砂藓(Racomitrium canescens)抗旱相关过氧化氢酶基因RcCAT的克隆与表达分析

在植物抵御和适应干旱胁迫的过程中,细胞中的氧化还原水平的调节十分重要,过氧化氢酶(catalase,CAT)是细胞氧化还原调控系统中的一个关键酶。砂藓(Racomitrium canescens)是一种具有强抗旱和旱后复水能力的藓类植物,其中能够响应干旱处理的基因和蛋白质可能与其抗旱特性功能相关。在本研究中,我们发现了一个在砂藓干旱处理转录组数据中呈上调表达的过氧化氢酶基因,将其命名为RcCAT,我们对这个基因的CDS序列进行了克隆和相关的生物信息学分析,并对砂藓复水和快速脱水过程中RcCAT具体的表达变化进行了检测。RcCAT的CDS全长1560 bp,编码含有519个氨基酸残基的多肽序列。对RcCAT蛋白质的氨基酸序列进行生物信息学预测,结果显示RcCAT相对分子质量为58.6 kD,理论等电点为6.52,不含有跨膜结构和信号肽,具有过氧化氢酶的保守结构域,与其它苔藓植物中的一些过氧化氢酶序列同源性较高,属于不稳定的亲水性蛋白质。在砂藓的复水和快速脱水过程中,RcCAT的表达水平均呈现快速大幅度的变化趋势,具有表达变化峰值,说明该基因具有能够快速响应干旱胁迫的可能性。本研究为从基因表达水平研究过氧化氢酶生物学功能提供理论依据,为进一步挖掘砂藓抗旱机制提供基础资源。     

向日葵S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因克隆与分析

为了研究S-腺苷甲硫氨酸合成酶(S-adenosylmethionine synthetase,SAMS)在向日葵(He-lianthus annuus)抗旱和耐盐过程中的作用,先根据计算机辅助克隆结果设计引物,抽提盐胁迫向日葵叶片的总RNA,然后采用RT-PCR扩增技术克隆了向日葵的1个SAMS基因(命名为HaSAMS1),HaSAMS1基因的编码序列长1173bp,编码390个氨基酸残基。HaSAMS1没有跨膜结构域,没有信号肽,含有SAMS蛋白的特征序列。HaSAMS1与其他物种的SAMS具有较高的序列相似性,与茼蒿(Chrysanthemum coronarium)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)等高等植物SAMS的氨基酸序列一致性介于86.8%~96.9%。HaSAMS1基因的克隆为进一步研究向日葵抗旱和耐盐机理奠定了基础。     

甜菜NAC转录因子BvNAC46基因的克隆及植物表达载体的构建

以干旱处理的强抗旱甜菜品种HI0466为材料,通过RT-PCR技术克隆到一个甜菜NAC类转录因子基因的cDNA序列,命名为BvNAC46(GenBank登录号:XM_010689163.2)。序列分析表明,该基因序列全长1 047 bp,包含一个576 bp的开放阅读框(ORF),编码191个氨基酸,为稳定的疏水性蛋白,推测理论分子量为88.725 kD,亚细胞定位于细胞核中。含有一个NAM保守结构域,具有NAC转录因子的典型特征。将该基因的cDNA编码序列连接到植物表达载体pCAMBIA2301中,成功构建了甜菜BvNAC46基因的植物表达载体pCAMBIA2301-BvNAC,为进一步通过转基因技术研究该基因的功能提供参考。     

干旱胁迫下中国沙棘脯氨酸含量变化及其关键调控基因的表达模式

干旱胁迫严重影响植物的生长和产量,重度干旱胁迫会导致植物永久萎蔫.发掘中国沙棘的抗逆基因有助于提升植物抗旱性.脯氨酸是植物响应干旱胁迫的重要渗透调节物之一.为了探究中国沙棘中脯氨酸响应干旱胁迫的调节机制,本研究在干旱胁迫下,检测两年生中国沙棘扦插幼苗的叶片相对含水量和脯氨酸等5个抗旱相关生理指标;通过实时荧光定量PCR检测2个脯氨酸调控关键基因的表达量.结果 表明,干旱胁迫下的中国沙棘叶片相对含水量逐渐下降;叶绿素、可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸的含量呈上升趋势,且所有生理指标在复水后较处理前均下降;脯氨酸关键合成基因吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)基因在根、茎、叶中的相对表达量呈现先上升后下降的趋势,而调控脯氨酸分解的脯氨酸脱氢酶(ProDH)基因相对表达量迅速降低.本研究为揭示中国沙棘抗旱机理提供理论依据,同时为植物抗旱育种提供候选基因.     

砂藓抗旱相关基因磷脂酶D的克隆和表达分析

磷脂酶D是广泛存在于植物中的一种磷脂酶,在细胞结构组成和生理功能的变化中具有非常重要的作用。在本研究中,以在砂藓(Racomitrium canescens)转录组数据库中获得的一条与抗旱相关的磷脂酶D基因为基础,采用RT-PCR技术克隆得到该基因的全长CDS序列,命名为Rc PLD。生物信息学分析结果表明,Rc PLD基因c DNA全长1 420 bp,含有894 bp的开放阅读框,能够编码长度为297个氨基酸的多肽链。Rc PLD蛋白质的生物信息学分析结果表明,Rc PLD相对分子质量为33.192 k D,理论等电点p I为6.60,不含有跨膜结构,存在信号肽,具有磷脂酶D的保守结构域,属于不稳定的疏水性蛋白质。实时荧光定量PCR分析表明,在砂藓的复水过程和脱水处理条件下Rc PLD基因均有差异表达,说明该基因可能参与砂藓中响应干旱胁迫的某些生理代谢途径。本研究可为苔藓植物中抗旱机制的研究提供理论基础。     

苋菜AmPCS基因的克隆及表达载体构建

合成植物络合素(PCs)是高等植物减轻重金属毒害的重要机制。通过对镉超积累苋菜品种天星米植物络合素合成酶基因(PCS)的克隆及表达载体构建,旨在为植物修复镉污染土壤奠定基础。依据同源克隆原理,通过RT-PCR和RACE方法克隆苋菜PCS基因。序列分析表明:苋菜PCS基因cDNA全长1 770 bp,包含完整的阅读框,编码485个氨基酸;苋菜PCs合成酶与拟南芥、遏蓝菜、芥菜及油菜PCs合成酶相似性为91.96%～95.67%,其氨基酸序列N端有1个Pfam:Phytochelatin结构域(功能为催化合成植物络合素)、C端有1个Pfam:Phytochelatin_C结构域(功能为重金属离子感应器)。因此,推断苋菜PCS基因编码蛋白是PCS-like家族的新成员,具有催化合成植物络合素的功能,将它在GenBank注册,序列号为:JN979370,命名为AmPCS。在AmPCS基因的编码区加入BamH I和Sac I酶切位点,双酶切植物表达载体pBI-121和带有酶切位点的PCR产物,成功获得苋菜PCS基因正义表达载体pBI-PCS。     

甘薯S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因克隆与表达

从实验室建立的甘薯冷胁迫抑制消减文库中分离出一cDNA片段,经NCBI比对后发现该片段与其它植物的S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因具有90%的同源性,根据相关物种S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因cDNA序列设计引物,以甘薯总RNA为模板,经RT-PCR扩增首次获得全长1182bp的甘薯SAMS完全编码区,NCBI比对分析结果表明：该片段与不同种属植物sams基因的编码区序列的核苷酸相似性达85.48%, 所推导的氨基酸序列相似性达93.6%。根据核苷酸序列和氨基酸序列分别构建了SAMS系统进化树,从分子水平阐明了植物种属间的亲缘进化关系,为其种质资源利用提供理论依据。利用该序列与原核表达载体pET32a连接构建融合表达载体pET-SAMS,酶切鉴定后转入大肠杆菌BL21,在不同温度下诱导3h后均表达出一63KDa大小融合蛋白。     

黄野螟谷胱甘肽硫转移酶Sigma 1基因的鉴定及表达模式

为探究谷胱甘肽硫转移酶Sigma家族中Sigma 1基因的分子特征,从黄野螟成虫转录组文库中鉴定获得了GST Sigma 1基因全长c DNA,命名为Hv GSTs1(Gen Bank:MF521977)。并对该基因进行生物信息学分析,并使用RTq PCR对Hv GSTs1在其不同发育阶段、幼虫不同部位及成虫不同部位的相对表达量进行检测。结果表明,该基因全长1 054 bp,共编码204个氨基酸。序列分析显示,Hv GSTs1蛋白氨基酸序列含有N端结构域GST_N_Sigma_like和C端结构域GST_C_Sigma_like等2个结构域,Hv GSTs1的氨基酸序列与二化螟同源性最高,为76%。系统发育树分析显示,黄野螟与二化螟处于同一分支。用RT-q PCR分析了Hv GSTs1基因的相对表达量,结果显示,Hv GSTs1在蛹中的表达量高于其他发育阶段;Hv GSTs1在幼虫脂肪体中表达量最高,在中肠表达量最低;Hv GSTs1在成虫中腹部和胸部表达量最高,足部表达量最低,各部位均有表达,且有显著差异(P0.05)。研究结果为以后深入探讨黄野螟Sigma家族GST的生理功能奠定了基础。     

陆地棉GhCYP1基因的分离及其表达分析

应用SSH-PCR技术,在筛选到抗旱相关基因的EST序列基础上,采用RACE技术,分离克隆到全长为801bp,含编码序列(CDS)为522 bp的棉花抗旱相关基因GhCYP1.氨基酸序列比对发现,该基因与拟南芥、水稻、人等的亲环蛋白基因高度同源,都具有由11个连续氨基酸所组成的单结构域亲环蛋白典型结构,且在保守区都具有...     

香蕉MaMYBR1基因的克隆和表达分析

为研究MaMYBR1基因参与香蕉响应的胁迫过程,本研究利用RT-PCR获得香蕉MaMYBR1基因的全长,包含786个核苷酸,编码261个氨基酸。将该基因核苷酸序列在NCBI进行BLASTn比对,发现该基因与大麦(AK359880)、花药野生稻(XM_015836768.1)和小麦(AB252147.1)的基因序列具有较高的相似度,相似度分别为80.06%、79.19%和79.19%。蛋白结构域分析发现该基因编码的蛋白质序列包含有一个MYB结构域和一个SANT结构域。系统进化树分析表明,该蛋白与海枣(XP_008785342.1)和油棕(XP_010920477.1)等植物亲缘关系较近。通过实时荧光定量PCR分析表明MaMYBR1以上调表达模式参与香蕉响应低温、干旱和盐等胁迫过程,其中在低温胁迫下MaMYBR1基因的相对表达量变化最大;MaMYBR1基因在接种枯萎病菌的抗病品种中显著上调表达,而在感病品种中显著下调表达,MaMYBR1基因可能参与香蕉抗枯萎病过程。因此,本研究将为后续香蕉遗传改良提供有价值的研究信息。     

黍稷芽、苗期抗旱性评价及抗旱资源鉴定

为了全面了解中国现存黍稷种质资源的抗旱性,研究黍稷在PEG6000模拟干旱胁迫下的抗旱表现,挖掘优异抗旱种质并筛选抗旱鉴定指标,本研究以前期构建的包含230份资源的黍稷微核心种质为试验对象,开展室内PEG6000模拟干旱胁迫处理下的芽、苗期抗旱性研究。通过对芽期和苗期抗旱性指标的测定发现:干旱胁迫下,芽期和苗期各指标较对照组均有下降趋势;芽期指标变异系数较苗期偏大,苗期根鲜重变异系数最大,根干重、苗鲜重、苗干重其次(变化范围在0.35~0.50之间)。相关性分析显示多数指标间相关性都达到了显著或极显著水平,其中相对根鲜重与相对根干重的相关性最高,而相对叶绿素含量与相对根长、相对苗长、相对根鲜重及相对苗干重的相关性均较低。采用平均值-标准差逐级分级法和分层聚类分析综合鉴定参试黍稷芽期和苗期抗旱性,发现芽期极强抗旱、强抗旱材料分别为3份和10份,苗期极强抗旱、强抗旱材料分别为24份和23份;其中紫秆黍(00003289)、乌克兰黍(00006438)和白糜子(00000101)三个品种在芽期和苗期均有很好的抗旱性,可作为后续全生育期抗旱研究和抗旱品种选育的优良资源。对芽期及苗期各抗旱鉴定指标进行相关性分析,结果表明芽期与苗期抗旱性没有显著相关性;主成分分析表明,相对苗长、相对苗鲜重以及相对叶绿素含量可作为评价黍稷苗期抗旱性鉴定的主要指标。     

水稻ABA生物合成基因OsNCED3响应干旱胁迫

9-顺-环氧类胡萝卜素双加氧酶(NCED)是植物内源脱落酸(ABA)生物合成的限速酶,由NCED基因家族编码,水稻中响应干旱胁迫并以此调节ABA水平的OsNCED基因尚见未报道。本研究发现在水稻已报道的5个OsNCED基因中,OsNCED3的表达受干旱胁迫诱导,复水处理后其表达快速下调,其表达模式与此过程中内源ABA含量变化趋势一致。OsNCED3的RNAi转基因植株表现为干旱敏感,且生物量下降;而过量表达OsNCED3基因增加了水稻的抗旱性。干旱胁迫下过量表达OsNCED3的转基因株系有较高的ABA水平,同时其抗氧化酶超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性,以及逆境响应基因脱水素蛋白(Dehydrin)和胚胎发育晚期丰富蛋白(LEA)转录表达均高于野生型。下调表达OsNCED3的转基因株系则呈现相反的变化趋势。因此,OsNCED3是水稻干旱胁迫响应基因,调节了干旱环境下ABA水平和抗逆性。     

谷子F-box家族基因的鉴定、分类及干旱响应

蛋白参与细胞周期调控、细胞凋亡及信号转导等多种生命活动对维持植物正常生长发育和介导非生阿物胁迫响应等过程发挥重要作用。谷子具有显著的耐旱耐瘠薄等特性本研究根据谷子转录组分析结果从个家族成员中鉴定出个在干旱胁迫下表达量上调的基因根据序列相似性将其分为类同一类基因具有相似的内含子外显子结构染色体定位分析发现这些基因分别分布在谷子的条染色体上其中第条染色体上含基因最多有个。结构域分析结果表明个蛋白均含保守的结构域而端含、、、、和等结构域。启动子元件分析表明谷子个基因均含逆境应答元件其中和元件的数量最多个说明这些基因对干旱应答反应可能主要受、转录因子调控。转录组分析结果表明基因对干旱胁迫的响应远远高于其他成员对干旱、高盐、、和都有响应亚细胞定位结果显示蛋白定位在细胞核中。本研究为进一步深入了解基因的功能提供了依据。F-box蛋白参与细胞周期调控、细胞凋亡及信号转导等多种生命活动, 对维持植物正常生长发育a和介导非生阿物胁迫响应等过程发挥重要作用。谷子具有显著的耐旱耐瘠薄等特性, 本研究根据谷子转录组分析结果, 从525个F-box家族成员中鉴定出19个在干旱胁迫下表达量上调的F-box基因; 根据序列相似性将其分为6类, 同一类基因具有相似的内含子-外显子结构; 染色体定位分析发现, 这些基因分别分布在谷子的8条染色体上, 其中, 第2条染色体上含F-box基因最多, 有6个。结构域分析结果表明, 19个F-box蛋白均含保守的F-box结构域, 而C端含FBD、WD40、FBA、ZnF、Kelch和LRR等结构域。启动子元件分析表明, 谷子19个F-box基因均含逆境应答元件, 其中, MYB和MYC元件的数量最多(9~78个), 说明这些基因对干旱应答反应可能主要受MYB、MYC转录因子调控。转录组分析结果表明, SiF-box18基因对干旱胁迫的响应远远高于其他F-box成员, 对干旱、高盐、ABA、SA和JA都有响应; 亚细胞定位结果显示, SiF-box18蛋白定位在细胞核中。本研究为进一步深入了解SiF-box18基因的功能提供了依据。     

野生大豆S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的克隆及功能分析

干旱、盐碱和低温等非生物逆境是危害作物诸多因素中最为严重的自然灾害, 它可以使作物减产, 甚至死亡。目前通过生物技术手段获得可利用的抗性基因是提高植物抗性的重要途径。东北野生大豆具有丰富的基因资源, 是基因克隆的理想材料。从低温(4℃)、干旱(30%PEG)及盐胁迫(200 mmol L^-1NaCl)处理的东北野生大豆幼苗叶片中提取总RNA, 经反转录合成cDNA第一链, 并以此链为模板, 从已构建的盐胁迫全长cDNA文库和东北野生大豆盐胁迫EST数据库中筛选出与渗透胁迫直接相关的EST序列, 根据该序列设计一对PCR引物扩增S-腺苷甲硫氨酸(SAM)合成酶基因的全长序列, 经Blast比较分析, 确定所获得的SAMS基因全长序列。构建以pBI121为基础的CaMV35S启动子调控的植物表达载体; 利用农杆菌介导法将其导入烟草, 获得了180株转基因烟草, 并进行了低温、干旱和盐胁迫处理, 通过测定在不同胁迫处理下的生理指标, 分析了基因的功能。野生大豆的SAMS基因在烟草中的超量表达提高了转基因烟草的抗低温、干旱和耐盐能力。     

水分胁迫对糜子植株苗期生长和光合特性的影响

选取耐旱性不同的糜子品种陇糜4号(强抗旱)、晋黍7号(旱敏感)和5283黄(中等抗旱),采用盆栽控水试验,调查不同水分处理对糜子苗期主要性状和光合参数的影响。结果表明：(1)水分胁迫下各品种的株高、叶面积、根重、叶绿素含量、根系活力均呈下降趋势,且陇糜4号的降幅小于5283黄和晋黍7号。(2)水分胁迫下,3个品种的固定荧光值(F_o)和非光化学猝灭系数值(q_N)均显著增加,在重度胁迫后,陇糜4号、5283黄和晋黍7号的F_o值分别比对照增加24.6%﹑34%和40.8%,q_N值分别增加0.956、1.083和2.183,且表现为旱敏感品种晋黍7号的增加幅度大于强抗旱品种陇糜4号;各品种的可变荧光(F_v)、最大荧光(F_m)、最大光化学量子产量(F_v/F_m)、PSII的潜在活性(F_v/F_o)、光化学猝灭系数(q_P)值均因水分胁迫而降低。在中度和重度胁迫时,与正常灌水相比差异达显著水平,降幅以晋黍7号>5283黄>陇糜4号。(3)各品种的净光合速率、蒸腾速率、气孔导度及胞间CO₂浓度均因水分胁迫而下降,强抗旱品种陇糜4号各值的变化幅度均小于中等抗旱品种5283黄和旱敏感品种晋黍7号,表明陇糜4号的光合参数受水分胁迫的影响最小,较高的电子传递速率和较强的光能转化能力是陇糜4号适应干旱环境的重要生理特性。(4)水分胁迫导致糜子叶片对强光的敏感性增加,干旱和光抑制对光系统II造成的叠加伤害随干旱加重和品种抗旱性减弱而加剧,因此,对强光下的糜子幼苗应及时补水,以避免干旱和高光强的叠加伤害。     

6种不同除草剂对糜子田杂草的防除效果

为筛选防除糜子田杂草的高效除草剂,本试验选取了6种除草剂对防除糜子田杂草进行研究,结果表明,在糜子4~5叶期,选用56%二甲四氯钠盐可湿性粉剂和24%辛酰溴苯腈,在剂量分别是756g/hm ²和375g/hm ²时防除糜子田杂草的效果最佳,株防效都达到80%以上。     

谷子角质合成基因对干旱胁迫的响应

干旱是影响谷子产量的重要因素,以抗旱性强的谷子品种赤谷16（M79）及其母本赤谷10号（E1）,父本承谷8号（H1）作为研究材料,采用苗期自然干旱处理并设置对照,在干旱处理第6天（土壤水分含量约为20%）时取叶片进行转录组测序。用ExPASY分析基因的理化性质,GSDS 2.0分析基因结构,MAGA 7.0构建系统进化树,TMHMM Server v. 2.0预测跨膜结构域,SOPMA预测蛋白的二级结构。结果显示8个谷子角质合成基因编码的蛋白均为亲水性蛋白,且均为酸性;经干旱胁迫处理之后,M79、E1和H1中8个基因的表达变化趋势有所不同,Seita.8G128800和Seita.7G197000表达明显上调;8个基因中有4个基因与玉米的基因具有同源性,有3个基因与水稻的基因具有同源性,编码蛋白部分有跨膜结构域。角质合成基因在谷子响应干旱胁迫过程中发挥作用,其调控机理较为复杂。本研究的结果为进一步探讨谷子角质与抗旱的关系提供了一定理论依据。     

含CBS结构域的小麦TaCDCP1基因的克隆及其表达分析

利用电子克隆和RT-PCR技术,在本实验室前期构建的非亲和互作的SSH文库基础上,从条锈菌侵染的小麦水原11叶片中首次分离出一个含CBS结构域蛋白的基因,暂命名为TaCDCP1(Triticum aestivum CBS domain containing protein 1)。TaCDCP1包含一个完整的654 bp的开放阅读框,编码217个氨基酸。推测该基因拟编码的蛋白具有2个CBS保守结构域,不含跨膜区且无信号肽,定位在叶绿体基质内;经过同源比对,小麦TaCDCP1氨基酸序列与大麦、水稻和玉米等的同源序列的相似性较高;该基因表达量在小麦叶中显著高于在根和茎中;在小麦与条锈菌的非亲和、亲和组合中,TaCDCP1基因均受到条锈菌诱导,分别在接种后18 h和96 h达到表达高峰,非亲和组合表达量在侵染前期(接种后18~48 h)高于亲和组合,而在侵染后期(接种后96~120 h)低于亲和组合;外源植物激素脱落酸诱导该基因上调表达,苄基腺嘌呤,乙烯,赤霉素,茉莉酸甲酯和水杨酸处理后其表达量在不同程度上受到抑制;TaCDCP1在低温和干旱条件下表达量上升,在机械伤害和高盐处理下表达量无明显差异。表明TaCDCP1可能通过脱落酸等信号途径参与小麦对条锈菌的防御反应,同时参与低温和干旱环境下的信号转导途径。这些结果对于明确CBS结构域的功能以及CBS结构域蛋白尤其是TaCDCP1在小麦与条锈菌互作中的作用奠定了基础。