烟草植物螯合肽合成酶PCS1基因的电子克隆和序列分析

为了研究烟草中重金属镉的代谢转运基因,以马铃薯的植物螯合肽合成酶phytochelatin synthases 1(PCS1)基因的全长cDNA序列(GenBank登录号:AJ548472.1)为信息探针,通过电子克隆的方法从烟草栽培品种中克隆到1个植物螯合肽合成酶基因(NtPCS1),并对其进行了序列分析。序列分析结果:NtPCS1包含完整的开放读码框,编码531个氨基酸,含有2个保守域Phytochelatin_C和Phytochelatin;通过同源比对和进化分析发现,NtPCS1氨基酸序列与番茄PCS1的序列一致性达到85%,与已报道的树烟草NgPCS相比,在N端多出30个氨基酸。以上结果表明NtPCS1是栽培烟草中新发现的金属镉代谢转运基因。     

烟草新型胱硫醚-γ-合成酶的检测与分析

利用少量细胞分离技术和RT-PCR技术,在烟草合子中克隆到一种新型胱硫醚-γ-合成酶基因,命名为Nt CGS-4。序列分析显示新基因开放性阅读框长度为1 611 bp,编码537个氨基酸,预测分子质量为57.931 2 ku,等电点为6.15。利用染色体步移技术获得该基因5′上游2 696 bp的侧翼序列(启动子和5′UTR)。系统进化分析表明,该基因与多种农作物的胱硫醚-γ-合成酶基因具有较高同源性。烟草新型胱硫醚-γ-合成酶Nt CGS-4可能在烟草早期胚胎发生中参与甲硫氨酸的生物合成和代谢。     

烟草LEA3基因的克隆及序列分析

为从烟草中克隆到与植物抗逆相关的胚胎晚期丰富蛋白(LEA)基因,以番茄LEA3基因为探针,通过电子克隆的方法从烟草栽培品种K326中克隆到2个第3组LEA基因(NtLEA3-1和NtLEA3-2),并对其进行了序列分析.结果表明:2个LEA3基因的cDNA序列均包含完整的开放读码框,分别编码167和166个氨基酸,具有8个LEA3基元序列.亲水性分析表明NtLEA3-1和NtLEA3-2蛋白富含亲水氨基酸,是一种高度亲水性的蛋白,其蛋白二级结构中均以α-螺旋构象为主.NtLEA3-1和NtLEA3-2的氨基酸序列与番茄的一致性最高为79％,与其他已经发现的LEA3蛋白的一致性在42％～62％之间,表明NtLEA3-1和NtLEA3-2是2个新的烟草LEA3基因.     

棉铃虫蛋白酶体β5基因Habeta5的克隆与序列分析

[目的]运用分子生物学技术克隆棉铃虫蛋白酶体B5亚基新基因,为进一步研究其功能奠定基础。[方法]以棉铃虫中肠总RNA为模扳,利用快速扩增cDNA末端（RACE）技术克隆棉铃虫蛋白酶体B5亚基新基因的cDNA序列并对所获序列进行分析。[结果]成功克隆了棉铃虫蛋白酶体瞄亚基全长947bp的cDNA序列,命名为Habeta5,包含1个843bp的完整开放读码框（ORF）序列,编码蛋白质为280个氨基酸残基,预测分子量为30．87kD,等电点为6．53。Habeta5蛋白在74～261氨基酸残基位置为蛋白酶体B5亚基的保守区域。Clustal W进行多序列比对发现,Habeta5蛋白质与果蝇等昆虫蛋白酶体B5具有62％以上的同源性,蛋白酶体B5的保守区域高度一致。邻近法NJ分子进化分析也显示,Habeta5蛋白质与其他生物蛋白酶体茚进化上同源。[结论]序列分析比对的结果表明所克隆的基因为棉铃虫蛋白酶体B5亚基基因（GenBank登陆号：FJ358434）。     

烟草WS38生长素结合蛋白基因cDNA的克隆及序列分析

以烟草WS38为材料,根据GenBank中登录的烟草生长素结合蛋白(ABP1)氨基酸序列设计引物,通过RT-PCR克隆了烟草WS38ABP1基因cDNA分子编码区,序列全长为564bp,可编码1条188个氨基酸的多肽.利用ClustalX软件对该序列翻译获得的多肽序列与报道的烟草生长素结合蛋白氨基酸序列比较,两者同源性为98.4%,存在2个氨基酸的差异,但差异氨基酸对ABP1结构和功能影响微弱.认为克隆的cDNA序列即为烟草WS38ABP1cDNA,不同品种烟草ABP1基因存在的核苷酸单位点多态性(SNP)造成了两者氨基酸序列的差异.     

烟草NtPLR1基因克隆与表达分析

维生素B_6(VB_6)在植物体内参与多种生化反应,对植物生长至关重要,吡哆醛还原酶(PLR)是VB_6代谢转换的作用酶,催化吡哆醛(PL)生成吡哆醇(PN),对维持细胞内VB_6的动态平衡发挥重要作用,而PLR在植物中鲜有报道。以拟南芥Arabidopsis thaliana吡哆醛还原酶氨基酸序列At PLR1为模板,在公用数据库通过同源比对获得数条烟草Nicotiana tabacum Nt PLR1基因的片段,结合互补脱氧核糖核酸(c DNA)的末端快速扩增-聚合酶链式反应(RACE-PCR)技术获得了烟草吡哆醛还原酶Nt PLR1基因。该基因全长1 370 bp,编码369个氨基酸残基,预测其编码蛋白的分子量为41 kDa,理论等电点为9.42。氨基酸多序列比对结果表明:Nt PLR1与其他物种的PLR1相似性较高。实时荧光定量PCR(q RT-PCR)分析结果表明:外源吡哆醛PL处理时,Nt PLR1表达先升高后降低,在4 d达到顶峰。相应地,高效液相色谱分析结果表明:烟草叶片中PL含量随时间逐渐降低而吡哆醇PN含量逐渐升高,表明Nt PLR1可像酵母PLR一样,催化PL形成PN。此外,定量分析结果表明:Nt PLR1在烟草根、茎和叶片中均有表达,其中在叶片中表达显著高于其他部位(P0.05)。在紫外线、氧化和盐害胁迫下,Nt PLR1的表达与对照相比均显著上调(P0.05),表明Nt PLR1对这3种逆境有响应,可能参与烟草的抗逆过程。将Nt PLR1连入原核表达载体p ET32a,并进行诱导表达,成功表达出目的蛋白。报道的烟草Nt PLR1基因功能为进一步探明植物PLR基因的功能和调控机制以及VB_6的生物合成提供了重要参考。     

烟草(云烟87)NBS-LRR类同源抗病基因克隆及分析

[目的]克隆并分析烟草NBS-LRR类抗病基因的同源序列(RGAs),为采用同源克隆技术挖掘烟草抗病基因提供理论参考.[方法]从基于NBS-LRR类抗病基因保守序列设计的简并引物中筛选扩增效果较好的引物用于扩增烟草RGAs,采用DNAMAN 6.0翻译成氨基酸序列,并与已知的其他植物抗病基因进行聚类分析.[结果]克隆获得6条与参比抗病基因具有高度同源性的烟草RGAs,大小在500 bp左右,但仅有4条RGAs具有连续的开放阅读框(ORF)及编码NBS功能结构域的核苷酸序列,命名为TRGA-87-1~TRGA-87-4.这4个烟草RGAs编码的氨基酸序列均含有NBS类抗病蛋白的多个典型保守基序,与已知的多种植物抗病基因编码的氨基酸序列均具有较高的相似性,其中,与烟草相关抗病基因编码的氨基酸序列相似性最高,为97.00%~100.00%,与其他植物的抗病基因编码氨基酸序列相似性为29.00%~53.00%,这些序列可分为3个亚类,其中TRGA-87-2与烟草N和亚麻L6聚为一类(TRGAⅠ),属于TIR-NBS-LRR类;TRGA-87-3和TRGA-87-4与水稻Xa-1和番茄Mi聚为一类(TRGAⅡ),属于non-TIR-NBS-LRR类,TRGA-87-1与拟南芥RPM1聚成一类(TRGAⅢ),属于non-TIR-NBS-LRR类.[结论]同源扩增技术可用于烟草中抗病基因的克隆、功能分析及定位等研究.     

烟草NtCIPK2基因的克隆及表达分析

CIPK(CBL-interacting protein kinase)是一类具有生物活性的丝/苏氨酸蛋白激酶,通过与类钙调神经素B亚基蛋白(Calcineurin B-like protein,CBL)相互作用从而调节植物在适应或抵制非生物逆境胁迫中的生理活动。基于同源序列克隆烟草K326中Nt CIPK2基因c DNA全长,采用q RT-PCR分析Nt CIPK2的组织及逆境胁迫下特异性表达。结果表明,该基因全长1 341 bp,编码446个氨基酸残基,预测分子量为50.3 ku,等电点为8.90。同源性分析结果显示,该蛋白与绒毛状烟草(Nicotiana tomentosiformis)CIPK2有95%的同源性,故命名为Nt CIPK2。生物信息学分析表明,该蛋白是一个亲水蛋白,其N端含有活化环结构域S_TKc,C端含有调节结构域CIPK-C,可能定位在质膜。组织表达分析发现,该基因在烟草根、茎、叶、花中均有表达,其中茎中表达量最高。逆境胁迫试验表明,该基因受低钾、高盐、干旱、H2O2和ABA诱导,参与烟草非生物逆境胁迫的响应。     

烟草精氨酸脱羧酶的蛋白质特性分析

为了研究参与烟草多胺合成的精氨酸脱羧酶的蛋白特性,运用生物信息学的方法分析了烟草精氨酸脱羧酶的理化特性、系统进化、氨基酸序列、保守区域和二级结构。结果表明:烟草精氨酸脱羧酶的等电点为4.99~6.78,氨基酸数为558~733,疏水性为-0.050~0.079,脂肪指数为88.04~92.08,不稳定指数为39.54~44.14;经进化树分析,烟草精氨酸脱羧酶分为2组,组1为Nt CAD1、Nt CAD2和Nt CAD5,组2为Nt CAD3和Nt CAD4;经序列比对分析,Nt CAD1、Nt CAD2和Nt CAD5的同源性较高,Nt CAD3和Nt CAD4的同源性较高,且组2均具有1个精氨酸脱羧酶保守序列和2个丙氨酸消旋酶/Ⅳ组脱羧酶保守序列;烟草精氨酸脱氢酶各成员的二级结构所占比例均为α-螺旋无规则卷曲β-折叠β-转角。     

马铃薯Y病毒广东分离物HC-Pro基因的克隆和序列分析

利用RT-PCR法对广东烟草样品的马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)辅助成分蛋白质(Helpercomponent proteinase,HC-Pro)基因进行了克隆,并对其进行了序列分析。测序结果表明广东PVY HC-Pro(命名为PVY-HC-GD)基因(用PVY-HC-GD表示)全长1 395 bp,编码465个氨基酸。与已报道的PVY HC-Pro基因核苷酸序列相比发现,PVY-HC-GD与PVY NTN株系(PVYNTN)(AB331517)的PVYHC-Pro基因核苷酸序列相似性最高,达99.6%。而氨基酸序列比较表明,PVY-HC-GD与PVY N株系(PVYN)(AM268435)的PVY HC-Pro氨基酸序列相似性最高,为99.1%。进一步将PVY-HC-GD的核苷酸和其编码的氨基酸序列与其他报道的同源基因比对构建了系统关系树,结果显示广东烟草样品中PVY-HC-GD与PVYNTN PVY HC-Pro亲缘关系最近。     

烟草甘露糖结合凝集素基因的克隆及序列分析

为了对植物抗病虫基因工程研究提供依据,以辣椒凝集素基因为探针,通过电子克隆方法从烟草栽培品种K326中克隆甘露糖结合凝集素基因,并对其进行了序列分析。结果表明:从烟草栽培品种K326中克隆出NtMBL1、NtMBL2和NtMBL33种甘露糖结合凝集素基因;3种凝集素cDNA序列均包含完整的开放读码框,编码298个氨基酸,具备B-凝集素结构域,与辣椒凝集素蛋白的一致性较高。经SWISS-MODEL同源模建分析,NtMBL1、NtMBL2和NtMBL3的蛋白模型由8～9个β片层组成的β桶结构,具有与单子叶植物甘露糖结合凝集素相似的空间结构。     

烟草合子时期特异表达基因的克隆与分析

在烟草合子中克隆到1种新型的未知功能基因Nt ZE583,编码包含有91个氨基酸残基的多肽链。生物信息学分析显示:该蛋白的N端含有1段疏水性信号肽,但在其他物种中没有发现同类蛋白。Nt ZE583-绿色荧光蛋白(Nt ZE583-GFP)融合蛋白亚细胞定位显示,该蛋白可能存在于液泡中。利用染色体步移技术获得该基因5'端上游3866 bp的侧翼序列(启动子和5'UTR),经检测发现,具有较强的启动子活性。研究结果为进一步研究该基因在烟草早期胚胎发生中的功能奠定了基础。     

普通烟草Nt4CL基因家族的生物信息学分析

为烟草分子育种提供参考,利用序列相似性比对鉴定烟草中的20个Nt4CL基因,并对其基因结构、蛋白理化性质及保守结构域、亚细胞定位进行分析预测。基于普通烟草栽培品种K326转录组数据,对20个Nt4CL基因在烟叶不同生长发育时期的表达量进行可视化分析。结果表明:烟草中Nt4CL基因数目庞大,但其蛋白结构、理化性质等高度保守,且各个家族成员存在组织特异性表达;选择烟草叶片高表达的Nt4CL基因进行功能研究,可为烟草木质素合成的分子调控研究奠定基础。     

烟草NtGRAS基因的克隆与转录激活及表达特性分析

以烟草品种NC89为试验材料,通过电子克隆获得1个烟草GRAS家族基因NtGRAS。该基因编码区长为1 311 bp,编码436个氨基酸。生物信息学分析结果显示,NtGRAS蛋白的相对分子质量为47 781,等电点为5.16,亚细胞定位于细胞核。进化树分析发现,NtGRAS蛋白与拟南芥At SCL23蛋白高度同源。酵母转录激活结果表明,Nt GRAS蛋白具有转录激活活性。实时荧光定量PCR分析表明,NtGRAS在烟草的根、茎、叶和花中均有表达,其中在根部的表达量最高;低温(4℃)、NaCl(200μmol/L)和干旱均能诱导NtGRAS基因上调表达。     

烟草半胱氨酸蛋白酶的基因和蛋白序列分析

以ABW71226.1、BAA96501.1、ACB70409.1、AAW78660.1和ADV41672.1为材料,采用生物数据分析工具对烟草的半胱氨酸蛋白酶的基因和蛋白序列进行分析,分别以GSDS、MEME和Signal P 4.1工具对其基因结构、保守基序和信号肽进行检测。结果显示,Nt CP-1和Nt CP-2基因具有7个外显子,Nt CP-3和Nt CP-4基因含有4个外显子,Nt CP-5基因具有3个外显子,Nt CP-1、Nt CP-2和Nt CP-5基因具有上游序列,Nt CP-1、Nt CP-2、Nt CP-4和Nt CP-5基因具有下游序列;检测Nt CP共有5个Motif,其核心保守基序区为Motif-1—Motif-2—Motif-4,且位于木瓜蛋白酶家族半胱氨酸蛋白酶结构域中,Motif-1和Motif-2含有半胱氨酸和谷氨酰胺;Nt CP均属于信号肽,Nt CP-1和Nt CP-2的信号区分布相同(1~22),Nt CP-3和Nt CP-4的信号区分布相同(1~20),Nt CP-5的信号区为1~29。     

烟草多酚氧化酶基因的克隆与序列分析

多酚氧化酶(PPO)在高等植物中广泛存在,其利用分子氧催化氧化酚类物质为醌,对植物的抗虫和抗病起着一定的作用,同时它介导的酶促反应也是烤制中烟草褐变的主要原因。本文采用RT-PCR,成功地从野生烟草(Nicotiana tabacum)叶片中克隆出了PPO c DNA序列。序列分析表明,烟草PPO基因ORF长为1773 bp,编码590个氨基酸,基因登陆号为KC540916,烟草与其他物种PPO的核苷酸序列与氨基酸序列同源性达80%以上,并包含两个高度保守的铜离子结合区域。烟草PPO基因的克隆为烟草的抗性研究和褐化反应的控制研究提供了良好的理论基础。     

烟草CENH3-1和CENH3-2基因克隆及表达分析

【目的】克隆栽培烟草K326着丝粒特异组蛋白(Centromeric histone H3, CENH3)基因，并对其进行生物信息及表达特性分析，为探明NtCENH3基因的单倍体诱导功能及烟草品种快速改良提供依据。【方法】以栽培烟草K326为材料，利用同源克隆技术获取NtCENH3-1和NtCENH3-2基因的cDNA全长序列，运用生物信息学软件分析蛋白的序列特征；通过亚细胞定位技术验证基因的表达部位；利用荧光定量PCR检测NtCENH3-1和NtCENH3-2基因在烟草不同组织部位的表达情况。【结果】NtCENH3-1和NtCENH3-2包含7个外显子和6个内含子，编码区(CDS)长度分别为468 bp和471 bp,分别编码156个和157个氨基酸，蛋白的分子量分别为17.64 kDa和17.75 kDa。进化树分析表明，栽培烟草CENH3-1和CENH3-2基因分别来源于祖先种绒毛烟草和林烟草，2个基因均定位于细胞核中。RT-PCR分析显示，NtCENH3-1和NtCENH3-2在不同组织中呈差异性表达，且在雌蕊及幼嫩的果实中表达量较高。【结论】在烟草中成功克隆着丝粒特异组蛋白N...     

马铃薯衰老相关基因的电子克隆与生物信息学分析

利用电子克隆获得马铃薯衰老相关基因(StSAG)的cDNA序列,并对其进行生物信息学分析.结果表明,马铃薯衰老相关基因的cDNA序列全长1 062 bp,包含一个561 bp的开放阅读框,编码186个氨基酸;StSAG的等电点为7.20,为亲水叶绿体蛋白,无信号肽,有12个磷酸化位点,在N末端有一个较短的伸展肽段.StSAG与茄科植物烟草亲缘关系最近.     

淡色库蚊氯菊酯抗性相关基因PR-OP全长cDNA的克隆及生物信息学分析

【目的】克隆淡色库蚊氯菊酯抗性相关视蛋白基因,并进行生物信息学分析,为阐明视蛋白基因的抗性机制及研制新型卫生杀虫剂奠定基础。【方法】依据库蚊抗性与敏感品系差异表达的EST片段设计PCR引物,采用RACE技术克隆淡色库蚊氯菊酯抗性相关基因PR-OP全长cDNA序列,并对其生物信息学进行分析。【结果】获得了长度为1 402 bp的淡色库蚊氯菊酯抗性相关基因PR-OP全长cDNA,其编码383个氨基酸。生物信息学分析结果表明,该基因编码蛋白为具有7个跨膜螺旋的膜蛋白,其保守域与视紫红质家族的保守域一致,该蛋白还具有2个信号肽切割位点和18个磷酸化位点。系统进化分析表明,该基因与淡色库蚊溴氰菊酯抗性相关视蛋白基因及致倦库蚊、埃及伊蚊视紫红质基因氨基酸序列同源性在69%以上,与家蚕、烟草天蛾、柞蚕、柑橘凤蝶、中华蜜蜂、黑腹果蝇视蛋白的氨基酸序列同源性均在56%以上。【结论】克隆了淡色库蚊氯菊酯抗性相关视蛋白基因(GenBank登录号为FJ917744),推测其与氯菊酯抗性相关。     

葡萄中白藜芦醇合成酶基因的克隆及其转化黄芪研究

利用RT-PCR技术从巨峰葡萄中克隆获得RS基因的全长c DNA序列,并利用农杆菌侵染法转化黄芪。试验结果表明:经Vector NTI 11.0软件分析克隆获得的RS基因全长序列长度为1 241 bp,并带14 bp长度的poly(A)尾巴,包含930 bp的开放读码框(ORF),编码1个含310个氨基酸残基的蛋白质。生物信息学分析结果表明:RS基因编码白藜芦醇合成酶,对RS基因全长序列进行蛋白质结构域分析,证明该基因具有查尔酮合成酶N端保守结构域,其长度为225个氨基酸。对黄芪进行遗传转化结果表明:获得了3棵黄芪转基因阳性植株,通过DNA、RNA以及蛋白质水平证明RS基因已经完全整合到黄芪基因组中并表达。