水稻OsTFL2基因启动子的克隆及功能验证

[目的]克隆水稻TFL2(OsTFL2)启动子序列,并分析其结构和功能,为深入研究OsTFL2基因对水稻开花和花发育的调控机理提供理论参考.[方法]采用同源克隆方法克隆OsTFL2基因启动子序列,利用PLACE和PlantCARE分析其结构和功能,并将其连接至携带β-葡萄糖苷酸酶(GUS)基因的pCAMBIA1301载体以构建pCAMBIA1301-Pro-moter植物表达载体,通过农杆菌介导转化水稻品种农垦58愈伤组织,通过对转基因植株进行GUS组织化学染色以分析该基因启动子的表达特性和调控功能.[结果]克隆获得的OsTFL2基因起始密码子上游启动子序列1.8 kb,该序列除含有真核生物典型启动子元件TATA-box和CAAT-box外,还含有花粉特异识别的顺式作用元件Pollen1lelat52(AGAAA)、开花基因转录相关的多功能转录因子CACTFTPPCA1(PACT,Y=C/T)、CCAAT box1(CCAAT)、DOFCORE(AAAG)和GATA box(GATA)、分生组织特异性元件CCGTCC-box及多个光诱导元件或光诱导相关元件如G-box、Box I、CATT-motif、GATA-motif和GT1-motif等,推测OsTFL2基因通过上述作用元件参与调控水稻花发育及开花.通过PCR检测共筛选获得16株阳性转基因植株,对其进行GUS组织化学染色,结果发现水稻的外颖、花、花药、柱头和子房中均可检测到明显的GUS色斑,而在叶片、茎尖和根尖无明显的GUS色斑,说明OsTFL2启动子能驱动GUS基因在水稻外颖、花药和子房中表达.[结论]OsTFL2基因启动子具有启动活性和组织表达特异性,可在一定程度上影响OsTFL2基因表达,对水稻花生长发育和开花发挥重要调控作用.     

小麦avenin-like type-B基因启动子的克隆及功能验证

为深入研究ALPtype-B基因的调控机理及胚胎特异性表达特性,采用农杆菌转化技术,将含有ALPtype-B基因启动子的双元表达载体转化烟草。对阳性转基因烟草植株进行GUS组织化学检测定性分析。结果显示,小麦ALPtype-B基因启动子可驱动报告基因在烟草种子的胚乳中特异表达,在其他组织中没有表达。     

大鼠胰岛素Ⅱ基因启动子克隆与功能验证

【目的】克隆大鼠胰岛素Ⅱ基因启动子（RIP2）序列并对其功能进行验证,为培育胰岛特异性表达外源基因的转基因动物奠定基础。【方法】根据GenBank中已发表的RIP2序列（J00748．1）设计引物,以大鼠基因组DNA为模板,PCR扩增RIP2序列,连接pMD18-T载体后用HindⅢ和BamH I进行双酶切,回收RIP2片段并连接至不含启动子的pEGFP-1载体上构建真核表达载体pEGFP-1-RIP2。重组质粒转染PK15细胞,24h后观察细胞荧光蛋白表达情况。【结果】克隆获得的RIP2序列与参考序列（J00748．1）的同源性为99．9％,存在3处碱基差异,即从起始密码子ATG（＋1）上游-57处有一个G碱基缺失,-387处C突变为A,-707处插入一个G碱基。RIP2序列存在一个TATA-box（-206～201位点）和一个CAAT-box（-343-339位点）。以重组质粒pEGFP-1-PIP2转染PK15细胞,24h后能观察到绿色荧光。【结论】克隆获得的大鼠RIP2序列具有启动子功能,但活性较CMV启动子弱。     

花生AhDGAT1基因启动子的克隆与功能验证

二酰基甘油酰基转移酶(DGAT)是三酰基甘油(TAG)生物合成过程的限速酶。在本研究中,通过染色体步移法从栽培花生品种鲁花14基因组中克隆了AhDGAT1的启动子(pAhDGAT1)序列,并通过生物信息学分析发现该启动子含有多个TATA-box、CAAT-box、光调控元件、胁迫防御相关元件和激素响应元件。利用农杆菌介导法将pAhDGAT1∶GUS植物表达载体转化烟草叶片。通过GUS染色发现在转基因烟草营养器官和生殖器官中均检测到GUS表达,在花丝和花柱中表达较低,而在柱头、花药和种子中表达较高,表明pAhDGAT1表达没有组织特异性,具有组成型启动子的特征。     

甘蓝型油菜种子特异表达油体蛋白启动子P_(BnOA03)的克隆及功能分析

为了改良油菜种子的性状,常常需要研究种子特异表达目的基因的情况。在分析油菜油体蛋白表达模式的基础上,选择种子特异高表达的油体蛋白,根据甘蓝型油菜基因组序列设计引物,利用PCR技术从基因组中克隆到一段715bp的启动子序列。启动子顺式元件分析表明,这一克隆序列具有CAAT-box和TATA-box启动子基本元件,另外含有ABA响应元件等多种顺式元件。进一步利用GUS报告基因在拟南芥中对该启动子的功能进行鉴定,结果表明,在转基因株系的幼苗、根、茎、叶、花和种子发育前期及成熟种子中没有检测到GUS基因明显表达,在种子发育的中后期检测到GUS基因的表达逐渐增强。说明这个启动子的表达调控具有一定的种子特异性。     

固氮基因nifHDK启动子的功能在大肠杆菌中的验证

近年来,在对肺炎克氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)nifA产物研究的基础上已建立了固氮基因调控的模型。固氮基因(nif)的表达受氮调节系统ntr和nifAL操纵子的两个系统的调控。本实验将固氮基因nifHDK启动子、aphA-6基因和rbcL3’构建aphA-6基因表达盒,克隆到pSK.KmR载体,将其转入到大肠杆菌中验证nifHDK启动子的表达活性。结果表明,只有在转入外源nifA基因时,nifHDK启动子才具有转录活性,aphA-6基因才能表达。验证了NifA蛋白和σ54因子是固氮基因的正向调节蛋白,为下一步固氮生物工程研究提供了理论基础。     

东方粘虫U6启动子的克隆及功能验证

为了持续获得大量短片段干扰RNA(short interference RNA,siRNA),通过染色体步移技术克隆得到东方粘虫U6snRNA基因5′-端侧翼启动子序列1 426bp。经生物信息学分析,该序列含SPH元件、八聚体序列(OCT)、远端序列元件(DSE)、近端序列元件(PSE)及TATA box等RNA聚合酶Ⅲ(RNA polymeraseⅢ,RNA PolⅢ)U6启动子的特征元件。通过构建RNA干扰(RNA interference,RNAi)载体的方式,对增强型绿色荧光蛋白EGFP基因进行RNAi,证明克隆得到的东方粘虫U6启动子可成功驱动shEGFP表达,具有U6启动子功能。为后续构建以东方粘虫V-ATP酶H亚基为靶基因的沉默载体奠定基础。     

CmWRKY15-1启动子的克隆及功能验证

由堀氏菊柄锈菌(Puccinia horiana Henn.)引起的菊花白色锈病,对菊花的栽培产业造成了严重的经济损失.抗病品种培育是解决白色锈病对菊花产业造成巨大危害的重要尝试,通过分析CmWRKY15-1启动子的活性和功能,为抗病基因的发掘和抗病品种改良提供参考.利用HiTAIL-PCR技术,从菊花C029中克隆C...     

油菜Oleosin基因启动子的克隆、分析及瞬时表达

以甘蓝型油菜幼苗为材料,根据油脂蛋白Oleosin(O20)基因的启动子序列设计引物,PCR扩增了长度为935 bp的片段,把该片段连接到pBI101载体,GUS瞬时染色结果表明,该片段可以驱动GUS基因在油菜幼苗根部特异性表达。油菜油脂蛋白是一个蛋白质家族,为进一步鉴别扩增到的935 bp油脂蛋白启动子,该研究利用油菜基因组信息进行序列对比,结果表明935 bp的启动子和Oleosin(O20)的启动子序列之间有较多的变异,但和油菜1号染色体上的序列完全一致;1号染色体上紧跟的编码框序列和油脂蛋白Oleosin(O20)的编码框序列也完全一致,但油脂蛋白Oleosin(O20)的基因组序列要比油菜1号染色体的基因组序列短。通过PLACE和PlantCARE软件对935 bp启动子进行了扫描预测,结果表明该启动子中含有许多顺式作用元件,尤其是脱落酸、茉莉酸甲酯和水杨酸这3个与激素有关的元件;将该研究扩增到的另一个928 bp长度的启动子与935 bp的启动子相比,前者启动子区域水杨酸顺式作用元件缺少了1个碱基,同时也缺失了1个碱基的片段,这些序列的变化可能是该启动子丧失活力的原因。     

Na~+/H~+逆向转运蛋白基因PsnhaA的克隆及在大豆中的功能验证

高盐对作物造成渗透胁迫和离子毒害,Na+/H+逆向转运蛋白是生物耐盐的关键因子,能够维持高盐胁迫下生物体的正常生长代谢。为促进作物的遗传转化,选育耐盐作物品种,从施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)中克隆质膜Na+/H+逆向转运蛋白基因PsnhaA,并构建到植物表达载体pBI121上,通过发根农杆菌介导的整株生长点注射法转化大豆。结果表明:PsnhaA基因已整合到转化大豆基因组中,并在转录水平获得表达。耐盐相关生理指标检测结果显示,盐胁迫后转基因植株的质膜相对电导率显著低于对照植株,叶绿素含量和脯氨酸含量显著高于对照植株。PsnhaA基因显著提高了大豆的耐盐水平,为农作物的耐盐性改良提供了优良的候选基因。     

水稻病程相关蛋白基因OsPR-4b启动子的克隆及缺失体构建

用一对根据已克隆的水稻OsPR-4b基因序列和水稻基因组序列数据库相应序列设计的引物扩增到OsPR-4b基因上游2257 bp的启动子序列.用PLACE软件分析顺式作用元件,发现OsPR-4b基因起始密码子上游1.5kb的区域内存在几个可能与PR蛋白基因表达调控相关顺式作用元件,如W盒、PAL-boxA、GT-1结合序列、Dof结合序列和MybSt1元件等.将OsPR-4b基因启动子区域及其5'部分缺失构件与gus报道基因相连,并克隆进pCAMBIA1391z载体中,用于分析启动子活性以及顺式作用元件在调控OsPR-4b基因表达中的功能.     

毛果杨PtAREB1基因启动子的克隆及功能

为了研究杨树ABF2同源基因的表达规律,从毛果杨基因组DNA中克隆出Pt AREB1基因上游一段1 800 bp序列。序列分析结果表明,该序列含有逆境胁迫响应元件TC-rich repeats、ABA应答元件ABRE和茉莉酸甲酯(Methyl Jasmonate,Me JA)应答元件TGACG-motif等胁迫相关元件。在序列分析的基础上,构建了Pt AREB1基因启动子驱动GUS报告基因的植物表达载体,利用农杆菌介导的花粉管通道法获得转基因拟南芥。结果表明Pt AREB1启动子可以在干旱、ABA、盐、Me JA和SA胁迫下,驱动GUS基因在转基因拟南芥的根、茎和叶中表达。说明Pt AREB1基因可能与干旱、高盐等胁迫应答紧密相关。     

甘蓝型油菜ALS基因启动子克隆及其瞬时表达分析

为研究油菜ASL基因(BnALS)启动子的功能,根据油菜基因组信息,提取得到BnASL基因上游区域的碱基序列,通过设计特异性引物对,利用PCR扩增克隆得到大小为1 048个碱基的片段。序列分析结果显示,该序列富含TATA box和CAAT box等启动子核心调控序列,并有多个与逆境、激素、光响应等表达相关的顺式作用元件,如MBS元件、ABRE元件、HSE元件CGTCA-motif、TGA-motif等。为了进一步研究其启动子功能,将其与β-葡萄糖苷酸酶(GUS)基因融合,构建了植物表达载体p1304-P,通过根癌农杆菌介导法转化烟草(Nicotiana benthamiana),对PCR阳性的再生烟草苗进行GUS组化分析,检测GUS基因在转基因烟草中的瞬时表达情况。结果表明,克隆的BnASL基因上游序列能够驱动GUS基因在烟草根、茎、叶等组织中的表达,推测油菜ALS基因上游的1 048 bp片段具有组成型表达的启动子功能。     

甘蓝型油菜种子油体蛋白提取及双向电泳分析

[目的]研究不同含油量油菜种子油体蛋白差异表达,为提高油菜含油量提供参考.[方法]分别从高低含油量油菜种子中分离油体,提取油体蛋白,经双向凝胶电泳后,分析油体蛋白质组的二维表达图谱.[结果]仅在高含油量品种种子油体蛋白质组中出现的蛋白点有3个;仅在低含油量油菜品种油体蛋白质组中出现的蛋白点有4个;在两者中均出现、且表达量差异在两倍以上的蛋白点有16个.[结论]采用蛋白质组学技术对不同含油量油菜种子油体蛋白进行比较蛋白质组学研究,是有效研究油菜种子含油量性状的技术手段.     

芝麻硬脂酸脱饱和酶基因SiSAD的克隆及功能验证

【目的】对芝麻△9硬脂酰-ACP脱饱和酶基因SiSAD（△9 stearoyl acyl-carrier-protein desaturase）进行克隆与表达分析,并转入拟南芥,探究其在油酸合成过程中的作用,为芝麻油酸含量的遗传改良提供分子基础。【方法】提取中芝13叶片的总RNA,反转录为cDNA。根据芝麻基因组数据库中的SiSAD序列信息（序列号为SIN_1008977）设计引物,以cDNA为模板,通过RT-PCR克隆获得SiSAD编码区序列,并与参考基因组序列进行比较。利用InterPro进行保守结构域分析,获得SiSAD蛋白的保守结构域。利用BLAST对SiSAD蛋白进行同源对比,获得SiSAD的同源蛋白质。采用邻接法构建系统进化树,获得芝麻SAD蛋白与橄榄、牵牛花、蓖麻、莴苣、葡萄、柑橘、拟南芥等植物SAD蛋白的亲缘关系。通过荧光定量PCR检测SiSAD在2个芝麻品种中芝33和中丰芝一号的根、茎、叶、蕾和种子中的相对表达量,分析SiSAD的表达特异性。将SiSAD连接过表达载体,通过农杆菌介导法转化野生型拟南芥（Col-0）,筛选阳性后代,对T₃代转基因和野生型的拟南芥种子中硬脂酸和油酸相对含量进行测定,分析SiSAD的功能。【结果】成功获得SiSAD的编码区序列,与参考基因组序列一致,全长为1 152 bp,编码383个氨基酸,SiSAD蛋白的分子量为43 kD,等电点为6.18。发现SiSAD蛋白含有一个保守结构域,属于脂肪酸去饱和酶家族成员,与其他植物的SAD蛋白质序列的同源性较高,暗示SiSAD在不同物种中的功能可能比较保守。系统进化分析显示,芝麻SAD蛋白与牵牛花和橄榄的SAD蛋白处于同一分支,进化关系较近,与蓖麻、拟南芥、柑橘的SAD蛋白亲缘关系较远。荧光定量PCR结果表明,SiSAD在芝麻种子中的表达量远远高于其他组织,有显著的组织特异性。成功构建了SiSAD的过表达载体,通过农杆菌介导法转化拟南芥,结果表明SiSAD成功导入拟南芥中,而且转录水平很高。对T₃代转基因拟南芥种子中硬脂酸和油酸的相对含量分析表明,与野生型拟南芥比较,3个转SiSAD拟南芥株系中硬脂酸（C18:0）含量分别降低了3.0%、4.8%和6.1%,而油酸（C18:1）含量分别升高了2.8%、4.3%和7.8%,平均升高4.97%。【结论】克隆获得芝麻SiSAD的全长cDNA序列,鉴定了SiSAD的功能,发现SiSAD在油酸合成代谢过程中正向增加油酸含量,可应用于高油酸芝麻新品种培育。     

大豆24 kDa油体蛋白基因在大肠杆菌中的表达

 分别构建了含全长大豆24 kDa油体蛋白基因、与大肠杆菌热敏毒素B亚基和定居因子CS6 B亚基基因以串联方式融合的全长大豆24 kDa油体蛋白基因、缺失N端74个氨基酸编码序列的油体蛋白基因及缺失C端152个氨基酸编码序列油体蛋白基因等4个大肠杆菌表达载体。除N端缺失的油体蛋白基因外,其它3个载体的IPTG诱导表达产物对E.coli生长表现出明显的抑制作用,菌液浓度与对照菌株相比,至少降低了3倍;而N端缺失了222个编码核苷酸的油体蛋白基因则对宿主细菌细胞的生长繁殖不再表现有任何毒性。进一步通过SDS-PAGE和Western印迹反应检测各表达载体的IPTG诱导表达产物时发现,仅有N端缺失的24 kDa油体蛋白基因片段在宿主细胞BL21(DE3)和Rosseta(DE3)中有重组油体蛋白积累。     

大豆rbcS基因启动子的克隆及在转基因烟草中的功能缺失分析

【目的】进一步验证栽培大豆rbcS基因启动子功能,为植物基因工程相关研究提供启动子资源。【方法】从栽培大豆中克隆了rbcS基因5′端上游1 538bp的DNA序列,根据光诱导表达调控元件及顺式作用功能元件所在的位置,设计含1 089,712和190bp 3个5′端缺失体,并将rbcS基因启动子(1 538bp)及3个5′端系列缺失体序列分别与gus基因融合,构建植物表达载体并命名为pGmrbcS、pA、pB和pC,用农杆菌介导法转化烟草,通过gus基因活性变化检测不同缺失体的表达特性。【结果】克隆了1 538bp的大豆rbcS基因启动子序列及1 089,712和190bp的5′端缺失体启动子片段。GUS活性检测表明,在pGmrbcS转基因烟草的叶中GUS活性最高,且与pCAMBIA1301转基因烟草叶片中CaMV35S启动子驱使gus基因的表达量相当,而茎、根中GUS活性较低。GUS定量分析表明,T1代转基因烟草光下培养时,3种缺失体启动子叶片中的GUS表达活性均与CaMV35S启动子相当,其中pB活性最高,是CaMV35S启动子活性的1.4倍,pA、pC活性低于pB,分别为pB活性的84%和71%;含pA的转基因烟草于黑暗中萌发的幼苗叶片gus基因不表达,光下萌发幼苗叶片有gus基因表达,而含有pB、pC的转基因烟草,在黑暗和光下萌发的幼苗叶片中均有gus基因表达,且表达量以pB最高。【结论】含有长度为1 089bp(pA)光诱导元件的rbcS基因缺失体启动子具有光诱导和组织特异表达特性,长度为712bp(pB)的缺失体启动子的启动活性最高。     

籼稻胚乳特异性启动子Gt1的克隆及其功能验证

从籼稻（Oryzasativa L.ssp.indica）品种谷秆两用稻‘东南201’中克隆获得胚乳特异性启动子Gt1;序列全长为929 bp;含胚乳中特异表达所必需的正调控元件GCN4 motif（TGAGTCA）与Skn-1 motif（GT-CAT）等。与已报道的粳稻品种‘日本晴’的序列相比,籼稻‘东南201’Gt1启动子序列仅在-507 bp处发生一个碱基突变,在-268、-267、-194、-193 bp位置处分别缺失1个碱基;但在已知功能motif,两者没有任何差异。用Gt1替代35SCa MV启动子驱动GUS基因转化水稻‘台粳9号’,结果表明GUS基因仅在胚乳中特异表达,而在其它组织中未表达。克隆的籼稻谷蛋白基因Gt1的启动子序列,可为进一步开展水稻品质分子改良提供必要手段。     

马铃薯sgt3基因启动子克隆及其功能鉴定

【目的】克隆马铃薯茄啶鼠李糖基转移酶基因(sgt3)的启动子序列并对其进行功能鉴定.【方法】采用染色体步移技术(genome walking)进行启动子的克隆,构建了该启动子驱动报告基因gfp::gus的植物双元表达载体p1304sgt3p,以pCAMBIA1304为阳性对照表达载体,采用农杆菌介导的烟草叶片瞬时表达及稳定遗传转化,结合GUS组织化学染色对其进行功能鉴定.【结果】电泳图表明为1条长约2 500bp的特异扩增条带,瞬时表达和稳定遗传表达的烟草叶片的GUS组织化学染色结果均显示gus基因在转化烟草叶片中高效表达,并且低于阳性对照,非转化烟草叶片中无表达.【结论】成功克隆到sgt3基因起始密码子上游2392bp的启动子序列并且该启动子具有活性.     

小麦HMW-1Bx17基因启动子的功能验证

[目的]小麦HMW-1Bx17基因是在小麦胚乳中特异高表达的基因,该基因启动子的获得可为进一步研究小麦高分子量麦谷蛋白种子特异表达的调控模式提供基础材料,并为小麦品质改良的基因工程研究奠定基础。[方法]本文以改良的CTAB法提取小麦"舜麦1718"基因组DNA为模板,根据已知序列设计引物,利用嵌套PCR扩增1Bx17基因启动子片段。构建1Bx17基因启动子启动下的GUS(β-葡糖苷酸酶)基因表达载体,用基因枪法分别导入小麦根、茎、叶、胚乳及胚中进行瞬时表达,同时构建了1Bx17基因启动子驱动的抗菌蛋白Gnk2-1基因表达载体用于小麦幼胚稳定转化。[结果]X-gluc染色检测表明,GUS基因在该启动子的驱动下能在小麦胚乳中特异表达。通过对再生抗性植株的RT-PCR鉴定,初步表明已获得转基因植株,并进一步证明了启动子的驱动功能。[结论]本文所获得小麦1Bx17基因的启动子在小麦基因工程遗传改良等方面具有一定的利用潜力。