棉花种子特异性启动子的克隆及序列分析

启动子是基因表达的重要顺式调控元件,在基因工程中,种子特异性启动子可以调控外源基因在种子中特异表达,提高表达效率,增强转基因的效果。本试验根据棉花LEA蛋白D34基因序列设计引物,以海岛棉基因组DNA为模板,通过touch down PCR技术,获得D34基因的种子特异性启动子片段。测序结果表明该片段长1 384 bp,与已发表的D34基因序列相似度为94.87%。该片段除了含有启动子的基本元件TATA框、CAAT框外,还含有种子特异性启动子元件E-box、G-box、B-box、AACA基序等。此外,对其顺式元件做了生物学功能分析。     

牛MyoG基因启动子的克隆与序列分析

根据G enB ank中已公布的人、猪和小鼠的MyoG基因的5′侧翼和部分第一外显子序列设计PCR引物,用touch-dow n PCR技术扩增了牛MyoG基因的启动子序列,构建了重组克隆载体pGEM-T-MyoG,并通过PCR扩增、限制性酶切对阳性克隆进行了鉴定、测序及生物信息学分析。结果表明,牛MyoG基因的启动子序列(G en-bank中注册号为AY 882581)长度为672 bp,其与猪、人和小鼠相应序列的同源性分别为94%,91%和88%,且其在不同物种之间具有一定的保守性。牛MyoG基因启动子的克隆与序列分析为进一步研究牛MyoG基因的表达调控奠定了基础。     

黑木耳YBS-3菌株ras启动子的克隆与分析

[目的]从黑木耳（Auricuraliaauricular）基因组中克隆内源Ⅻ启动子,为黑木耳利用基因工程培育优良品种提供启动子元件材料。[方法]利用PCR技术,以黑木耳菌株YBS一3基因组DNA为模版,克隆得到4条／ras启动子片段。采用启动子序列分析软件Place、Promoterprediction和TFSEARCHver．1．3对其进行序列结构分析。[结果]4条启动子片段均含有核心启动子序列,除典型的基本作用元件TATAbox和CAATbox外,还有许多其他重要作用元件如GATABOX、GCGCBOX和CCAATBOXl等,同时每条片段中均至少具有1个转录起始位点,且检测到HSF、AP-1、GCN4等多个转录因子结合位点。[结论]4条目的序列在理论上具有较强的启动子活性功能。     

胡萝卜sⅡ基因启动子克隆及序列分析

克隆胡萝卜直根特异性表达的液泡转化酶Ⅱ型同工酶(sⅡ)基因启动子序列,为实现外源基因在胡萝卜直根特异性表达做准备。从天红五寸参胡萝卜叶片中提取总DNA,采用PCR扩增方法获得sⅡ基因启动子序列,然后结合5'RACE实验方法和生物信息预测方法对sⅡ基因启动子进行序列特征分析。结果表明:从胡萝卜基因组DNA中PCR扩增得到预期大小的启动子片段,序列分析表明该启动子序列与已发表的序列具有99.6%的同源性;试验确定了该启动子的转录起始位点位于翻译起始位点上游26bp处的“A”;生物信息学预测该启动子的核心序列及上游增强子序列、抑制子序列、根特异性序列及受病原菌、损伤、干旱、ABA激素调控序列等顺式作用元件。成功克隆并序列分析了胡萝卜直根特异性表达的sⅡ基因启动子,为该启动子在植物基因工程中的应用奠定基础。     

小鼠MCK基因启动子的克隆及其活性初步分析

本研究克隆了小鼠MCK基因5'侧翼区以及核心启动子区,并分析和研究了其调控活性。首先以小鼠尾部肌肉基因组DNA为模版克隆了小鼠MCK基因5'侧翼区序列,回收纯化,连接pEASY-T3 Cloning载体,测序,分析了其增强子与核心启动子序列。然后将核心启动子序列亚克隆到无启动子的荧光蛋白报告载体pGL3-Venus中,转染小鼠成肌细胞C2C12,观察其在荧光显微镜下的表达情况。结果表明,小鼠MCK基因-1354～+1 bp核心启动子序列能调控Venus荧光蛋白在C2C12细胞内表达,证实MCK启动子核心序列具有组织特异性调控能力。     

碧冬茄花特异表达基因启动子PchsA的克隆与序列分析

根据Ingrid M．报道的碧冬茄花特异表达基因CHSA启动子的序列设计并合成一对特异引物，以碧冬茄总DNA为模板，通过PCR扩增出约370bp大小的DNA片段，回收后克隆到pUCm—T质粒载体上，经转化、筛选确定重组子，酶切鉴定后送上海生工生物工程公司测序，得到片段长度为370bp．采用DSgene分析软件进行序列分析发现其基本具有启动子的所有保守序列，TATAbox，CCAATbox，Anther box，G—box，TACPyAT box，box1，box2，Capsite等，且经InternetBLAST程序和DSgene分析软件进行同源性对比和序列分析，显示序列与已报道序列同源性为96％，登陆GenBank，ID号为AY360358。     

葡萄LEAFY基因启动子的克隆与序列分析

为探明葡萄LEAFY基因的表达调控规律,应用PCR技术从藤稔葡萄中克隆了1个长1 833 bp的DNA片段,该序列含有2个内含子区域,编码402个氨基酸,与葡萄LEAFY同源基因VFL有99%的同源性.应用基因组步移法克隆了LEAFY基因的5′侧翼序列925 bp,拼接后的LEAFY基因及启动子序列共2 692 bp(GenBank登录号EF222286).用PLACE、PlantCARE在线启动子预测工具分析表明:该序列含有启动子的特定结构,如TATA-box,CAAT-box等,另外含有一些顺式作用元件如MYB结合位点、ABA响应元件、光响应元件和一些其他的调控序列,说明葡萄LEAFY基因的表达可能受MYB、ABA和光等的调控.用FootPrinter在线工具对葡萄与拟南芥等其他4种植物的LEAFY同源基因启动子进行比较,发现不同植物的启动子既有保守性,又有多样性,转录因子结合位点的分布相似,但也有区别,暗示了LEAFY基因表达调控的精确性或多样性.     

葡萄LEAFY基因启动子的克隆与序列分析

为探明葡萄LEAFY基因的表达调控规律,应用PCR技术从藤稔葡萄中克隆了1个长1 833 bp的DNA片段,该序列含有2个内含子区域,编码402个氨基酸,与葡萄LEAFY同源基因VFL有99%的同源性.应用基因组步移法克隆了LEAFY基因的5′侧翼序列925 bp,拼接后的LEAFY基因及启动子序列共2 692 bp(GenBank登录号EF222286).用PLACE、PlantCARE在线启动子预测工具分析表明:该序列含有启动子的特定结构,如TATA-box,CAAT-box等,另外含有一些顺式作用元件如MYB结合位点、ABA响应元件、光响应元件和一些其他的调控序列,说明葡萄LEAFY基因的表达可能受MYB、ABA和光等的调控.用FootPrinter在线工具对葡萄与拟南芥等其他4种植物的LEAFY同源基因启动子进行比较,发现不同植物的启动子既有保守性,又有多样性,转录因子结合位点的分布相似,但也有区别,暗示了LEAFY基因表达调控的精确性或多样性.     

植物凝集素SMLII 基因启动子的克隆及序列分析

根据已克隆的丹参植物凝集素SMLII基因cDNA序列,利用染色体步移技术克隆出SMLII 启动子区序列,并进行生物信息学预测分析该基因的功能,结果得到了该基因上游1023 bp的启动子序列（GenBank AccessionNo: KF193867）。分析表明,在该序列中不但含有真核生物典型的核心启动子区TATA-box、CAAT-box,而且含有一些特有的上游启动子元件ABRE、ARE、ASF1MOTIFCAMV、HSE、IBOXCORE、WBOXATNPR1等重要的顺式调控元件及一些光反应相关元件。     

甘肃马鹿肌细胞生成素（MyoG）基因启动子区序列克隆与分析

MyoC基因在肌肉发生过程中具有中心调节作用。根据GeneBank中已发表的猪、人、小鼠和牛的MyoG基因5’侧翼和部分第1外显子序列设计PCR引物,采用Touch—DownPCR技术扩增了甘肃马鹿MyoG基因的启动子区序列,构建了重组克隆载体pMD18-T—MyoG,并通过PCR扩增、限制性酶切对阳性克隆进行了鉴定、测序及生物信息学分析。结果表明,甘肃马鹿MyoG基因启动子区序列长685bp,其与猪、人和小鼠的同源序列相似性分别为88．1％、84．9％和82．6％,且不同物种间保守性较强。本研究为进一步探讨甘肃马鹿MyoG基因的表达与调控机制奠定了基础。     

杨树木质部特异启动子的分离与功能分析

从三倍体毛白杨-93(Populus tomentosaCarr.)中分离得到了MDCesAP这一木质部纤维素合酶基因启动子。通过对其进行序列分析,发现A/T含量达63%,有TATA box、polyA等启动子调控元件。与PTCesAP比较,同源性较低。用MDCesAP分别替换PCAMB IA1302及PB I121中的CaMV 35S启动子,转入植物后检测目的片段的启动子功能,结果表明MDCesAP为木质部特异性启动子。     

鸡腿菇gpd启动子的克隆及序列分析

以鸡腿168菌株为材料,采用Promoter Signal Scan软件对扩增序列进行启动子分析,Blastn同源性分析近缘真菌gpd启动子序列,并用MEGA4软件构建系统发育树.结果表明,该序列具有TAT-box和CAAT-box特征,且与GenBank中多个真菌gpd启动子序列同源性较高,基本证实该序列为鸡腿168gpd启动子,可应用于鸡腿菇外源基因表达研究.     

黑木耳YBS-3菌株ras启动子的克隆与分析（摘要）

[目的]从黑木耳基因组中克隆内源ras启动子,为黑木耳利用基因工程培育优良品种提供启动子元件材料。[方法]利用PCR技术,以黑木耳菌株YBS-3基因组DNA为模版,克隆得到4条ras启动子片段。采用启动子序列分析软件Place、Promoter prediction和TFSEARCH ver1.3对其进行序列结构分析。[结果]4条启动子片段均含有核心启动子序列,除典型的基本作用元件TATA box和CAATbox外,还有许多其他重要作用元件如GATABOX、GCGC BOX和CCAATBOX1等,同时每条片段中均具有至少一个转录起始位点,且检测到HSF、AP-1、GCN4等多个转录因子结合位点。     

猪脂联素基因启动子克隆及多态性研究

[目的]为脂联素基因作为脂肪沉积候选基因的研究提供依据。[方法]通过猪BAC文库筛选及primer—walking的测序方法获得脂联素基因的启动子序列,采用PCR—RFLP技术对蓝塘猪、大花白猪、大白猪、长白猪和杜洛克猪5个品种共290头猪的脂联素基因启动子区的多态性进行了分析。[结果l脂联素基因的5’侧翼区-1010bp（G／A）的SNP位点,本地猪种中GG基N型频率明显高于外来猪种;-394bp（T／C）的SNP位点,本地猪种基因型分布较为丰富,而在外来猪种申却没有检测到CC基因型,且外来猪中T等位基因频率较高。[结论]脂联素基因上游-1010bp（G／A）的SNP位点突变可能会引起该基因转录水平的改变,而-394bp（T／C）的SNP位点与基因转录水平及与脂肪沉积可能无关．     

PRRSV GP5与GP4蛋白重组腺病毒的构建及其免疫特性研究

[目的]实现PRRSV GP5与GP4蛋白在同一载体中表达各自编码的蛋白,发挥GP5蛋白在体液免疫中的优势和GP4蛋白在信号转导中的作用。[方法]利用RT-PCR扩增出GP5与GP4基因,克隆到pIRESneo载体的多克隆酶切位点及新霉素磷酸转移酶位点中,用XhoⅠ和NruⅠ双酶切含GP5和GP4基因的表达盒,将此表达盒克隆到犬2型腺病毒E3区缺失性载体pPolyⅡ-CAV-2-△E3中,以AsⅠc和PmeⅠ双酶切进行鉴定。[结果]将构建好的重组腺病毒免疫小鼠,可以诱导产生较强的体液免疫应答（ELISA抗体和中和抗体）。[结论]该重组腺病毒具有较好的免疫原性,可为研制有效的亚单位疫苗奠定基础。