SIRT1基因对猪卵巢颗粒细胞凋亡因子表达量的影响

为探究SIRT1基因在猪卵巢颗粒细胞凋亡中的作用机制,采用荧光定量PCR方法检测不同浓度白藜芦醇和尼克酰胺处理的颗粒细胞中SIRT1基因的表达规律性,以及凋亡相关因子基因Bax、Caspase-3、Bcl-2表达量的变化,采用SPSS统计分析SIRT1基因与凋亡相关因子表达量的相关性。结果表明,一定浓度的白藜芦醇和尼克酰胺能调节猪卵巢颗粒细胞中SIRT1基因表达;SIRT1基因的表达与Bax、Caspase-3的表达呈正相关,相关系数分别为0.664和0.815;SIRT1基因的表达与细胞凋亡因子基因Bcl-2的表达相关性不显著。说明SIRT1基因可通过影响线粒体信号通路中凋亡因子的表达参与猪卵巢颗粒细胞凋亡的调控。     

去乙酰化酶SIRT1过表达对猪卵巢颗粒细胞中AMPK活性的影响

构建猪SIRT1基因全长编码区(coding region sequence,CDS)的真核表达载体,转染猪原代卵巢颗粒细胞,探讨SIRT1基因过表达对猪卵巢颗粒细胞中AMPK基因的转录及其蛋白活性的影响。测序结果表明,猪SIRT1基因的CDS区全长大小为2 229 bp,与NCBI发布的猪SIRT1基因m RNA序列(EU030283.2)一致;转染p EGFP–C1–SIRT1载体的颗粒细胞中SIRT1的m RNA表达水平和蛋白表达水平极显著高于空载体对照组(P0.01);p EGFP–C1–SIRT1转染组细胞中,AMPK–α1和AMPK–α2基因的m RNA表达量显著高于空载体对照组,且细胞中AMPKαThr172位点的磷酸化水平显著升高(P0.05)。结果表明,体外培养的原代猪卵巢颗粒细胞中的SIRT1基因过表达使AMPK的表达显著增加,影响AMPK的活性,推测SIRT1可能通过AMPK在猪卵巢颗粒细胞凋亡过程中发挥重要的调控作用。     

去乙酰化酶SIRT1基因在猪不同发育阶段卵泡颗粒细胞中的表达规律研究

【目的】分析去乙酰化酶SIRT1基因在猪不同发育阶段卵泡颗粒细胞中的表达规律,为进一步了解SIRT1基因在猪卵泡发育中的调控机制奠定基础。【方法】采集猪卵巢,分离卵泡颗粒细胞,根据直径将其分为≤1.5mm,1.5~≤3.0mm,3.0~≤5.0mm,5.0mm 4个组,利用免疫组织化学方法分析SIRT1蛋白在不同发育阶段卵泡颗粒细胞中的表达定位,利用qRT-PCR和Western blotting方法分析SIRT1基因在不同直径卵泡颗粒细胞中mRNA和蛋白的表达量。【结果】SIRT1蛋白在不同发育卵泡颗粒细胞中均有表达,随着卵泡的发育,SIRT1蛋白表达量逐渐升高,其在原始卵泡中表达量最低,在其余卵泡中表达量较高。SIRT1mRNA及其蛋白在不同直径的卵泡中表达趋势一致,在直径1.5~≤3.0mm卵泡中的表达量极显著高于其他直径卵泡(P0.01)。【结论】SIRT1基因在不同卵泡中的表达具有规律性,与猪卵巢卵泡发育具有潜在的相关性。     

猪卵巢颗粒细胞中SIRT1基因表达量对卵泡闭锁的影响

SIRT1是一种二氢尿嘧啶脱氢酶(NAD)依赖的具有去乙酰化酶活性的多功能转录调节因子.本研究分析不同闭锁阶段卵泡颗粒细胞中SIRT1基因表达规律性,探讨SIRT1基因表达量与卵泡发育的关系.采用免疫组织化学方法分析SIRT1蛋白表达定位,qRT-PCR方法分析SIRT1 mRNA表达量.结果表明,SIRT1蛋白在晚期闭锁卵泡中最高,健康卵泡中最低,SIRT1 mRNA表达规律性与SIRT1蛋白表达规律性一致.综合分析,颗粒细胞中SIRT1基因随着卵泡的闭锁表达量逐渐升高,SIRT1表达与猪卵巢卵泡发育存在一定相关性.     

去乙酰化酶SIRT1在猪不同组织中的表达规律性分析

[目的]分析去乙酰化酶SIRT1在猪不同组织中的表达规律性,为研究猪SIRT1基因功能奠定基础.[方法]采用RT-PCR和Western blotting方法检测猪脑、肝脏、胰脏、脂肪、卵巢、肾脏、心脏、脾脏等组织中SIRT1基因mRNA和蛋白的表达量.[结果]在猪脑、肝脏、胰脏、脂肪、卵巢、肾脏、心脏、脾脏等组织中均有SIRT1 mRNA和蛋白表达,且以卵巢组织中的表达量最高,心脏中的表达量最低.[结论]去乙酰化酶SIRT1在猪不同组织中的表达具有一定规律性,可能与猪的脂肪代谢和繁殖活动密切相关,直接或间接调节猪的能量代谢和生殖活动.     

CTNNB1对猪卵巢颗粒细胞的调控

【目的】卵巢颗粒细胞的增殖和分化是原始卵泡生长启动的关键因素,卵巢颗粒细胞过度凋亡是卵泡闭锁的主要原因,因此卵巢颗粒细胞的功能对卵泡生长发育、排卵、激素分泌等至关重要。研究通过探究连环蛋白β1（catenin beta 1, CTNNB1）对猪卵泡发育过程中颗粒细胞的增殖、凋亡及类固醇激素分泌等功能的影响,为猪卵泡发育的分子调控机制研究提供参考。 【方法】利用RNA抽提、实时定量PCR（Quantitative real time PCR, qRT-PCR）等方法,构建CTNNB1在母猪卵巢、肌肉、大脑等9个组织的表达谱;检测母猪性成熟过程中卵巢组织和小（≤3 mm）、中（3—6 mm）、大（≥6 mm）卵泡颗粒细胞中CTNNB1的表达情况。构建CTNNB1的真核表达载体及合成siRNA,转染至猪卵巢颗粒细胞,采用EdU、Annexin V- FITC/PI双染、ELISA等方法,检测CTNNB1对颗粒细胞增殖、凋亡、类固醇激素分泌的影响,以及对类固醇激素合成通路重要基因转录表达的影响。【结果】与肌肉、大脑等组织相比,CTNNB1在卵巢中mRNA表达水平最高。性成熟母猪卵巢中CTNNB1转录水平显著高于性成熟前和性成熟后的母猪;卵巢卵泡中CTNNB1转录和蛋白水平随卵泡发育明显上调;且卵巢颗粒细胞中CTNNB1转录和蛋白水平也随卵泡的发育逐渐上调。更重要的是,CTNNB1显著促进颗粒细胞增殖,抑制颗粒细胞凋亡;CTNNB1能够上调CYP1A1和HSD17B7的转录水平,下调CYP11A1、ESR1、ESR2、FSHR、LHR和NR5A1等类固醇激素合成相关基因的转录水平,进而促进颗粒细胞雌激素的分泌,抑制颗粒细胞雄激素和孕激素的分泌。【结论】本研究证实CTNNB1可能通过促进颗粒细胞增殖及雌激素的合成和分泌,抑制颗粒细胞凋亡及雄激素、孕激素的合成和分泌,进而促进卵泡的生长发育。     

白血病抑制因子（LIF）及其受体在月经 周期猕猴卵巢内的表达

应用免疫细胞化学方法对白血病抑制因子(leukemiainhibitoryfactor,LIF)、白血病抑制因子受体(leukemiainhibitoryfactorreceptor,LIFR)和gp130在月经周期猕猴卵巢内的表达进行了研究。结果表明:LIF、LIFR和gp130在猕猴卵巢内的表达量随月经周期的不同而变化,LIF及其受体在增殖期卵巢内的表达量高于分泌期的卵巢。LIF及其受体在原始卵泡、腔前卵泡和有腔卵泡的卵细胞内表达量均较高,在颗粒细胞、卵泡膜、卵巢生殖上皮和卵巢基质中有少量表达,而在闭锁卵泡、退化的黄体和卵巢髓质中未见表达。LIF及其受体在猕猴卵巢内的表达可能受卵巢分泌的类固醇激素所调控,LIF可能通过自分泌或旁分泌的方式在猕猴卵泡发育及排卵等过程中起重要作用。     

GnIH对母猪生殖调控的研究

【目的】研究促性腺激素抑制激素(GnIH)mRNA在母猪组织器官中的分布,不同剂量GnIH对母猪卵巢类固醇激素合成和细胞增殖相关蛋白表达的影响,及GPR147与GnRH的形态学关系。从分子、细胞水平和形态学角度,探讨GnIH在下丘脑-垂体-性腺轴对母猪生殖调控的作用机制,丰富神经内分泌学的内容。【方法】以30日龄健康仔母猪为研究对象,采用半定量RT-PCR方法研究GnIH mRNA在母猪24个组织中的分布定位。采集青年母猪卵巢样品,分离卵巢颗粒细胞,研究不同剂量GnIH(10-6、10-8、10-10和10-12 mol·L-1)对体外培养的母猪卵巢颗粒细胞类固醇激素(雌二醇,孕酮)的合成、细胞增殖相关蛋白(cyclin B1,PCNA)表达的影响。取30日龄健康仔母猪下丘脑,制作脑片,采用荧光双标记,激光共聚焦显微镜观察拍照分析GPR147与GnRH的形态学关系。【结果】GnIH mRNA主要在母猪的中枢神经系统中表达,尤其是在间脑表达含量最高。在外周组织,如子宫、卵巢、垂体中也有一定量表达。不同剂量的GnIH作用于体外培养的卵巢颗粒细胞,其中10-6和10-10 mol·L-1 GnIH能极显著地抑制雌二醇的分泌(P0.01),但不同剂量的GnIH对孕酮分泌的影响并不显著。GnIH能极显著地抑制卵巢增殖相关蛋白PCNA和cyclin B1的表达(P0.01)。此外,激光共聚焦结果显示GPR147与GnRH在下丘脑室旁核及视前区存在密切联系。【结论】GnIH可在下丘脑水平通过其受体直接作用于GnRH神经元,影响GnRH的合成和分泌,进而在中枢水平调控母猪的生殖活动。在外周生殖器官中,GnIH可通过影响卵巢激素的分泌和细胞增殖相关蛋白的表达参与母猪的生殖调控。     

猪NR4A1基因的克隆、序列分析及表达模式研究

【目的】克隆猪核受体4A1(Nuclear receptor subfamily 4,group A,member 1,NR4A1)DNA序列全长,并对CDS序列及其表达模式进行分析。【方法】以未成年长大母猪的卵巢为材料,采用电子克隆技术,对猪NR4A1DNA序列进行分离和测序,并对猪NR4A1基因序列进行生物信息学分析;利用性腺激素(人绒毛膜促性腺激素(Human chorionic gonadotropin,HCG)和孕马血清促性腺激素(Pregnant mare serum gonadotropin,PMSG))处理卵巢颗粒细胞,采用RT-PCR方法分析猪NR4A1基因的表达模式。【结果】获得猪NR4A1基因4 870bp的DNA序列,其中CDS全长序列为1 734bp,共编码572个氨基酸;猪NR4A1基因编码的氨基酸序列与人的对应氨基酸序列的相似性最高(97%),其次为小鼠(94%);Expasy软件预测结果表明,NR4A1蛋白的氨基酸序列非常保守,其中包含2个锌指特征(NR C4-type),一个是激素受体超家族,另一个是Zf-C4超家族;猪卵巢颗粒细胞在性腺激素处理后,可诱导猪NR4A1基因在卵泡发育和排卵时期瞬时表达。【结论】猪NR4A1基因的CDS区在物种间保守性较强,推测猪NR4A1基因调节卵泡的发育和排卵过程。     

外源性亚精胺对鼠卵巢生殖激素受体基因表达的影响

为探讨外源性亚精胺对鼠卵巢生殖激素受体基因表达的影响,采用不同质量分数(0.05、0.10和0.15 mg/g)亚精胺腹腔注射6周龄昆明鼠,24 h后采集卵巢组织样品,应用实时荧光定量聚合酶链式反应检测卵巢组织中促卵泡激素受体、促黄体生成素受体、雌激素受体1、雌激素受体2和雄激素受体基因表达量。结果显示:与对照组相比,0.05 mg/g亚精胺处理组卵巢促黄体生成素受体表达量显著高于对照组(P0.05),0.15 mg/g组促黄体生成素受体表达量显著低于对照组(P0.05);随亚精胺处理量的增加,卵巢组织中促卵泡激素受体、雌激素受体1、雌激素受体2和雄激素受体表达量均呈逐渐增加的趋势,且均在0.15 mg/g处理组中的表达量显著高于对照组(P0.05)。综上表明,亚精胺可通过介导鼠卵巢组织生殖激素受体基因表达来参与调控鼠卵巢功能。     

一种优化的猪卵泡颗粒细胞分离方法及验证

目前,进行体外研究的卵泡颗粒细胞主要通过抽取卵泡液的方式获得。而笔者前期研究发现,通过该方式获得的颗粒细胞贴壁率低且活力差。为解决该问题,在抽取方式的基础上采用FICOLL-Paque分离液对细胞进行进一步纯化,并通过CCK-8、Western Blot、免疫荧光染色、QRT-PCR、ELISA等方法分别对纯化细胞的形态、增殖能力、激素分泌相关受体(FSHR、LHCGR)和基因(CYP19A1、CYP11A1、StAR)的表达及激素分泌情况进行检测。结果发现,经纯化的细胞贴壁能力、细胞形态和增殖能力明显改善,且各激素分泌相关基因都有表达;E2分泌量明显提高,而P4分泌明显降低。研究结果表明,经FICOLL-Paque分离液纯化后的猪卵泡颗粒细胞中黄体化的颗粒细胞被大部分清除,纯化后的细胞活力更好且更能体现出颗粒细胞的特性。     

苏姜猪SIRT7基因组织表达定位分析

为深入分析去乙酰化转移酶Sirtuin 7(SIRT7)在苏姜猪不同脏器组织中的表达分布情况,采用实时荧光定量(RT-PCR)、酶联免疫吸附测定(ELISA)和免疫组织化学方法对苏姜猪11种脏器组织中SIRT7基因的表达分布进行研究。结果表明,SIRT7蛋白在所检测的组织样中均有表达,其中在胃和肠组织中表达量相对最高,显著高于其他组织(P<0.05);SIRT7蛋白主要分布于胃腺、大肠和小肠的腺细胞中,在心脏、腿肌、背最长肌和腹脂中的表达量相对最低,显著低于其他组织中表达量(P<0.05);在肺、肾和脾脏组织中,SIRT7蛋白主要分布于支气管上皮细胞、肺泡细胞、肾脏近远曲小管细胞、脾脏红髓区细胞;SIRT7基因在各脏器组织中mRNA和蛋白表达量间存在极显著正相关(P<0.01)。结果提示,SIRT7基因在苏姜猪组织中广泛表达,其转录和翻译水平存在极显著正相关,该基因功能主要与各脏器功能细胞的物质能量代谢和分泌功能有关。     

对母猪生殖调控的研究

【目的】研究促性腺激素抑制激素（GnIH）mRNA在母猪组织器官中的分布,不同剂量GnIH对母猪卵巢类固醇激素合成和细胞增殖相关蛋白表达的影响,及GPR147与GnRH的形态学关系。从分子、细胞水平和形态学角度,探讨GnIH在下丘脑-垂体-性腺轴对母猪生殖调控的作用机制,丰富神经内分泌学的内容。【方法】以30日龄健康仔母猪为研究对象,采用半定量RT-PCR方法研究GnIH mRNA在母猪24个组织中的分布定位。采集青年母猪卵巢样品,分离卵巢颗粒细胞,研究不同剂量GnIH（10^-6、10^-8、10^-10 和 10^-12 mol·L^-1）对体外培养的母猪卵巢颗粒细胞类固醇激素（雌二醇,孕酮）的合成、细胞增殖相关蛋白（cyclin B1,PCNA）表达的影响。取30日龄健康仔母猪下丘脑,制作脑片,采用荧光双标记,激光共聚焦显微镜观察拍照分析GPR147与GnRH的形态学关系。【结果】GnIH mRNA主要在母猪的中枢神经系统中表达,尤其是在间脑表达含量最高。在外周组织,如子宫、卵巢、垂体中也有一定量表达。不同剂量的GnIH作用于体外培养的卵巢颗粒细胞,其中10^-6和10^-10 mol·L^-1 GnIH能极显著地抑制雌二醇的分泌（P＜0.01）, 但不同剂量的GnIH对孕酮分泌的影响并不显著。GnIH能极显著地抑制卵巢增殖相关蛋白PCNA和cyclin B1的表达（P＜0.01）。此外,激光共聚焦结果显示GPR147与GnRH在下丘脑室旁核及视前区存在密切联系。【结论】GnIH可在下丘脑水平通过其受体直接作用于GnRH神经元,影响GnRH的合成和分泌,进而在中枢水平调控母猪的生殖活动。在外周生殖器官中,GnIH可通过影响卵巢激素的分泌和细胞增殖相关蛋白的表达参与母猪的生殖调控。     

甲状腺素对猪卵巢卵泡颗粒细胞类固醇激素合成及增殖的影响

[目的]本试验旨在探究甲状腺素对猪卵巢卵泡颗粒细胞类固醇激素合成功能以及增殖的影响。[方法]首先采用免疫组化法鉴定甲状腺素受体(TRα/β)在猪卵巢组织的表达情况,随后体外培养猪卵巢原代颗粒细胞,选取低(10-8mol·L~(-1))、中(10-7mol·L~(-1))、高(10-6mol·L~(-1))3种浓度的甲状腺素(T4)孵育24 h,采用酶联免疫法检测细胞培养液中孕酮(P4)和雌二醇(E2)水平,并采用蛋白印迹法检测颗粒细胞内激素合成相关酶蛋白(3β-HSD、CYP19)的表达情况。采用MTT法检测各浓度甲状腺素对细胞活力的影响,利用增殖细胞核抗原(PCNA)免疫荧光染色验证不同浓度甲状腺素对颗粒细胞增殖的影响。[结果]免疫组化结果显示:TRα/β在猪卵巢不同发育阶段卵泡的颗粒细胞、膜细胞中有广泛表达,在卵母细胞的胞质中也有分布,在闭锁卵泡中也见明显表达。猪卵巢原代颗粒细胞经甲状腺素处理后,细胞培养液中的孕酮和雌激素水平都显著低于空白对照组(P0.05),并且各剂量处理组间孕酮呈现出剂量依赖性降低趋势;雌激素在低浓度和高浓度甲状腺素处理组较中浓度处理组高。蛋白免疫印迹结果显示:与对照组相比,3β-HSD和CYP19蛋白在较高浓度甲状腺素(10-7和10-6mol·L~(-1))处理组的表达量均显著降低(P0.05);而在低浓度甲状腺素(10-8mol·L~(-1))处理组,CYP19蛋白表达量显著降低(P0.05),但3β-HSD蛋白表达无显著差异。此外,MTT细胞毒性和增殖试剂盒检测结果显示:不同浓度甲状腺素处理并不影响细胞活力,这与PCNA免疫荧光强度统计结果一致,进一步证实了甲状腺素对原代颗粒细胞增殖没有影响。[结论]甲状腺素能够作用于卵巢颗粒细胞,干扰类固醇激素的合成,其作用机制可能是通过改变激素合成相关蛋白3β-HSD和CYP19的表达来完成的。而甲状腺素对颗粒细胞激素合成的干扰效应并不影响细胞增殖状态。     

高、低产双黄蛋高邮鸭卵巢结构及生殖激素和相关基因差异

为从组织学、生化指标及分子水平研究双黄蛋高、低产高邮鸭卵巢结构、生殖激素和繁殖关键基因的差异性,选择双黄蛋高、低产高邮鸭各6只,测定静脉血中相关激素含量,采用q RT-PCR技术检测下丘脑、垂体、肝脏以及卵巢组织中相关基因的表达,并对卵巢组织切片进行HE染色和FSHR免疫组化染色,观察卵巢形态结构。结果表明,高邮鸭双黄蛋高、低产组卵巢形态结构有显著差异,高产组卵巢卵泡发育良好,内外膜分界明显,颗粒细胞排列紧密;低产组卵巢卵泡发育不良,颗粒细胞松散。高产组血清中促卵泡素(FSH)、雌二醇(E2)和孕酮(P)水平显著高于低产组(P0.01)。q RT-PCR结果显示,高、低产高邮鸭下丘脑、垂体及肝脏中生殖激素受体基因FSHR、ERβ和Gn RHR的m RNA表达存在极显著性差异(P0.01),而在卵巢中差异不显著。可见,双黄蛋高、低产高邮鸭的卵巢结构存在显著差异,下丘脑、垂体以及肝脏是调控高邮鸭双黄蛋产蛋性能的重要因素。     

高产与低产蛋鸡卵巢和卵泡及相关基因的表达差异

[目的]以东乡绿壳蛋鸡为研究对象,从形态学和分子水平上探究高低产蛋鸡卵巢和卵泡的差异。[方法]选择高产组、低产组东乡绿壳蛋鸡各10只,采集静脉血,测定相关激素含量;屠宰采集卵巢组织,制作组织切片,观察卵巢形态结构;提取卵巢组织RNA,分别测定高产与低产蛋鸡卵巢中的细胞增殖凋亡基因、生殖调控相关转录因子基因、类固醇激素合成关键酶基因和相关激素受体基因的表达量。[结果]高产与低产蛋鸡卵巢和卵泡在形态上有明显差别:高产蛋鸡卵巢体积大,卵泡丰富,细胞排列紧密;低产蛋鸡卵巢、卵泡发育不良,细胞松散。高产蛋鸡血清中促卵泡激素(FSH)、孕酮和雌二醇水平均显著高于低产蛋鸡(P0.05)。实时定量PCR检测结果显示:在高产蛋鸡中翼状螺旋/叉头转录因子2(FOXL2)、转录因子GATA家族4基因(GATA4)和B淋巴细胞瘤2基因(Bcl2)表达显著上调(P0.05),且在高产蛋鸡卵巢中激活素受体1(ACVR1)和增殖细胞核抗原基因(PCNA)表达量极显著高于低产蛋鸡(P0.01),但细胞色素P450家族11A1基因(CYP11A1)表达量显著低于低产组(P0.05)。[结论]血清中生殖激素含量以及FOXL2、GATA4、Bcl2、ACVR1、PCNA和CYP11A1基因表达的差异是影响鸡产蛋性能高低的重要因素。     

猪卵泡期中等卵泡发育和闭锁的相关基因表达及激素水平分析

研究猪卵泡期内有腔卵泡发育和闭锁中颗粒细胞自噬与凋亡、卵泡内调控因子、类固醇激素及相关酶类的变化,为提高排卵前卵泡发育数量提供理论依据。从猪卵泡期卵巢中分离3~5 mm有腔卵泡,根据发育变化分为健康卵泡、早期闭锁和晚期闭锁3类,应用HE染色观察内部形态结构变化,应用酶免法检测卵泡液中雌二醇(E2)和孕酮(P4)的浓度变化,采用Real-time PCR方法检测自噬相关基因(Becline、LC3B、ATG3、ATG5、ATG7)、凋亡相关基因(Caspase-3、Bim、Bcl-2和Bax)、类固醇合成酶基因(CYP11A1、3βHSD、CYP17A1、CYP19A3)、激素受体和卵泡内关键调控基因(FSHR、ERα、CART、SMAD4)在不同类型卵泡中的表达变化。结果表明,健康卵泡中颗粒细胞层完整,有少量凋亡细胞,早期和晚期闭锁卵泡中颗粒细胞层分散,且凋亡细胞明显增多。早期和晚期闭锁卵泡中P4/E2显著高于健康卵泡,自噬和凋亡相关基因的表达水平在早期和晚期闭锁的卵泡中显著高于健康卵泡,类固醇合成酶基因CYP11A1和3βHSD的表达量在早期和晚期闭锁卵泡中显著高于健康卵泡,CYP17A1、CYP19A3、FSHR、ERα和SMAD4的表达量在早期和晚期闭锁卵泡中显著低于健康卵泡,而CART的表达量则呈现相反的趋势。由此可见,颗粒细胞自噬和凋亡是卵泡闭锁的主要诱因,而类固醇合成酶基因CYP11A1和3βHSD通过提高卵泡液中孕酮的水平加速了卵泡闭锁的进程。     

干扰KISS1基因对猪卵巢颗粒细胞功能的影响

【背景】卵泡是卵巢的基本结构和功能单位,其主要功能是排卵和分泌激素。颗粒细胞能促进卵泡发育,其过度凋亡能抑制卵泡发育,诱导卵泡闭锁,进而降低雌性动物发情频率,影响雌性动物繁殖力。现已有研究发现,KISS1在卵巢组织中发挥着重要作用。【目的】研究通过干扰KISS1,以阐释KISS1对猪卵巢颗粒细胞凋亡、周期及分泌雌激素能力的影响,为完善KISS1在猪颗粒细胞中的分子调控机制提供一定的依据。【方法】设计KISS1的干扰片段KISS1-siRNA,转染体外培养的母猪卵巢颗粒细胞,通过实时定量PCR（quantitative real time PCR, qRT-PCR）检测干扰KISS1对母猪卵巢颗粒细胞中磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase, PI3K）信号通路部分基因转录水平的影响;采用流式检测法、Annexin V- FITC及ELISA技术,分别探究干扰KISS1对颗粒细胞周期、凋亡及雌二醇（estradiol, E₂）分泌量的影响,最后使用qRT-PCR技术检测KISS1对雌激素受体及雌激素信号通路关键基因转录水平的影响。【结果】在猪颗粒细胞内,干扰KISS1后,PI3K通路激活相关基因PIK3CG、PI3CI、PDK1及AKT1转录水平下降,其中关键基因AKT1的转录水平显著降低（P<0.05）,PI3K通路激活抑制相关基因FOXO3、TSC2及BAD转录水平也有所降低;干扰KISS1后,颗粒细胞周期在细胞分裂间期（G0/ G1）阻断,细胞的凋亡率显著上升,细胞中E₂的浓度显著降低（P<0.01）,雌激素受体ESR1和ESR2及雌激素通路的基因Star、CYP17、3B-HSD、17B-HSD和CYP19A转录水平也相应显著下降（P<0.05）。【结论】KISS1能够参与猪颗粒细胞PI3K和雌激素通路,干扰KISS1能够使卵巢颗粒细胞阻滞在细胞分裂间期,促进颗粒细胞凋亡,降低颗粒细胞分泌雌激素的能力,表明KISS1对于卵巢颗粒细胞的分裂与生长、雌激素分泌具有重要作用。     

LKB1基因对卵巢颗粒细胞类固醇激素生成相关基因的调控作用

【背景】颗粒细胞类固醇激素的合成能力对卵泡发育及成熟具有重要作用,但其关键的调控因子尚不完全清楚。笔者前期的研究表明肝激酶B1（liver kinase B1,LKB1）基因参与细胞的脂类代谢,类固醇激素的合成与脂类代谢密切相关,并且有研究结果亦显示LKB1敲除可引起小鼠卵巢早衰,表明LKB1对维持卵巢的功能很关键,其在颗粒细胞的确切功能需要进一步研究。【目的】探究LKB1在牛卵泡中的表达模式及其对颗粒细胞类固醇激素生成相关基因的调控作用, 为母牛繁殖生理调控研究提供理论依据。【方法】采用免疫组织化学染色对LKB1蛋白在卵泡中进行定位研究;同时分离培养牛原代颗粒细胞,并以促卵泡素受体（follicle stimulating hormone receptor, FSHR）蛋白作为标记基因,细胞免疫荧光染色鉴定颗粒细胞及纯度;然后以原代颗粒细胞为模型,采用siRNA沉默LKB1的技术,利用qRT-PCR方法检测LKB1功能缺失对类固醇激素合成相关基因表达的影响,另一方面采用腺病毒过表达LKB1,qRT-PCR和ELISA技术验证LKB1对类固醇激素合成相关基因表达的调控作用及雌二醇分泌。【结果】 1) LKB1蛋白在卵泡中的细胞均表达,但颗粒细胞的染色信号强于膜细胞,进一步的定量分析显示颗粒细胞的表达量显著高于卵泡膜细胞。2) 分离培养的牛原代卵泡颗粒细胞贴壁生长、细胞形态多呈圆形,能被颗粒细胞标志基因FSHR抗体标记。3) RNAi技术能显著抑制LKB1的表达。与对照相比,siRNA1和siRNA2干扰LKB1的效率分别为48% (P<0.05)和52% (P<0.05);沉默LKB1显著降低颗粒细胞类固醇激素合成基因 STAR (P<0.01)、CYP11A1 (P<0.01)和CYP19A1 (P<0.05)的表达,分别下调了约为对照组的60%、80%和50%。4) LKB1过表达腺病毒及对照组对颗粒细胞均具有高的感染效率,LKB1过表达效率高达10倍（P<0.01）;过表达LKB1显著上调STAR (P<0.01)、CYP11A1 (P<0.01)和CYP19A1 (P<0.05)的表达,进一步研究显示LKB1基因功能获得促进颗粒细胞雌二醇的分泌（P<0.05）。【结论】LKB1在卵泡颗粒细胞中高表达,促进类固醇激素生成基因STAR 、CYP11A1和CYP19A1的表达和雌二醇的分泌。本研究将为LKB1调控牛颗粒细胞类固醇激素合成的功能提供直接的理论依据。     

母猪健康和闭锁卵巢有腔卵泡的转录组测序比较分析

[目的]本文旨在通过对猪卵泡颗粒细胞进行转录组测序了解卵泡闭锁相关基因的表达谱并确定闭锁卵泡的潜在分子标记物。[方法]通过HE染色对卵泡及颗粒细胞进行形态学观察；抽取健康卵泡和晚期闭锁卵泡的颗粒细胞，进行转录组测序分析，最后采用实时荧光定量PCR检测差异表达基因的相对表达水平。[结果]转录组数据表明，与闭锁卵泡颗粒细胞相比，健康卵泡颗粒细胞中有771个差异基因，其中204个为上调基因，567个为下调基因；GO功能富集分析显示，差异基因显著富集到320个生物进程中，主要与细胞增殖和血管生成有关；KEGG通路分析表明，差异基因富集到48条信号通路中，主要参与氧化应激、激素合成和能量代谢等方面的信号通路；实时荧光定量PCR结果表明，CYP1B1、PDE10A、NUPR1、NOX4、LDLR、LHCGR和CYP19A1表达趋势与测序结果一致。[结论]氧化应激、血管生成、能量代谢以及激素合成等多方面因素综合调控猪卵巢中颗粒细胞的凋亡，继而影响卵泡闭锁现象的产生。