互花米草中NHX基因片段的克隆与序列分析

利用同源克隆方法从盐生植物互花米草（Spartina alterniflora）中分离并克隆出Na~＋/H~＋逆向转运蛋白基因的1段cDNA片段,长度为951 bp,推测编码317个氨基酸。氨基酸序列的对位排列分析显示,该cDNA片段对应的氨基酸序列与已知的植物液泡膜型Na~＋/H~＋逆向转运蛋白的氨基酸序列有较高的相似性,且与禾本科植物中的同源物之间的关系更为密切。     

花花柴耐盐相关基因NHX的克隆与分析

植物NHX属于Na＋/H＋逆向转运蛋白NHE/NHX亚家族的成员,为阳离子逆向转运蛋白家族的一个亚类,具有调节细胞内pH值和Na＋的浓度及维持细胞内离子稳态等多种功能。为进一步开发新疆盐生植物耐盐相关基因资源,本研究以盐生植物花花柴为材料,利用分子克隆技术,从总RNA中克隆编码Na＋/H＋逆向转运蛋白基因。依测序结果判断已从花花柴cD-NA中克隆到1253 bp的NHX基因片段,并对该序列进行数据库搜索和对序列比对分析。结果显示一致性达到68.77%,可以用于构建植物表达载体进行相应的功能鉴定。     

甜橙NHX基因家族的鉴定及功能分析

Na+/H+逆向转运(Na+/H+exchange or antiporter,NHX)蛋白家族的氨基酸序列具有Na+/H+exchange蛋白结构域,在植物生长发育和非生物胁迫应答中发挥重要作用.为探究甜橙(Citrus sinensis)NHX基因家族的生物学特性,本研究从甜橙基因组中鉴定出6个NHX基因家族成员,...     

珠美海棠Mz_2NHX1基因的克隆和序列分析

以珠美海棠幼苗根系的c DNA为模板,根据珠美海棠NHX1(GQ503257)的保守序列设计引物,通过RT-PCR扩增得到目的基因全长1 865 bp,包含1个1 635 bp的开放阅读框,编码544个氨基酸,其核苷酸序列与苹果(GU338395)、玫瑰(KC188664)、杨树(ACU01853)的核苷酸序列同源性分别是95%、93%、91%。其对应的氨基酸序列与拟南芥(AAF21755)、玫瑰(BAD93487.1)和大叶补血草(BAB11940)液泡型Na+/H+逆向转运蛋白的氨基酸序列的同源性分别是79%、87%、79%,说明该蛋白是一种定位于液泡膜的Na+/H+逆向转运蛋白,该基因属于液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因。它编码的蛋白质分子量为60.5 ku,理论等电点(p I)为8.85,二级结构主要由α-螺旋、β-折叠和不规则卷曲构成,其N-末端具有12个跨膜疏水片段,C-末端具有亲水的长链尾巴,在跨膜片段内含有氨基酸保守序列85-LFFIYLLPPI-94,是Na+/H+逆向转运蛋白抑制剂氨氯吡嗪咪的结合位点。     

大叶补血草Na+/H+逆向转运蛋白基因NHX1核心片段的克隆及序列分析

根据GenBank中已登陆植物的Na+/H+逆向转运蛋白基因的保守序列设计简并引物,以盐生植物大叶补血草总RNA为模板,通过RT-PCR方法得到长为983 bp的片段,将其克隆到pGM-T载体上,经PCR和酶切鉴定筛选得到阳性克隆,并进行测序.通过DNAMAN软件对该序列进行同源性比对,结果表明,本研究所克隆的基因片段编码的氨基酸序列与拟南芥、小麦、滨藜、番杏、冰叶日中花的Na+/H+逆向转运蛋白同源性很高,其同源性分别为80.06%、72.00%、82.07%、82.37%和82.37%,表明该序列确属Na+/H+逆转运蛋白基因的部分片段,同时也说明Na+/H+逆向转运蛋白基因在植物中高度保守.     

甘蓝型油菜Na~+/H~+逆向转运蛋白基因BnNHX2的电子克隆与序列分析

盐胁迫是造成油菜产量下降的重要环境因子之一。Na^＋／H^＋逆向转运蛋白（Na^＋／H^＋ antiporter,NHX）基因是目前世界植物耐盐性研究领域中最热门的基因,油菜NHX基因的克隆对提高油菜耐盐性的转基因育种意义重大。本研究利用电子克隆的方法,获得1个新的甘蓝型油菜NHX基因BnNHX2的全长cDNA,含有一个长为1629bp的开放阅读框架,编码542个氨基酸,分子质量约59．9ku。生物信息学分析表明,BnNHX2蛋白属于跨膜蛋白,有12个跨膜区,是植物NHX超家族中的一员。通过同源比对和进化分析发现,BnNHX2基因与盐生植物盐芥ThNHXI基因高度同源,表明BnNHX2可能是油菜抵御盐胁迫的关键基因。     

木榄Na~+/H~+逆向转运蛋白基因的克隆

根据北滨藜、胡杨、毛白杨、番杏、盐爪爪、盐角草等已发表的逆向转运蛋白的保守区设计简并引物,通过RT-PCR和RACE技术,从木榄(Bruguiera gymnorrhiza)中克隆Na+/H+逆转运蛋白长度为2130bp的cDNA全长序列,开放阅读框1626bp,编码541个氨基酸和一个终止子,含10个跨膜区。蛋白序列同源分析表明它与蓖麻、胡杨、葡萄、百脉根等植物的液泡膜型Na+/H+逆向转运蛋白序列具有很高的同源性(80%以上),表明该序列确属Na+/H+逆转运蛋白家族的基因,在细胞中起到Na+区隔化作用。     

海滨锦葵耐盐基因KvSOS1的克隆与表达载体构建

为了克隆盐生植物海滨锦葵耐盐基因Kv SOS1并构建其表达载体,采用RT-PCR和RACE方法从海滨锦葵中克隆了质膜Na+/H+转运蛋白基因Kv SOS1(Gen Bank登录号KJ577576)的全长c DNA序列,长度为3 850 bp,其中开放阅读框长度为3 444 bp。Kv SOS1基因编码1个由1 147个氨基酸残基组成的蛋白,分子量为127.56 ku,理论等电点p I为6.18。疏水性分析结果表明,该蛋白N-末端具有高度疏水性,并含有11个跨膜区,C-末端为1个长约700个氨基酸残基的亲水性尾巴位于细胞质中。Kv SOS1基因编码蛋白与雷蒙德氏棉、可可和陆地棉SOS1蛋白的氨基酸序列同源性很高,分别为86%、82%和82%。系统进化树分析显示Kv SOS1基因编码蛋白与质膜Na+/H+转运蛋白、液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白(NHX)属于不同分支。同时将Kv SOS1基因构建入植物表达载体p BI121中,并成功转入农杆菌LBA4404中。     

盐芥ThNHX1基因的克隆及序列分析

为研究盐生植物的耐盐机理,根据拟南芥的序列设计引物,通过RT-PCR及RACE的方法从盐生植物盐芥中克隆出一个假定的Na /H 逆向转运蛋白基因ThNHX1.该cDNA全长2 045 bp,开放读码框长度为1 638 bp,编码一个545个氨基酸的多肽.序列分析结果表明,该序列与拟南芥的Na /H 逆向转运蛋白基因具有很高的同源性.结构分析结果表明,ThNHX1基因与AtNHX1基因具有类似的外显子和内含子构成.系统发育分析结果表明,该蛋白与液泡型的Na /H 逆向转运蛋白的亲缘关系较近,与质膜型的Na /H 逆向转运蛋白亲缘关系较远.     

蚕豆耐盐相关基因VfHKT1;1的克隆、生物信息学分析及表达特性

高亲和性钾离子转运蛋白(high affinity K+transporter,HKT)能够调节细胞及整株的Na+/K+转运,在植物盐胁迫调控中发挥着重要作用.采用RT-PCR和PCR方法克隆获得蚕豆VfHKT1;1基因全长编码序列,该基因包含1659 bp的开放阅读框,编码552个氨基酸.系统进化树分析发现,该蛋白属...     

大豆GmNHX1基因克隆及其在酵母中的耐盐性分析

Na~+/H~+逆向转运蛋白基因在植物响应盐胁迫中具有重要作用。本研究从耐盐大豆品种‘冀豆7号'克隆Na+/H+逆向转运蛋白基因GmNHX1,并利用酵母突变体对该基因的功能进行了初步研究。结果发现,GmNHX1包含1 641 bp的开放阅读框,编码546个氨基酸,有典型的Na~+/H~+逆向转运蛋白特征,与已知功能的液泡膜Na~+/H~+逆向转运蛋白具有较高同源性。半定量分析结果表明,GmNHX1受盐胁迫上调表达,在相同浓度盐胁迫下该基因在叶片中的表达量高于根系;耐盐品种‘冀豆7号'在200 mmol/L NaCl胁迫下,其GmNHX1的表达相较0 mmol/L NaCl处理下的表达增加了225%,而盐敏感品种‘冀豆17'只增加了94%。利用nhx1盐敏感酵母突变体进行功能互补试验,结果发现在50,200 mmol/L NaCl胁迫条件下,转GmNHX1酵母突变体菌株生长速度高于对照,GmNHX1具有恢复nhx1酵母突变体耐盐性的功能。     

海马齿 NHX 基因家族的鉴定及表达分析

【目的】海马齿（Sesuvium portulacastrum L.）是典型的海岸植物和红树林伴生植物，能够固沙护岸，在海水中可以正常生长，具有极强的耐盐性。Na+/H+ 逆向转运蛋白（Na+/H+ exchange，NHX）在植物耐盐和生长发育中起关键作用，为了解 NHX 在海马齿耐盐过程中的作用，对海马齿 NHX 基因家族进行鉴定和分析。【方法】采用生物信息学方法从海马齿全长转录组数据中鉴定 NHXs 成员，对其蛋白理化性质、保守基序和进化关系进行分析，并利用荧光定量 PCR 技术研究盐胁迫下 NHXs 成员的表达模式。【结果】从海马齿中共鉴定出 12 个SpNHX 基因，命名为 SpNHX1~SpNHX12。SpNHXs 基因编码的氨基酸长度为 276~554 aa，分子量为 31.22~61.21 kD，等电点为 5.55~8.64，不稳定指数为 32.14~50.54，均为疏水性蛋白。系统发育分析表明，SpNHX 蛋白可分为 2 个亚组，同一亚组具有相似的保守基序。多序列比对结果发现，SpNHX 均具有 Na+/H+ exchange 保守结构域。转录组数据和荧光定量 PCR 结果显示，SpNHXs 基因在盐胁迫下均受到不同程度的诱导，其中 SpNHX1、SpNHX9、SpNHX10、SpNHX11 和 SpNHX12 在盐胁迫下显著上调表达。【结论】本研究明确了海马齿 NHX 基因家族在高盐胁迫下的表达模式，表明 SpNHX1、SpNHX9、SpNHX10、SpNHX11 和 SpNHX12 可能参与海马齿盐胁迫响应，为进一步研究 NHX 在海马齿耐盐过程中的作用提供理论基础。     

棉花盐胁迫途径中蛋白磷酸化同源基因(GhSOS2)2种剪接体的克隆及表达分析

【目的】了解棉花在盐胁迫条件下相关基因的表达,并克隆与抗(耐)盐相关的重要基因。【方法】通过筛选棉花EST数据库,并对目标EST序列进行整合,对中棉所49在非盐胁迫和盐胁迫条件下进行处理并利用RT-PCR的方法克隆了质膜Na+/H+逆向转运蛋白途径中的1个蛋白磷酸化同源基因,命名为GhSOS2,并通过实时荧光定量PCR对其表达特征进行分析。【结果】序列分析表明,该基因成熟mRNA的剪接存在2种可选择性的剪接体,分别命名为GhSOS2a(GenBank登录号:GU188960)和GhSOS2b(GenBank登录号:GU188961),分别编码445和421个氨基酸残基。由于剪接方式的差异,导致GhSOS2a比GhSOS2b多出一个外显子(长度为72bp)。实时荧光定量PCR分析表明,GhSOS2a在非盐胁迫和盐胁迫条件下的根茎组织、叶组织均表达,但GhSOS2b仅在盐胁迫条件下的根茎组织、叶组织表达,且表达量远高于GhSOS2a。【结论】在棉花盐胁迫过程中,GhSOS2存在2种可选择性剪接体,而且可能主要是GhSOS2b参与棉花的质膜Na+/H+逆向转运蛋白途径并发挥一定作用。     

黄瓜质膜型Na~+/H~+逆向转运蛋白基因(SOS1)的克隆与序列分析

采用RACE(rapid-amplification of cDNA ends)方法从黄瓜Cucumis sativusL.中克隆出质膜Na+/H+逆向转运蛋白基因的cDNA(CsSOS1),该cDNA全长3 638bp,其中开放阅读框为3 435bp,编码1 145个氨基酸。氨基酸同源性分析表明,CsSOS1氨基酸序列与水稻OsSOS1和拟南芥AtSOS1的氨基酸序列同源性较高,分别为64%和58%,而与液泡型的Na+/H+逆向转运蛋白氨基酸序列亲缘关系较远。蛋白质跨膜结构分析表明CsSOS1包含11个完全跨膜片段。激光共聚焦显微镜显示CsSOS1基因的编码区与YFP基因融合后,定位在细胞膜上。酵母功能互补试验结果显示CsSOS1参与Na+与H+的转运,表明该基因转化酵母后可以补充酵母SOS1的缺失。     

玉米Na~+/H~+逆向转运蛋白基因ZmSOS1的克隆与鉴定

[目的]克隆玉米Na^＋／H^＋逆向转运蛋白基因,为研究此类基因在玉米非生物胁迫抗性机制中的功能奠定基础。[方法]采用电子克隆、RT—PCR、生物信息学方法,从玉米基因组中克隆1个质膜型Na^＋／H^＋逆向转运蛋白基因,并鉴定该基因编码产物的跨膜结构预测以及在盐胁迫下的表达模式等信息。[结果]利用电子克隆方法,从玉米中克隆出1个质膜型Na^＋／H^＋逆向转运蛋白基因ZmSOS1;Zm-SOS1基因的开放阅读框长3411bp,编码1136个氨基酸;序列分析表明,ZmSOS1蛋白与拟南芥和水稻同源物AtSOSl、OsSOS1的氨基酸序列一致性分别为61％和82％;RT—PCR分析表明,ZmSOS1基因的表达可以被盐胁迫诱导增强,表明其可能在玉米耐盐性上发挥功能。[结论]ZmSDS1是一个公认的质膜型Na^＋／A^＋逆向转运蛋白基因,并可能参与玉米的非生物胁迫反应。     

新疆盐生植物猪毛菜逆向运输蛋白基因SaNHX1 3’-RACE的克隆及序列分析

以新疆盐生植物猪毛菜(Salsola collina Pall.)为材料提取总RNA,根据NHX1家族同源序列保守区设计1对简并引物,进行RT-PCR扩增,得到猪毛菜逆向运输蛋白基因cDNA中间一段619 bp序列。再用快速扩增cDNA 3’末端(3’RACE)方法,得到约1 000 bp 3’末端序列。将两段序列进行拼接,得到猪毛菜长为1 585bp(Gen Bank登陆号为EU072932)的逆向运输蛋白基因(SaNHX1)cDNA序列,编码370个氨基酸,其编码序列、氨基酸序列与同科耐盐植物盐角草相应序列同源性为85%和87%,研究为进一步克隆猪毛菜NHX1全基因序列和研究其功能打下基础。     

獐茅耐盐基因SOS1的克隆及序列分析

采用RT-PCR和RLM-RACE方法从单子叶盐生植物獐茅(Aeluropus littoralis(Gouan)Parl)中克隆了质膜Na+/H+逆向转运蛋白基因(AlSOS1,JN936862),并对其基因序列进行了分析。Southern杂交试验显示:AlSOS1基因在獐茅基因组中以单拷贝形式存在。AlSOS1基因cDNA全长3 641bp,其中编码区3 420bp,编码一个1 139氨基酸的蛋白。AlSOS1编码蛋白与芦苇、水稻质膜Na+/H+逆向转运蛋白亲缘关系最为接近,达到82%和77%,与双子叶植物拟南芥的亲缘关系仅为58%;系统发育分析显示AlSOS1基因编码蛋白与其他植物质膜型Na+/H+逆向转运蛋白属于同一分支,而与液泡型Na+/H+逆向转运蛋白属于不同的分支;疏水性分析显示AlSOS1基因编码蛋白N-末端具有12个跨膜结构域,C-末端具有一个很长且面向质膜内腔的亲水尾部。这是獐茅SOS1基因编码区首次被完整克隆,将进一步应用于单子叶农作物耐盐性状改良的基因工程之中。     

Na~+/H~+逆向转运蛋白基因在甜瓜不同品种中的表达

Na＋/H＋逆向运输蛋白基因在植物耐盐性方面起着极为重要的作用。根据同源基因保守序列设计引物,通过RACE方法从甜瓜中克隆了Na＋/H＋逆向转运蛋白基因,命名为CmNHX1（FJ843078）。序列分析表明,该基因全长2 534bp,开放读码框为1 659bp,编码553个氨基酸多肽。氨基酸同源性分析表明该蛋白与液泡型Na＋/H＋逆向转运蛋白的亲缘关系较近,与质膜型Na＋/H＋逆向转运蛋白的亲缘关系较远。RT-PCR表达分析结果表明,CmNHX1在甜瓜根茎叶中均有表达,而且随着NaCl浓度和处理时间的增加,在根中表达持续增强,叶片中表达持续下降。耐盐品种‘金辉’根、茎和叶中的CmNHX1表达均高于盐敏感品种‘天仙’根、茎和叶中的表达。有趣的是在根中的表达,CmNHX1相对表达量在‘金辉’中是‘天仙’的2倍。CmNHX1在盐敏感酵母突变体中表达可以提高转化子对NaCl的耐受性,说明CmNHX1具有转运Na＋的功能。研究结果表明CmNHX1是一个液泡膜Na＋/H＋逆向转运蛋白,在甜瓜盐胁迫过程中起着重要作用。     

互花米草BADH基因的克隆与定量表达分析

为研究甜菜碱醛脱氢酶(Bataine aldehyde dehydrogenase,BADH)基因的耐逆功能及分子机制,以盐生植物互花米草(Spartina alterniflora)为试验材料,利用RACE技术克隆了cDNA全长序列。生物信息学分析发现,该核苷酸序列全长1 983 bp,开放阅读框1 515 bp,编码504个氨基酸残基。Blast比对发现,该氨基酸与细叶结缕草、二穗短柄草、高粱氨基酸的相似性分别达到96%、87%、86%,且氨基酸数量基本相同。将该基因命名为Sa BADH。以tub为内参,对SaBADH基因在600 mmol/L的NaCl、20%的PEG处理下表达的定量分析表明,SaBADH受NaCl、PEG诱导表达,随着处理时间的延长,SaBADH基因的表达呈现先上升后下降的趋势,分别在处理24、12 h时达到最大值,分别约为对照的7、4倍,差异达到极显著水平,表明SaBADH基因可能在抵御盐和干旱对互花米草的胁迫中发挥重要作用。     

海马齿Na~+/H~+逆转运蛋白基因SpNHX1的克隆及表达模式

从盐生植物海马齿中克隆了Na+/H+逆转运蛋白基因SpNHX1,生物信息学分析结果表明,Sp NHX1蛋白与拟南芥At NHX1和At NHX2的相似度分别达到了76.35%和77.12%,从而推测,SpNHX1可能具有与At NHX1和At NHX2相似的功能,能将Na+区隔到液泡中,提高植物耐盐性。采用荧光定量PCR的方法,对SpNHX1基因在4种胁迫(600 mmol·L-1Na Cl胁迫、100μmol·L-1ABA胁迫、4℃低温胁迫、20%PEG6000干旱胁迫)下的表达量进行了研究。结果表明:SpNHX1基因在根和茎中受盐胁迫诱导上调表达,叶中表达量变化较小;而在ABA胁迫、4℃低温胁迫、20%PEG6000干旱胁迫下,SpNHX1基因的表达受胁迫影响较小,且没有规律性。说明SpNHX1基因的表达与其耐盐性相关,且表达具有组织特性。