桑粉虱种特异性引物筛选

【目的】桑粉虱Pealius mori(Takahashi)与其他种类粉虱形态相似,识别困难。设计、筛选桑粉虱种特异性引物,为桑粉虱检测和鉴定提供理论依据。【方法】DNAMAN软件比较与桑粉虱同源性较高的国内外具有代表性的7种粉虱线粒体COⅠ基因序列,应用Primer 5.0软件设计5对桑粉虱COⅠ基因特异性引物。将各对引物与不同种类粉虱成虫基因组DNA模板进行PCR扩增,检测目的条带,筛选桑粉虱种的特异性引物。以桑粉虱的卵和幼虫基因组DNA为模板,验证所筛选出的桑粉虱种特异性引物的灵敏性。【结果】2对桑粉虱种特异性引物sfs1-1/sfs1-2、sfs5-1/sfs5-2对桑粉虱单头成虫基因组DNA的PCR扩增产物分别为450、300 bp,而对烟粉虱B型、温室白粉虱无扩增效果。2对引物对桑粉虱DNA模板浓度最低检测值分别为0.15 pg/μl、0.15 ng/μl。引物sfs1-1/sfs1-2灵敏性较引物sfs5-1/sfs5-2高1000倍。2对引物对桑粉虱成虫、幼虫及卵粒的线粒体COⅠ基因皆具较好扩增能力。【结论】引物sfs1-1/sfs1-2、sfs5-1/sfs5具桑粉虱种的特异性,引物sfs1-1/sfs1-2为桑粉虱检测、鉴定的首选引物。     

应用种特异性ITS引物(SS-ITS)鉴别新菠萝灰粉蚧

[目的]研究新菠萝灰粉蚧的种特异性ITS引物,以快速准确鉴定该虫,可为口岸快速通关提供依据.[方法]采用PCR扩增方法,首次测定分析了11种粉蚧39个样品的新菠萝灰粉蚧及其他粉蚧的rDNA ITS全序列.基于ITS区序列差异设计了针对新菠萝灰粉蚧的特异性引物,通过筛选引物退火温度、优化PCR反应条件建立了新菠萝灰粉蚧的快速分子鉴定方法.[结果]种特异性ITS引物只对新菠萝灰粉蚧有扩增条带,能有效扩增出约665 bp的DNA片段,其余种类均未有扩增条带.灵敏度试验结果显示该对引物灵敏度高,其检测限可达0.1 ng/μL.[结论]采用设计的ITS区种特异性引物可以对新菠萝灰粉蚧进行快速分子鉴定,该方法可为口岸一线检测鉴定提供参考.     

桑园及周边不同寄主植物粉虱种群鉴定

[目的]了解桑园及周边不同寄主植物粉虱类害虫种类、分布,为桑园粉虱生物学基础研究及提高综合防控技术提供理论依据.[方法]在粉虱发生季节,采集云南蒙自市草坝镇桑园及周边的桑树、薄荷、丝瓜、辣椒、黄瓜、青菜、假柿木姜子等7种寄主植物上危害的粉虱样本,分别提取其基因组,利用线粒体mtDNA COⅠ基因片段标记,截取其代表序列679bp片段与国内外代表性粉虱相应序列进行比对分析,鉴定危害不同寄主植物的粉虱种类.[结果]辣椒(LJ)、薄荷(BH)、丝瓜(SG)、青菜(QC)为寄主的粉虱种群与烟粉虱B型间遗传距离小于0.003,同源性大于97%,聚为同一发育分支;黄瓜(HG)、假柿木姜子(JSM)为寄主的粉虱出现种群分化:JSM1、HG2与烟粉虱B型间遗传距离为0.002,同源性为98%,并聚为同一分支,JSM2、HG1与温室白粉虱同源性为100%,并聚为同一分支;桑粉虱与各比对粉虱的遗传距离在0.234~1.372,桑粉虱作为独立分支存在.[结论]桑粉虱只危害桑树;桑园周边的辣椒、薄荷、丝瓜、青菜植株上粉虱种群皆为烟粉虱B型,而黄瓜、假柿木姜子植株上的粉虱为烟粉虱B型与温室白粉虱,两者混合危害.     

天敌对烟粉虱捕食作用的SCAR标记检测

 以烟粉虱和捕食性天敌为研究对象，采用特征序列扩增区域（SCAR）标记法，通过对目的片段的克隆与测序设计烟粉虱特征片段扩增引物，检验该引物的种、虫态及性别特异性，并利用该引物检测捕食性天敌对棉田烟粉虱的捕食作用。研究结果表明，利用SCAR标记法获得了长度为347 bp的烟粉虱特异性片段（GenBank登录号为AY841800），根据此片段的碱基序列设计烟粉虱特异引物1对TB-F/TB-R 94585, 其扩增片段约为240 bp；种特异性检验结果表明，该引物只对烟粉虱具有扩增能力，对温室粉虱及其它相关种类不具有扩增效果；同时该引物对不同虫态、不同性别的烟粉虱具有同样的扩增效应。田间检测结果表明，同种天敌昆虫幼体捕食作用检出率高于成虫；在所检测的4类群9种捕食性天敌中，龟纹瓢虫幼虫、异色瓢虫幼虫、草蛉幼虫及东亚小花蝽成虫和蜘蛛对烟粉虱捕食作用的检出率高于50%。     

[1]基于SCAR分子标记检测阿拉尔棉田烟粉虱捕食性天敌

为了明确阿拉尔垦区棉田烟粉虱种群隐种以及烟粉虱捕食性天敌种类,采集阿拉尔十二团棉田中的烟粉虱及烟粉虱捕食性天敌,利用B-F/B-R和Q-F/Q-R特异性引物通过PCR检测烟粉虱隐种类型,利用烟粉虱TB-F/TB-R 94585特异性引物检测捕食性天敌肠道内是否存在烟粉虱DNA。结果表明:新疆阿拉尔垦区烟粉虱为MED隐种,初步发现烟粉虱的捕食天敌涵盖4个目5个科7种,包括多异瓢虫Adonia variegata、多异瓢虫幼虫、东亚小花蝽Orius sauteri Poppius、中华通草蛉Chrysoperla sinica 幼虫、黄褐新园蛛Neoscone doenitzi、灌木新园蛛Neoscona adianta、直伸肖蛸Tetragnatha extensa。结论:利用SCAR分子标记技术可以快速检测阿拉尔垦区烟粉虱害虫捕食性天敌种类。     

基于种特异性PCR技术快速鉴定葡萄根瘤蚜

摘要：葡萄根瘤蚜是一种严重威胁葡萄生产的入侵性害虫。由于蚜虫类害虫种类多、体型微小、形态相似,难以快速准确地进行鉴别。文章以葡萄根瘤蚜为研究对象,以常见果树蚜虫为参照,采用基于线粒体DNA细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ基因的种特异性PCR方法,研究葡萄根瘤蚜的快速鉴定技术。利用mtDNA COI基因通用型引物LCO 1490/HCO 2198获得葡萄根瘤蚜及其他果树常见蚜虫的COI序列,根据测序结果设计1对种特异性SS COI引物（VitF269/VitR557）,扩增片段大小为308 bp。种特异性检验结果显示,该对引物仅对葡萄根瘤蚜的mtDNA COI基因具有扩增效果,其他5种蚜虫均没有扩增条带。     

基于种特异性线粒体细胞色素氧化酶I引物快速鉴定茄二十八星瓢虫和马铃薯瓢虫

【目的】茄二十八星瓢虫Henosepilachna vigintioctopunctata和马铃薯瓢虫Henosepilachna vigintioctomaculata都是茄科作物上的重要害虫,对茄科作物造成极大的经济损失。这2种瓢虫由于外形非常相似,无法通过体表特征区分,因此很有必要开发一种准确且快速的区分方法。【方法】基于这2种瓢虫线粒体细胞色素氧化酶I(Mitochondrial cytochrome oxidase I, mtCOI)的物种特异性,利用种特异性(Species-specific,SS)PCR引物建立了一种分子鉴定技术,即以茄二十八星瓢虫和马铃薯瓢虫之间的mtCOI基因序列变异为基础,设计了2对SS-mtCOI引物Hvp和Hvm。【结果】用这2对引物进行PCR扩增,均出现物种特异性扩增现象。在不同的DNA质量浓度下对该SS-mt COI引物进行敏感性检测,结果表明,Hvp引物在茄二十八星瓢虫DNA质量浓度为3.13 mg/L时仍可检测到扩增条带,Hvm引物在马铃薯瓢虫DNA浓度为2.43 mg/L时仍能检测到扩增条带。此外,Hvp和Hvm引物也能准确鉴定马铃薯瓢...     

西南地区主要粉虱害虫的分布与危害

为查明西南地区粉虱的发生及危害情况,掌握其发生现状及发展趋势,及时制定有效的防治措施,2008~2009年首次系统地调查了西南地区主要粉虱害虫的分布与危害。结果表明,西南地区粉虱害虫主要有烟粉虱、温室粉虱、桑粉虱和黑刺粉虱,4种粉虱的寄主植物达37科120种(变种),根据寄主植物上粉虱的数量将粉虱的危害程度划分为4个不同的等级,并做了4种粉虱的分布图。     

猪瘟病毒基因芯片检测技术的建立与应用

应用寡聚核苷酸基因杂交技术建立一种快速可靠的检测猪瘟病毒的方法.在CSFV病毒保守序列5′非编码区设计了两对特异性引物,在此引物之间设计了特异的核苷酸探针(22～30 mer).通过PCR扩增Cy5标记的DNA片段与固定在玻片表面的探针杂交进行CSFV检测.该技术结合了PCR方法的高度敏感性和DNA-DNA杂交技术的选择特异性.并利用该方法对87例临床样品进行了检测鉴定,结果分析显示,可准确鉴别CSFV病毒,灵敏度与琼脂糖凝胶检测接近,可检测到的质粒最低浓度为0.4 pg/μl.结果表明寡核苷酸基因芯片技术可有效地应用于CSFV临床诊断和分子流行病学调查.     

玉米孢囊线虫SCAR-PCR快速分子检测技术

【目的】 玉米孢囊线虫（Heterodera zeae）为孢囊线虫属定居型半内寄生线虫,可侵染多种禾本科作物的根部,玉米孢囊线虫的发生和传播扩散将会对我国玉米生产造成严重威胁。本研究旨在建立玉米孢囊线虫的快速分子检测体系,以期从近缘属种可以准确地检测出玉米孢囊线虫,为玉米孢囊线虫的监测预警和防控打下技术基础。【方法】 从我国河南、河北、甘肃、山东、湖南、广西和北京共收集20个玉米孢囊线虫近缘属种群体作为供试线虫;选取13条含有10个碱基的随机引物,采用RPAD技术对供试孢囊线虫进行多态性分析,筛出玉米孢囊线虫特异性RPAD片段,并将其转化为玉米孢囊线虫SCAR-PCR引物;采用PCR方法测试玉米孢囊线虫特异性引物的准确性以及检测技术体系的稳定性、灵敏度和实效性。【结果】 通过RAPD比对分析,发现随机引物OPA03能在玉米孢囊线虫基因组DNA中扩增出一条468 bp的特异性片段;将该片段回收测序,根据片段序列信息,利用Primer 5.0设计一对特异性引物HzF1/HzR1;特异性检测结果表明,HzF1/HzR1仅在玉米孢囊线虫群体中扩增出大小为393 bp的特异性片段,其他5种16个孢囊群体（禾谷孢囊线虫、菲利普孢囊线虫、大豆孢囊线虫、旱稻孢囊线虫和甜菜孢囊线虫）和4个其他种群（水稻干尖线虫、马铃薯腐烂茎线虫、落选短体线虫和咖啡短体线虫）均没有扩增出目的条带;以含有玉米孢囊线虫的混合种群孢囊DNA为模板时,特异性引物HzF1/HzR1也能扩增出来单一明亮的393 bp的特异片段,而不含玉米孢囊线虫的混合种群不能扩增出该片段;该体系实现了玉米孢囊线虫准确、稳定的检测目的;对建立的玉米孢囊线虫快速检测技术体系灵敏度和实用范围测试,表明该检测体系对玉米孢囊线虫单个孢囊和单条幼虫均有灵敏的检测能力,检出值不低于1/2 000个孢囊和1/80条2龄幼虫。【结论】 本研究建立的玉米孢囊线虫SCAR-PCR快速分子检测技术,可用于玉米孢囊线虫单一样本和混合种群的快速检测,对玉米孢囊线虫的孢囊和2龄幼虫均有灵敏的检测能力,检测引物特异性强,检测方法便捷稳定,灵敏度高。     

线粒体DNA分子技术在斑点叉尾鮰物种鉴定中的应用

[目的]应对出口水产品国外技术贸易壁垒,建立一种能被国际上普遍接受的进出口水产品中斑点叉尾鮰物种真伪鉴定方法,该方法也有助于我国水产品行业商业欺诈认定裁决工作。[方法]采用酚-氯仿抽提法提取水产品中基因组DNA,利用自行设计的引物D-loop F/D-loopR,对斑点叉尾鮰及大口鲇、革胡子鲶、鲤和鲫等物种的线粒体DNA D-loop和COⅠ区进行PCR扩增测序比对,根据斑点叉尾鮰物种D-loop区的序列寻找其特异性酶切位点,对D-loop区进行酶切鉴定。[结果]]建立的DNA提取技术可以满足水产品中线粒体D-loop扩增的要求,斑点叉尾鮰D-loop对应的最佳退火温度为54.8℃,其在D-loop序列的200 bp处有一特异性酶切位点EcoRⅠ。[结论]建立的斑点叉尾鮰产品中DNA提取、扩增技术及EcoRⅠ特异性酶切图谱方法,不需测序就能够将斑点叉尾鮰与其他近似物种区分开来,该方法适于进出口水产品贸易中斑点叉尾鮰产品的物种真伪鉴定。     

陕西榆林地区马铃薯腐烂茎线虫的特异性分子鉴定

旨在对陕西榆林8个县区马铃薯腐烂茎线虫群体进行特异性分子鉴定,明确该地区线虫病害的种群类型,为马铃薯腐烂茎线虫病的快速诊断和及时防控提供理论依据。采用通用引物rDNA1/rDNA2和特异性引物DdS1/DdS2 (A型)、DdL1/DdL2(B型)进行基因扩增、测序、序列分析并构建系统发育树,对线虫种类进行鉴定。结果显示,陕西榆林8个采样点线虫病害种类均为马铃薯腐烂茎线虫B型,并且这8个地理种群的马铃薯腐烂茎线虫具有较高的亲缘关系。     

基于种特异引物(SS-COI)快速鉴定锈红果实蝇

[目的]开展不受虫态限制的实蝇快速鉴定技术研究.[方法]基于mtDNA COⅠ基因序列,筛选设计了一对能够准确鉴定锈红果实蝇的种特异性引物XF29和XR293,选用锈红果实蝇作为阳性对照,颜带实蝇B.cilifer(Hendel)、瘤胫实蝇B.tuberculata(Bezzi)等19种实蝇作为阴性对照,进行PCR扩增和电泳检测.[结果]仅阳性种锈红果实蝇在约265 bp的位置扩增出一条清晰且单一的条带,其余实蝇均未出现任何条带.[结论]采用SS-PCR技术,基于mtDNA COⅠ基因序列筛选设计的特异引物种特异性和稳定性强,可为进出境果蔬检疫、疫情早期预警和有效监测防治提供快速鉴定的依据.     

地衣芽孢杆菌16S-ITS标记及其特异性分析

[目的]建立地衣芽孢杆菌的分子鉴定方法。[方法]通过对地衣芽孢杆菌TS-01的16S和ITS序列进行克隆测序和差异性分析,以该区序列为靶序列设计地衣芽孢杆菌TS-01的特异性引物,并用该引物扩增全部受试菌种。[结果]从ITS和16S rDNA区间设计了地衣芽孢杆菌种特异性引物,特异性引物PCR的最佳退火温度为67.2℃,循环数为24个;地衣芽孢杆菌TS-01可扩增出1条905 bp的标记片段,其他受试菌株均为阴性,从而证明试验得到了在种水平上对该菌种进行准确鉴定的特异16S-ITS标记。[结论]地衣芽孢杆菌TS-01分子鉴定方法的建立,为地衣芽孢杆菌的分子诊断奠定了基础。     

一步法RT-PCR快速检测猪瘟病毒

对猪瘟病毒(CSFV)5'端非编码区保守序列设计了一对引物,建立了检测CSFV一步法反转录-聚合酶链(RT-PCR)方法,并对其特异性、敏感性进行了研究。该一步法RT-PCR对5株CSFV扩增结果均为阳性,对对照毒株扩增结果均为阴性;对CSFV检测的灵敏性为1.09×10-1ng总RNA量。以上结果表明该一步法RT-PCR特异性强、敏感性高、简便、快速,可用于猪瘟的早期确诊和病毒鉴定。     

地衣芽孢杆菌16S-ITS标记及其特异性分析

[目的]建立地衣芽孢杆菌的分子鉴定方法。[方法]通过对地衣芽孢杆菌TS-01的16S和ITS序列进行克隆测序和差异性分析,以该区序列为靶序列设计地衣芽孢菌TS-01的特异性引物,并用该引物扩增全部受试菌种。[结果]从ITS和16Sr DNA区间设计了地衣芽孢杆菌种特异性引物,特异性引物PCR的最佳退火温度为67.2℃,循环数为24个;地衣芽孢杆菌TS-01可扩增出1条905bp的标记片段,其他受试菌株均为阴性,从而证明试验得到了在种水平上对该菌种进行准确鉴定的特异16S-ITS标记。[结论]地衣芽孢杆菌TS-01分子鉴定方法的建立,为地衣芽孢杆菌的分子诊断奠定了基础。     

肉制品中驴源性成分PCR方法的建立及应用

建立了驴源性成分的快速分子检测方法,确立了1对驴源性成分的特异性引物HorseF/HorseR,扩增目的片段的长度是294 bp,经验证引物对驴源性成分的特异性良好,确立了PCR反应的最佳反应体系和最优反应条件。反应体系的检测灵敏度是13.7 pg/μL。扩增片段经AluⅠ酶切分析确认,所得181、113 bp片段与分析结果一致。利用该方法对市售样品进行检测,检测结果准确。     

云南马铃薯青枯病菌的PCR检测

利用针对马铃薯青枯病菌hrp基因族DNA序列设计合成特异性寡核苷酸引物（引物1：5‘GAAGAGGAACGACGGAAAGC-3‘和引物2：5‘CGAACAGCCCACAGACAAGA-3‘）,进行马铃薯青枯病菌PCR特异性扩增试验。该试验合成的引物能从马铃薯青枯病菌总基因组的DNA和细菌纯培养,以及人工接种和自然发病的马铃薯块茎中特异性扩增青枯病菌hrp基因区段1993bp的分子片段。该试验结果为马铃薯青枯病菌的鉴定、检测及病害流行学研究提供了新的技术的方法。     

福建省烟粉虱生物型鉴定

采用m tDNA分子标记技术以及西葫芦银叶测定方法,对从福建省8个具有代表性地理区域采集的烟粉虱样品进行生物型鉴定.结果表明:8个烟粉虱种群在m tDNA COⅠ基因720 bp片段序列上的所有位点都相同,它们与Texas-B、Israel-B、Ind ia-B、Morocco-B、France-B1、France-B2、Be ijing-B、Argentina-B、Reun ion-B1、Reun ion-B2、Reun ion-B3等11个B型烟粉虱种群在m tDNA COⅠ基因720 bp序列上的差异很小(序列相似性为99.6%-100%),总体上属于同一进化枝;与Morocco-Q、Colomb ia-A1、Colomb ia-A2烟粉虱种群在m tDNA COⅠ基因720 bp序列上差异较大,分别属于不同的进化枝;8个烟粉虱种群均可引起典型的西葫芦银叶症状.说明福建省8个烟粉虱种群均属于B生物型.     

ITS序列分析及其在植物真菌病害分子检测中的应用

近年来 ,利用 PCR扩增病原菌核糖体 ITS( internal transcribed spacer)基因区段进行病原菌鉴定、检测及病害诊断技术得到了发展 ,利用病原菌在 r DNA的 ITS区段既具保守性又在科、属、种水平上均有特异性序列的特性 ,对 ITS区进行 PCR扩增、测序及序列分析后再设计特异性引物来诊断和检测植物病原菌 ,尤其是植物病原真菌的分子检测已越来越被广泛应用。