据,为深入研究GlyCAM-1基因的泌乳生物学功能及其机理提供了基础数据。     

绵羊甘露聚糖结合凝集素（MBL）基因的克隆及序列分析

甘露聚糖结合凝集素(MBL),又称甘露聚糖结合蛋白(mannan/mannose-binding protein,MBP),是C型凝集素超级家族中胶凝素家族成员.目前,关于MBL的研究在人、小鼠和大鼠上已经相当详尽,在牛、猪、马、弥猴、黑猩猩、狒狒、兔和鸡上也有一定的研究,除鸡外,其余的都已发现2种MBL:MBL-A(血清型)和MBL-C(肝型),但在绵羊上仍为空白.本实验以绵羊的基因组DNA为模板,借助人、牛MBL的保守序列来获得绵羊MBL基因片段.     

绵羊TrkA基因的表达及其SNPs与产羔性状的关联性分析

为研究绵羊(Ovis aries)酪氨酸蛋白激酶受体(tyrosine kinaseA,TrkA)基因组织表达特征及其SNPs与产羔性状的关联性,本研究以TrkA基因为研究对象,利用qRT-PCR分析其在湖羊心、肝、脾、肺、肾、瘤胃、十二指肠、背最长肌、脂肪、下丘脑、垂体和卵巢等12种组织中的表达水平,同时采用DNA混合池测序和限制性长度片段多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)等技术检测TrkA基因在963只有产羔记录湖羊(n=526)和小尾寒羊(n=437)群体中的多态性,及其与产羔性状的关联性.结果表明,TrkA基因在卵巢、肺和肝脏中的表达水平最高,在心脏中次之,在背最长肌、瘤胃、脂肪、下丘脑、垂体、脾、肾和十二指肠间表达量较低.通过DNA池测序和RFLP分析,在TrkA基因的内含子9和14分别检测到NC_019458.2:g.105281586C＞T和NC_019458.2:g.105284246G＞C两个突变.在NC_019458.2:g.105281586C＞T位点,小尾寒羊和湖羊群体中均检测到3种基因型,分别为CC、CT和TT型,其中CT为优势基因型,C为优势等位基因;在该位点,湖羊群体遗传杂合度(heterozygosity,He)和遗传纯合度(homozygosity,Ho)均为0.50,有效等位基因数(effective allele numbers,Ne)为1.99;小尾寒羊He=0.51,Ho=0.49,Ne=1.95;多态信息含量(polymorphic information content,PIC)均为0.37,且在小尾寒羊群体中偏离了Hardy-Weinberg平衡状态.在NC_019458.2:g.105284246G＞C位点上同样检测到GG、GC和CC三种基因型,其中GC为优势基因型,C为优势等位基因;该位点在湖羊群体He和Ho均为0.50,Ne=2.00;小尾寒羊He=0.49,Ho=0.51,Ne=l.96.PIC均为0.37;x2适合性检验结果表明,湖羊群体在该位点显著偏离于Hardy-Weinberg平衡状态.多态位点与绵羊产羔数的关联性分析表明,NC_019458.2:g.105281586C＞T与湖羊和小尾寒羊的产羔数显著相关(P＜0.05),而NC_019458.2:g.105284246G＞C突变位点仅与湖羊的产羔性能显著相关(P＜0.05).本研究结果表明,TrkA基因可作为绵羊产羔性状早期筛选的候选基因,其SNPs可为绵羊繁殖性状分子标记辅助选择提供依据.     

绵羊PGRMC1蛋白的cDNA克隆、序列分析及组织表达

孕激素受体膜组分1 (progesterone receptor membrane component 1,PGRMC1)是膜相关孕激素受体蛋白家族成员之一,参与哺乳动物颗粒细胞和黄体细胞孕酮的抗凋亡过程,在促进卵母细胞成熟和维持卵巢机能方面具有重要作用.本研究通过RT-PCR对绵羊(Ovisaires)PGRMC1基因进行了克隆和组织表达谱分析,并利用实时荧光定量PCR对该基因在繁殖特性上存在明显差异的两个绵羊品种——多浪羊(常年发情)与中国美利奴羊(季节性繁殖)发情期和乏情期性腺轴组织的表达情况进行了检测.结果获得了绵羊PGRMC1基因部分cDNA序列(GenBank登录号:KM114208),其中编码区(Coding sequence,CDS)全长585 bp,编码194个氨基酸.其编码蛋白中包含一个Cyt-b5保守结构域.该基因在所检测绵羊各组织中广泛表达,其中以卵巢、子宫、肝脏、肾脏和下丘脑组织表达丰度较高.实时荧光定量PCR结果显示,同一绵羊品种发情期子宫、卵巢和松果体PGRMC1 mRNA水平均高于乏情期;不同绵羊品种间性腺轴组织基因表达水平存在一定差异,无论是发情期还是乏情期,多浪羊子宫、卵巢和松果体中PGRMC1 mRNA水平均高于同期的中国美利奴羊.本研究结果表明,PGRM C1在维持绵羊子宫与卵巢机能、调节激素分泌和发情行为等方面可能发挥重要作用.为进一步了解PGRMC1的生物学功能提供一定的理论依据.     

CDK1和CyclinB1在不同月龄绵羊睾丸中的表达与定位

哺乳动物精母细胞减数分裂至成熟受蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinase,CDK1)和细胞周期蛋白B(CyclinB1)形成的复合物细胞促分裂因子(maturation promoting factor,MPF)控制.本实验选取0、2、6、12和24月龄绵羊(Ovis aires)睾丸组织,探究了不同月龄绵羊睾丸中CDK1和CyclinB1表达与定位情况.通过qRT-PCR方法检测了CDK1和CyclinB1在不同月龄绵羊睾丸中mRNA表达情况,并利用免疫组织化学染色技术对睾丸组织中CDK1和CyclinB1蛋白定位.结果表明,绵羊睾丸中CDK1和CyclinB1 mRNA表达量随月龄的增加呈现先下降后上升的趋势.CDK1和CyclinB1蛋白在细胞中主要定位于精原细胞、初级精母细胞和次级精母细胞.各发育期CDK1蛋白表达量均低于CyclinB1蛋白的表达量,其中CDK1蛋白在整个细胞周期中表达量极少且相对稳定,CyclinB1蛋白在各发育期表达量不同.说明CDK1和CyclinB1 mRNA和蛋白质在不同月龄绵羊睾丸中的表达量存在一定差异,可能对绵羊睾丸发育有一定的调节作用.     

鹅脂联素基因的克隆、序列分析及组织表达

根据GenBank发表的鸡和鸭等物种的脂联素基因序列的同源保守区域,设计了3对特异性引物,以鹅(Anser domeatica)血液基因组DNA为模板,经扩增、测序及拼接得到了部分DNA序列,全长1062bp,包含2个外显子和1个内含子(GenBank Accession No.EU370686)。该基因编码区长738bp,编码245个氨基酸,编码区核苷酸序列及所编码氨基酸序列与鸭的同源性最高,分别为94.85%和95.51%,与鸡的同源性次之,而与哺乳类的同源性较低。蛋白预测的分子量和等电点分别为26603.3D和5.19,与鸡、鸭、人及小鼠的脂联素蛋白相似。半定量PCR结果显示鹅脂联素基因在骨骼肌、脂肪、心脏和肌胃中高度表达,在小肠、腺胃、肾和肺中中度表达,而在肝脏、脾、卵巢和间脑中低度表达。